Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma

Özet

Biz anestezi farelerin trakea yoluyla ciğerlerine test malzemelerin cerrahi olmayan teslimat göstermektedir. Bu yöntem, bakteriyel ve viral patojenler, sitokinler, antikorlar, boncuk, kimyasallar, ya da boyalar akciğer maruz izin verir. Daha hasat ve flow sitometri akciğer ve akciğer drenaj lenf düğümleri (LDLNs) işlenmesi açıklanmaktadır.

Özet

, Alveoler makrofaj ve akciğer dendritik hücreler (LDC) olarak fagositik hücrelerin sürekli olarak akciğerlerde alveoler boşluklar antijenleri örnek. En az gelişmiş ülkelere, özellikle de akciğer drenaj lenf düğümleri (LDLNs) T hücreleri başlatılması için uygun bir immün yanıt immünojenleri ^1,2 çeşitli inhale antijenlere mevcut. Göç etmek bilinmektedir Farelerde akciğer ve havadaki antijenleri arasındaki etkileşimler modeli, antijenler intratrakeal ⁵ veya aerosoller ⁶ olarak, intranazal ^1,3,4 idare edilebilir. Her güzergah tarafından teslim ayrı teknik beceri ve bir deney tasarımı önce dikkate alınması gereken kısıtlamalar içerir. Örneğin akciğerlerin ve üst solunum yolu, burun içi ve aerosol maruz antijenleri sağlar. Dolayısıyla antijenler potansiyel sonuçların yorumlanması komplike, burun ilişkili lenfoid doku (NALT) ⁷ erişebilirsiniz. Buna ek olarak, yutkunma, hapşırma ve farenin solunum oranı da teslim edilen dozlar tutarsızlıklara yol açabilir. Üst solunum yolu tutulumu bazı çalışmalar için tercih edilebilir olsa da, özellikle akciğerlerde başlatılan olaylara odaklanan deneyler karmaşık hale getirebilir. Bu ortamda, doğrudan ciğerlerine test materyalleri sunar ve NALT atlar intratrakeal () yol tercih edilir. Birçok bu enjeksiyon protokolleri oral kavite veya akciğerlere erişmek için trakea cerrahi maruz kalma yoluyla trakea ya kör entübasyon içerir. Burada, biz bu instilasyon için basit, tutarlı, cerrahi olmayan bir yöntem açıklanmaktadır. Trakeanın açılması bir laringoskop kullanılarak görüntülendi ve kıvrık bir sonda iğne sonra innoculum teslim trakea doğrudan eklenir. Ayrıca, hasat ve LDLNs ve akciğerler, flow sitometri ile antijen ticareti analiz için işlenmesi için prosedürler açıklanmaktadır.

Protokol

1. Işleminden önce, hazırlamak ve aşağıdaki öğeleri toplamak

1. Lütfen işlem sırasında fare dizginlemek için tahta bir platform oluşturmak için) Şekil 1a resme bakın) ve 1b.
2. Sindirim karışımı HBSS + 1.25mg/ml kollajenaz TypeIV veya 2.5 mg / ml kollajenaz D - lenf düğümleri
3. Akciğerler için Sindirim karışımı - HBSS + 1 mg / ml kollajenaz
4. LDLNs görselleştirmek için intraperitoneal PBS lateks boncuk (1:20) sulandırınız

Not: LDLNs bulmak için küçük ve sert. Onları bulmak için öğrenmek için, fare içine kırmızı floresan lateks boncuk ip seyreltilmiş 01:20 200μl enjekte edilir. Periton bu LDLNs ⁸ akıtır. 24 HPI, yukarıda anlatıldığı gibi fare torasik kavite maruz kalmaktadır. LDLNs periton boşluğuna drene boncuk pembe görünür.

