Rekombinant Adeno Associated Virus serotip 3 Vektörler Karaciğer Kanseri Hücreleri Yüksek Verimlilik İletimi

Özet

Bu makalede, insan karaciğer kanser hücrelerini hedef için en verimli bir vektör olarak adeno-ilişkili virüs serotip 3 (AAV3) tanımlanması için.

Özet

Olmayan bir patojen insan parvovirus dayanan rekombinant vektörler, adeno-ilişkili virüs 2 (AAV2) geliştirilen ve gen tedavisi klinik çalışmalarda bir dizi şu anda kullanımda olan olmuştur. Daha yakın zamanlarda, bir dizi ek AAV serotiplerinin ayrıca çeşitli küçük ve büyük hayvan modellerinde ¹ doku tropizm seçici sergilemek edildiği, izole edilmiştir. En sık kullanılan 10 AAV serotipleri, AAV3 gibi in vivo ve in vitro hücre ve dokulara geçirilmesinde kadar en az verimli .

AAV3 bağlama için ortak bir hücresel reseptör olarak insan hepatosit büyüme faktörü reseptörü kullanır, çünkü son derece verimli bir hücre hatları - hepatoblastom (HB) ve hepatoselüler karsinom (HSK) - Ancak, son zamanlarda yayınlanan çalışmalarda, biz AAV3 vektörleri insan karaciğer kanseri transduce belgelediler bu hücrelerin ^2,3 ve giriş.

Bu makalede, biz bir muhabir geni taşıyan rekombinant AAV3 vektörleri insan karaciğer kanser hücrelerini yüksek verimlilik transdüksiyon ulaşmak için gerekli adımları açıklar. Terapötik bir geni taşıyan rekombinant AAV3 vektörlerin kullanımı sonunda, insanlarda karaciğer kanseri potansiyel gen tedavisi neden olabilir.

Protokol

1. Rekombinant adeno-ilişkili virüs serotip 3 (rAAV3) Vektörler Ambalaj

1. Web sitesine gidin: " http://www.geguchadze.com/calc "ve DNA miktarını hesaplamak.
2. Ön-mix FBS ve antibiyotik olmadan orta plazmid pHelper (Adenovirüs yardımcı), pACG2c3 (AAV yardımcı) ve pdsAAV-CB-EGFP (rAAV vektör). Toplam hacmi on 15 cm ² tabak için 8750 mcL olmalıdır.
3. Adım 1.2 DNA çözüm PEI doğrudan mcL 1.250 (% 0.1 m / v, Polysciences, Kedi # 23966, pH = 4.5) ekleyin. Vortex birkaç saniye için DNA-PEI çözüm.
4. 5 dakika oda sıcaklığında (RT) için bir kompleks oluşturacak şekilde inkübe DNA PEI çözüm.
5. DNA PEI çözüm 15 cm ² plaka başına 1 ml ekleyin.
6. Taze 25 ml tam orta yerine, 4 saat sonra orta çıkarın +% 10 FBS (C-DMEM).
7. Yetmiş iki saat sonrası transfeksiyon, kazıma hücreleri ve 250 ml konik santrifüj tüpüne dökün.
8. 3000 rpm'de 4 Spin, ° C 10 dakika. Süpernatant kapalı dökün.
9. Yeniden askıya alma, RB TMS Tampon (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0) 5 ml hücre pelletini. Yeni bir 15 ml konik tüp transfer.
10. 37, 10 dakika ve çözülme için kuru buz-etanol banyo Dondurulmuş ° C 10 dak. Üç kez tekrarlayın.
11. 4.8 M MgCl ₂ 1 mcL ve 2 mcL Benzonase (25 U / ml, Novagen, Kedi # 70.664-3) ekleyin. Vortex ve inkübe 37 ° C de 40 dk.
12. Dakika süreyle 40 ° 4, 4,000 rpm'de C Spin ve süpernatantı toplamak (lizat açıklık).
13. , 2 ml,% 15% 25 2 ml, 1.5 ml% 40 ve bir 13 ml Hızlı-Seal santrifüj tüpüne (Beckman, Kedi # 342.413), yukarıdan aşağıya doğru yük iodixanol degrade (OptiPrep, Kedi # 1.114.542) 1.5 mL% 60 iodixanol. Iodixanol degrade üstüne süpernatant (Adım 1.12) yükleyin. RB TMS Buffer tüpler doldurun.
14. 16 1 saat süreyle 75.000 rpm Santrifüj ° C Beckman 90Ti rotor.
15. % 40 iodixanol fraksiyonu% 40-60 sınırında bir enjektör takarak toplayın.
16. % 40 iodixanol fraksiyonu, biri 50 ml konik tüp transferi ve Tampon ile 40 ml makyaj (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8.5).
17. Filtrasyon aparatı HiTrap S HP kolon (GE Healthcare, Kedi # 17-1154-01) kullanarak birleştirin. Aşağıdaki tamponu ile sütun yıkayın: 25 ml Buffer (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8.5); Tampon B (10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.5) 25 ml, 50 ml Tampon bir; Tampon olarak virüs örnek 40 ml, 50 ml Buffer (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8.5); 20 ml Tampon C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8.5);
18. 20 ml Apollo Konsantratörleri (Orbital Biosciences) Tampon C toplayın. 3.000 rpm'de santrifüj, 4 ° C 10 dk.
19. Flow-through atın ve 4, 3,000 rpm'de 20 ml soğutulmuş PBS ve santrifüj eklemek ° C'de 10 dk.
20. Flow-through atın ve soğutulmuş PBS 500 mcL ekleyin. -80 Küçük alikotları donmuş silikon tedavi Eppendorf tüpleri ve mağaza membran ve transfer ° C vektörleri yıkayın.