5. Kırmızı Kan Hücresi (RBC) Lizis Tampon - 0.15m NH ₄ Cl, 10mM KHCO _3, 1L dH ₂ 0 0.1 mM Na ₂ EDTA. 7,2-7,4 pH ayarlama ve oda sıcaklığında saklayın.
6. 100μm 70μm veya hücre süzgecinden
7. Stok çözelti 0,5 M EDTA, pH = 8.0
8. CaCl ₂ ve MgCl ₂ olmadan HBSS
9. Makas ve künt uçlu forseps
10. Larengoskop
11. Gavaj iğne (22 gauge) bir açıyla bükülmüş (Şekil 2)
12. Strafor yönetim kurulu ve fare yaymak için pimleri
13. En pan dengesi
14. Anilin Mavi Çözüm - H ₂ O 10mg/ml

Not: Biz bu enjeksiyon tekniği, bu gösteri için çözümünü kullanıyor olacak.

2. Fare anestezi hazırlanması ve yönetimi

1. Son konsantrasyonları sırasıyla 2mg/ml ve 10mg/ml böylece steril PBS Xylazine ve Ketamin bir karışım hazırlayın.
2. En pan dengesi üzerinde fare tartılır.
3. Her fare için gerekli doz hesaplayın. Hazırlanan karışım uygun hacim kullanarak Xylazine (2-4 mg / kg) ve Ketamin (70-80 mg / kg) vücut ağırlığı dozu ve intaperitoneally enjekte. Her fare suşu anestezik optimizasyonu gerekebilir. Çok anestezi alan Fare inokulum Ciğerlere aşılandığı sonra ölümcül olabilir düşük bir solunum hızı olabilir.
4. 3-5 dakika sonra, anestezik etkileri için fare gözlemliyoruz. Fare tam anestezi olduğunu onaylamak için aşağıdaki belirtiler olup olmadığını kontrol edin:
   1. Solunum hızını yavaşlatmak gerekir.
   2. Boyun tarafından yakalandı fare kol germek gerekir.
   3. Arka bacaklarda uyarılır herhangi bir yanıt olmamalıdır.
      Bu kriterleri yerine getirilmemesi halinde, birkaç dakika bekleyin ve bir sonraki adıma geçmeden önce tekrar kontrol edin.

3. Intratrakeal enjeksiyon

1. Innoculum 50μl tuzlu su hazırlayın. Innoculum, steril bir bükülmüş gavaj iğne ile donatılmış bir 1ml şırınga doldurun. Şırınga sıvı akciğer aşılamış olduğu sağlamak için, innoculum arkasında bir 100μl hava cepli yüklenmiş olması gerekir.
2. Fare, tel üzerinde kesici dişler tarafından asılı açılı bir tahta platform üzerinde yerleştirin ve yavaşça kurdelenin bir parçasını bir yere dizginlemek.
3. Laringoskop sol elinizle açın (sağ elle) ve künt uçlu forseps, bir çift kapmak. Laringoskop ucu ve forseps, ağzı hafifçe açık gözetlemek için kullanın.
4. Forseps, dil çekin ve yan tutun. Ağız arkasına doğru laringoskop bıçak Kılavuzu. Laringoskop trakeanın açılması görene kadar 90 ° açıyla çok hafifçe basılı tutun. Laringoskop bir yerde tutun. Ağzından dil çekerek, herhangi bir doku zedelenmelerinde oluşur bu nedenle bu nazikçe yapılmalıdır zaman dikkat edilmelidir.
5. Iğne bend ön kesici dişler kadar diğer elinizle, sağ elleri ile bükülmüş gavaj iğne ile donatılmış innoculum içeren 1 ml şırınga, iğne ve trakea içine eklemek. Innoculum sunmak için eşit pistonu itin. Innoculum kabarcık olmamalı. Mümkün olan en kısa sürede iğne trakea dışarı çekin. Fare boğmak ve trakea, çok uzun süre bloke ise ölecektir. Innoculum Ciğerlere inhale izin vermek için birkaç saniye için fareyi dik tutun.
6. Platformun fare çıkarın ve bir ısıtma lambası yakın yerleştirin. Doğrudan ısı altında uzun süre farelere bırakmayın. Fare prosedürü (suşları dayalı iyileşme süresi değişebilir) sonra 30 dakika içinde tamamen uyanık olmalıdır. Fareler bu süre içinde özenle gözlenen ve çok sıcak veya çok soğuk almak için izin verilmemeli, bu da ölüme yol açan solunum sıkıntısı içine fareler koyabilirsiniz.