2. RAAV3 Vektör titreleri Belirlenmesi

1. Buz üzerinde bir Eppendorf tüp virüs saflaştırılmış 10 mcL çözülme. GKD ₂ O. 40 mcL ekle
2. 0.2 mcL Benzonase (25 U / ml, Novagen, Kedi # 70.664) ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat süreyle.
3. Başka bir Eppendorf tüp plazmid standart (0.2 ng / ml) 50 mcL alın.
4. Her tüp ve 65 ° C'de 30 dakika için 100 mM NaOH 50 mcL ekleyin.
5. Hemen en az 5 dakika buz üzerinde soğutun.
6. Bio-Dot Filtre Kağıdı (Bio-Rad, Kedi # 1.620.161) göre transfer membran (Millipore, Kedi # INYC00010) kesin. 20 dakika için üç filtre kağıtları ile 10x SSC membran durulayın.
7. Yuvası leke SF Apparatus (Bio-Nokta, Kedi # 170-6542) ayarlayın. Bir termos bağlayın ve 10x DGM'nin yuvası leke aparatı 100 mcL ekleyin.
8. Adım 2.5 örneklerinin her 20x SSC 100 mcL ve 6x yükleme boya 1 mcL ekleyin.
9. Membran üzerine yuvası leke aparatı her örneklerinin 100 mcL yükleyin.
10. 10x SSC başka örneklerin her birine 100 mcL ekleyin.
11. 2.9 ve 2.10 adımları örnek zarından girene kadar tekrarlayın.
12. Slot leke aparatı sökün ve membran çıkarın. Müfettiş Linker SL-1000 UV Çapraz içine koyun. "Enerji", "Turn Optimal çapraz bağ" (Show 1200) ve "Başlat" itin.
13. DNA (Fisher, Kedi # NC9753983) 5 dakika boyunca kaynatın 1 somon sperm mL (SS). En az 5 dakika buz üzerinde soğutun.
14. 27.5 ml, 15 ml GKD ₂ O karıştırma öncesi hibridizasyon solüsyonu hazırlayın 20x 50x Denhardt çözümü SSC, 5 ml, 1.25 ml% 20 SDS, Polya 0.25 ml ve 2.13 Adım SS DNA 1 ml.
15. 25 ml, 65 ° C hibridizasyon odasında gece bir kapaklı cam silindir ve inkübe-hibridizasyon öncesi çözüm membran askıya alınması.
16. GKD ₂ O 10 mcL 50 ng DNA şablonları sulandırınız. Kaynatın, 100 ° C en az 5 dakika boyunca buz üzerinde hemen 5 dakika ve soğuk için.
17. 1 dakika 3.000 rpm'de RT santrifüjleyin. 10 mM 3 dNTP 2 mcL (dCTP eksik), (2) Hexanucleotide Mix mcL (Roche, Kedi # 11277081001), 1 mcL Klenow (Roche, Kedi # ^11008404001) ve -32 α P-dCTP 5 mcL ekleyin. 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
18. 2 dakika süreyle 3000 rpm'de G-50 Sütunlar (GE Healthcare, Kedi # 27-5330-01) santrifüjleyin. Adım 2.17 sütuna prob yükleyin. 2 dakika süreyle 3000 rpm'de santrifüj ve flow-through toplamak.
19. Radyoaktivite Kont. Prob için 100 ° C 5 dakika ve soğuk 'hemen buz üzerinde en az 5 dakika kaynatın.
20. Membran ile ön hibridizasyon çözüm prob (6x10 ⁵ kopya / ml) ekleyin.
21. Hibridizasyon odasında 65 ° C'de bir gece inkübe edin.
22. Hibridizasyon çözüm atın ve 15 dakika süreyle RT 2x SSC +0.1% SDS membran durulayın.
23. Çözüm atın ve 30 dakika süreyle 65 ° C 0.1x SSC +0.1% SDS membran durulama.
24. Çözüm atın ve RT kısaca 0.1x SSC membran durulayın.
25. -80 ° C'de 6 saat film film ortaya çıkarmak ve geliştirmek. Tipik bir sonuç Şekil 1'de gösterilmiştir.

3. rAAV3 Vektör aracılı İletimi ve İnsan Karaciğer Kanseri Hücrelerinde Transgen İfade

1. 96 plaka her iyi Tohum 1x10 ⁴ hücreleri (HuH7 veya Hep293TT ya). Nemlendirilmiş bir CO ₂ inkübatör içinde en az 18 saat süreyle inkübe edin.
2. 96-plaka orta çıkarın.
3. FBS ve antibiyotik olmadan orta 50 mcL hücreler iki kez yıkayın ve kaldırmak.
4. Orta 5,000 VGS / hücre FBS ve antibiyotik ve rAAV vektörlerin olmadan 50 mcL ekleyin.
5. CO ₂ inkübatör plakalar 4 saat süreyle inkübe edin.
6. Orta atın. 50 mcL tam orta hücreler iki kez yıkayın ve kaldırmak.
7. C-DMEM her bir kuyunun 150 mcL ekleyin ve 72 saat için CO ₂ inkübatör plaka inkübe ve floresan mikroskop kullanılarak EGFP ifade görselleştirmek (DMİ 4000B; Leica Microsystems).
8. Virüsle enfekte olan hücreleri üç kuyu Görüntüler ImageJ analiz yazılımı (NIH, Bethesda, MD, ABD) tarafından kantitatif analiz edilmektedir.
9. Transgen ifade görme alanı başına düşen yeşil floresan toplam alanı ^{(piksel 2)} olarak değerlendirilir . Tipik bir sonucu, Şekil 2'de gösterilmiştir.
10. Transgen ifade Sitometrisi ile de tespit edilebilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Yukarıda belirtilen protokolün ardından, verimli AAV serotip vektör üretebilirsiniz. Tipik verim ~~ 500 mcL ~ 10 ¹¹ VGS içeren saflaştırılmış vektör stok / mcL. Vektör stokunun saflık ve Benzonase sindirim olmadan, kantitatif DNA yuvası blot hibridizasyon sinyalleri karşılaştırarak tarafından belirlenir. Saf hücre hatları - hepatoblastom (HB) ve hepatosellüler karsinom (HSK) - rAAV3 vektörler transduce insan karaciğer kanseri verimli.

Şekil 1 rAAV3 vektörlerin titreleri belirlemek için nicel DNA slot-blot analizi. Benzonase (üst satır) ile sindirilir viral hisse senetleri, saflaştırılmış iki kat dilüsyonları ³² P-etiketli EGFP-spesifik DNA probu ile kantitatif DNA yuvası leke incelendi. 1 ng (orta sıra) veya 10 ng (alt sıra) membran yüklenen AAV-EGFP plazmid standartları ile karşılaştırıldığında AAV3 vektör titresi tespit edildi. Numaraları DNA kopyası karşılık.