4. Hasat ve işleme flow sitometri Akciğer drenaj lenf düğümleri ve akciğerler

1. AVMA ötenazi yönergelerine göre istediğiniz yöntemi kullanarak fareleri Kurban. Bu bireysel hasat sonuçları bağlı olarak değişebilir. Pentobarbital sodyum ölümcül bir İdaresi uygun bir ötenazi yöntemi bir örnektir. Biz CO ₂ ötenazi negatif akciğer etkileri görmedim.
2. Diseksiyonu kurulu kollar ve bacaklar Pin. Makas ile ventral tarafında ortasında boyunca bir kesi olun. Cildi nazikçe çekin ve göğüs duvarındaki kasların maruz.
3. Torasik duvarı kasları ile karın içi organların maruz kesiler olun.
4. Forseps ve delinme diyafram ile sternum ucu tutun. Göğüs kafesinin iki yanında diyafram kesin.
5. Diseksiyon levha yüzeyine paralel makas, her iki tarafta dorso-ventral hattı boyunca göğüs boşluğu kesti.
6. Göğüs kafesinin hafifçe yukarı kaldırın. Timus altında, sadece, kalbin sağ tarafında iki lenf düğümleri için bakın. Biraz daha büyük üçüncü lenf nodu trakea dik çalışan küçük bir arteryel kan damarı altında yer almaktadır. Hasat lenf düğümleri, lenf nodu sindirim karışımı içine 1 ml.
7. Lenf düğümleri hasat sonra, forseps bir çift kalp tutun ve başka bir ile akciğerlere kapmak. 6 plaka buz PBS 3ml içine Hasat akciğerler.
8. , Akciğer lobları ayrı bir PBS aspirat ve loblar forseps ve makas kullanarak küçük parçalar halinde doğrayın. 3ml akciğerler için sindirim karışımı ekleyin. Bu adım sırasında buz üzerinde 6 plaka tutun.
9. 37 at, 30 dk 25-30 dk ve akciğerler, lenf düğümleri inkübe ° C. Buz üzerinde reaksiyon ve durdurmak için sindirim karışımların her 10mM nihai konsantrasyonu EDTA ekleyin.
10. 3ml bir şırınga kullanarak, bir 18GA iğne yoluyla akciğerlere parçaları 3 kez geçmek. Mash bir 1ml şırınga pistonu arka uç kullanarak 70-100μm hücre süzgeçler ile akciğerler ve LN parçaları. HBSS, 10ml hücre süzgeçler yıkayın olmadan Ca ^{2 +} ve Mg ^{2 +.} 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüjleyin.
11. 5 ml eritrosit lizis tamponu pelletini tekrar ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. Ca ² olmadan HBSS, 10ml ⁺ ve Mg ^{2 +} lizis gidermek için. 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüjleyin. Sırasıyla akciğer ve LDLN tek hücre süspansiyonları 10ml ve 5ml kadar getirin. Trypan mavisiyle boyama canlı hücreler kullanarak bir hemasitometre güvenin. Hücreler flow sitometri leke hazır. 1 akciğer lob flow sitometri için yeterli olabilir. Diğer loblar histoloji için sitokinler veya doku için homojenatlarında gibi aynı fare içindeki diğer deneysel sorular için kullanılabilir.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Hemen enjeksiyonu takiben akciğerlerde en az gelişmiş ülkeler ve alveoler makrofaj akciğerlerde alveolar alanlarda antijen elde. Şekil 3 CD11c + (en az gelişmiş ülkelere ve alveoler makrofajlar ifade) yüzdesi floresan etiketli Bacillus anthracis sporları için pozitif hücreler, 30 dakika yazılan bu enjeksiyon gösterir. Bu zamanda, akciğer tek hücre süspansiyonu CD45 + CD11c + hücreler ~% 15.9, Bacillus anthracis sporları (Şekil 3, alt paneller) barındırmaktaydı . Akciğerlerde CD11c + hücreler daha fazla karakterizasyonu için, Kim ve Braciale ⁴ bakın. Floresan ile işaretlenmiş boncuk rutin LDLNs ⁹ partikül antijenlerin kaçakçılığı değerlendirmek için kullanılır. Akciğerlerden LDLNs taşıma değerlendirmek için, floresan lateks boncuk LPS ve LDLNs 24 HPI incelendi ile enjekte edildi. LDLNs CD11c ^hi hücrelerin yaklaşık% 4 24hpi (Şekil 4) floresan boncuk barındırmaktaydı. Bu temsilcisi deneyler, bu protokol verimli LDLNs akciğerler ve bunları daha sonra trafik inhale partikül antijenleri elde hücreleri izlemek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir.