Şekil 2 Rekombinant AAV insan karaciğer kanser hücrelerini vektör aracılı transgen ifadesi. Hep293TT hücreleri, kısa bir süre önce kurulan insan hepatoblastom hücre hattında ^4, ya sahte enfekte (sol panel), ya da 2 saat boyunca 37 ° C'de scAAV2-EGFP veya scAAV3 EGFP vektörler 5000 VGS / hücre transduced . Transgen ekspresyonu 72 saat sonrası transdüksiyon floresan mikroskop kullanılarak görüntülendi.

Tartışmalar

Patojen olmayan bir insan parvovirus, adeno-ilişkili virüs (AAV) dayanan rekombinant vektörler geliştirilen ve şu anda bir dizi gen tedavisi klinik ^{çalışmalarda} 5 edilmiştir . Önceleri en yaygın olarak kullanılan 10 AAV serotipleri, genel olarak AAV3 vektörlerin transdüksiyon etkinliğini in vitro ve in vivo ¹ hem de, özellikle düşük olduğu bildirilmiştir. Ancak, son gözlem AAV3 flow sitometri ² ile kantitatif tespit son derece iyi vektörler transduce insan karaciğer kanser hücresi hatlarında, ve bu AAV3 bu bağlayıcı ve giriş için ortak bir hücresel reseptör olarak insan hepatosit büyüme faktörü reseptörü (hHGFR) kullanır hücreleri ^3, özellikle de güçlü AAV3 genel olarak insan karaciğer hücreleri için selektif doku-tropizm ve insan karaciğer kanseri hücrelerinin öneririz. Ancak, AAV3 vektörler aynı zamanda normal insan hepatositleri ^verimli 2 transduce, in vivo kanser gen tedavisi uygulama potansiyellerini kullanabilecekleri olumsuz etkiledi olacaktır . Bu olası sorunu aşmak için olası bir strateji gerektirir transkripsiyonel hedef normal hepatositler tarafından değil seçici olarak tümör tarafından üretilen bir gen ürünü tespit ederek, kanser hücrelerinin, ancak. Örneğin, normal hepatositler genellikle çok küçük miktarlarda üretmek önceki çalışmalarda, belirli bir varlığı, ilerleme, ve / veya karaciğer kanserlerinin bazı türleri tekrarını izlemek için işaretleyici olarak kullanılan serum α-fetoprotein (AFP) düzeyleri olduğunu göstermiştir bu proteinin. Nitekim, biz, karaciğer kanser hücrelerini transgen ifade hedef AFP organizatörü içeren AAV3 vektörler kullandık, ama şu anda ^normal hepatositler 2 ve çalışmalar karaciğer kanseri bir fare xenograft modeli bu yaklaşımın etkinliğini test etmek için çalışmalar devam etmektedir. Ek çalışmalar, ^6-14 viral capsids yüzey maruz tirozin kalıntılarının site-directed mutagenesis çeşitli AAV serotip vektörler transdüksiyon etkinliğini önemli ölçüde artar olabileceğini gözlemledim . 6 7 yüzey maruz tyrosines AAV3 korunmuş olduğundan, biz bu kalıntıların site-directed mutagenesis ve tirozin-mutant AAV3 vektörlerin transdüksiyon etkinliğini önemli ölçüde insan karaciğer kanseri hücrelerinin (yayınlanmamış veri) gelişmiş olduğu görülmektedir. Araştırmalar aynı zamanda, insan hepatoblastom ve hepatosellüler karsinom için fare xenograft modelleri tirozin-mutant AAV3 vektörler güvenlik ve etkinliğini değerlendirmek için şu anda devam etmekte olup, başarılı olursa, optimal tirozin-mutant AAV3 serotip vektörleri insan karaciğer hedeflemesi için yararlı olduğu ortaya çıkabilir potansiyel gen tedavisi için kanserleri.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Cellgro	10-0170CM
PEI	Polysciences, Inc.	23966
Benzonase	Novagen, EMD Millipore	70664-3
HiTrap Q HP column	GE Healthcare	17-1154-01
Salmon sperm DNA	Fisher Scientific	NC9753983
Iodixanol gradient	OptiPrep	1114542
G-50 Columns	GE Healthcare	27-5330-01