Şekil 1. ) Bu enjeksiyon sırasında fareler frenleyici Ahşap platform tahta blok bir açıyla kesilmiş ve metal çubuklar, önden görünüm Şekil 1a'da takıldı) ve yan görünüm rakam 1b. Küçük bir tel parçası fare ön kesici dişler demirlemek için metal çubuğun etrafına sarılmış. Bir parça şerit, işlem sırasında bir yerde tutmak için fareyi etrafında kravat platforma bağlanmıştır.

Şekil 2. Bu enjeksiyon için sonda iğne sonda bir iğne (sağ) bu enjeksiyon için ~ 135 ° (sol) bir açıyla bükülmüş.

Şekil 3. Bacillus anthracis ifade enjekte GFP (Sterne-p6GFP), 5 saate yazılan meydan liman akciğerlerde CD11c + hücrelerinin yüzdesi. AJ fareler 1x ile mücadele5 saate yazılan enfeksiyonu 10 ⁸ GFP-Bacillus anthracis sporları ve akciğerler incelendi. Nokta araziler CD11c'nin yüzdesi + Bacillus anthracis için pozitif olan akciğer hücreleri.

Şekil 4. I. T enjeksiyonu takiben 24 saat drenaj lenf düğümleri, akciğer, floresan boncuk Algılama (sarı / yeşil) . AJ fareler ve LDLNs 24hpi incelendi 10μg LPS (sağ panel) ile PBS (sol panel) veya 5x10 ⁹ Fluoresbrite YG Mikroküreler (0.5μm) ya verildi. Temsilcisi nokta araziler, liman floresan boncuklar boş bir kanal karşı çizilen LDLNs ^CD11c hi hücrelerinin yüzdesini gösteriyor .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bacillus anthracis sporları akciğerlerden LDLNs ticareti incelemek için bu protokol kullanılmaktadır. Benzer uygulamalar için, akciğerlere teslim parçacıkların sayısını dikkatli bir şekilde enjekte edilen malzeme akış sitometri LDLNs tespit edilebilir, böylece seçilmiş olmalıdır. Biz de başarıyla hücreleri ve floresan etiketli antikorlar kullanarak belirli bir akciğer hücre popülasyonlarının etiketleme evlatlık transferi için bu yöntemi kullanmıştır. Ayrıca, bu yöntem rutin ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
70μm Hücre stariner	BD
Anilin Mavi	Balıkçı	A967-25
Hayvan Besleme iğne	Popper ve Sons Inc.	7920
Kollajenaz	Sigma	C2139
Kollajenaz TypeIV	Worthington
Kollajenaz D	Roche	11088974103
DPBS	Invitrogen	14190
Fluoresbrite YG Mikroküreler (0.5μm)	Polysciences, Inc	17152
Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür olmadan HBSS	Invitrogen	14170
Ketamin HCl (100mg/ml)	Hospira Inc.
Laringoskop Blade	PennCentury, Inc.	Model LS-1 için	Bakın www.penncentury.com
Hafif Fiber Optik Laringoskop	WelchAllyn	80814
Kırmızı Floresan Boncuk (0.5μm)	Invitrogen	F8812	Ip enjeksiyon için
Xylazine (100mg/ml)	Lloyd Laboratuvarları