Non-chirurgicale instillation intratrachéale de souris avec analyse des poumons et les ganglions lymphatiques drainant poumon par cytométrie en flux

Résumé

Nous illustrons non-chirurgical de livraison du matériel de test dans les poumons des souris anesthésiées par la trachée. Cette méthode permet l'exposition des poumons à des agents pathogènes bactériens et viraux, les cytokines, des anticorps, des perles, des produits chimiques, ou des colorants. En outre, nous décrivent la récolte et la transformation des poumons et les ganglions lymphatiques drainant pulmonaires (LDLNs) pour la cytométrie de flux.

Résumé

Les cellules phagocytaires telles que les macrophages alvéolaires et les cellules dendritiques pulmonaires (PMA) en continu de l'échantillon les antigènes des espaces alvéolaires dans les poumons. PMA, en particulier, sont connus pour migrer vers les ganglions lymphatiques drainant pulmonaires (LDLNs) où ils présentent les antigènes aux cellules T inhalé initier une réponse immunitaire appropriée à une variété d'immunogènes ^1,2. Pour le modèle des interactions entre les poumons et les antigènes en suspension dans les souris, les antigènes peuvent être administrés par voie intranasale ^1,3,4, intratrachéale ⁵ ou ⁶ sous forme d'aérosols. Livraison par chaque itinéraire implique distinctes des compétences techniques et des limitations qui doivent être considérés avant de concevoir une expérience. Par exemple, l'exposition intranasale et sous forme d'aérosol fournit des antigènes à la fois dans les poumons et les voies respiratoires supérieures. Ainsi antigènes peuvent accéder le tissu lymphoïde associé nasales (NALT) ^7, potentiellement compliquer l'interprétation des résultats. En outre, la déglutition, l'éternuement et la fréquence respiratoire de la souris peut aussi conduire à des incohérences dans les doses délivrées. Bien que l'implication des voies respiratoires supérieures peut être préférable pour certaines études, cela peut compliquer les expériences portant sur des événements spécifiquement initiée dans les poumons. Dans ce cadre, le intratrachéale (it) la route est préférable car elle offre le matériel de test directement dans les poumons et contourne le NALT. De nombreux protocoles d'injection l'impliquer intubation soit aveugles de la trachée à travers la cavité buccale ou de l'exposition chirurgicale de la trachée d'accéder à des poumons. Nous décrivons ici un simple, cohérente et non-chirurgical méthode pour qu'il l'instillation. L'ouverture de la trachée est visualisée à l'aide d'un laryngoscope et une aiguille tordue gavage est ensuite inséré directement dans la trachée pour livrer l'inoculum. Nous avons également décrire les procédures de récolte et de transformation des LDLNs et des poumons pour l'analyse du trafic de l'antigène par cytométrie en flux.

Protocole

1. Avant le processus, de préparer et de rassembler les éléments suivants

1. S'il vous plaît se référer à l'image de la figure 1a) et 1b) pour la construction d'une plateforme en bois pour retenir la souris durant la procédure.
2. Mélange de digestion des ganglions lymphatiques - HBSS + 1.25mg/ml collagénase TypeIV ou 2,5 mg / ml de collagénase D
3. Mélange de digestion des poumons - HBSS + 1 mg / ml de collagénase
4. Diluer billes de latex (1:20) dans du PBS pour l'injection intrapéritonéale de visualiser les LDLNs

Remarque: LDLNs sont petites et difficiles à trouver. Pour savoir comment les trouver, d'injecter 200 pl de la dilution 1:20 rouges billes de latex fluorescentes ip dans la souris. Le péritoine drains à ces LDLNs ^8. 24 hpi, exposer la cavité thoracique de la souris comme décrit ci-dessus. Le LDLNs sera de couleur rose à partir des billes qui a drainé de la cavité péritonéale.

5. Globules rouges (RBC) Lysis Buffer - 0,15 M NH ₄ Cl, 10 mM _de KHCO3, 0,1 mM Na ₂ EDTA dans 1L dH ₂ 0. Ajuster le pH à 7.2 à 7.4 et stocker à température ambiante.
6. Tamis cellulaire 70μm ou 100 microns
7. Solution mère d'EDTA 0,5 M, pH = 8,0
8. HBSS sans CaCl ₂ et MgCl ₂
9. Ciseaux et pinces à bouts francs
10. Laryngoscope
11. Gavage aiguille (calibre 22) pliés à un angle (figure 2)
12. Styromousse bord et broches pour la diffusion de la souris
13. L'équilibre pan Haut
14. Bleu d'aniline Solution - 10mg/ml dans H ₂ O

Remarque: Nous allons utiliser cette solution pour la démonstration de la technique d'injection elle.

2. Préparation et administration de la souris anesthésie

1. Préparer un mélange de xylazine et de kétamine dans du PBS stérile afin que les concentrations finales sont 2mg/ml et 10mg/ml respectivement.
2. Peser la souris sur une balance à plateau supérieur.
3. Calculer la dose requise pour chaque souris. Dose au xylazine (2-4 mg / kg) et la kétamine (70-80 mg / kg) le poids du corps en utilisant un volume approprié du mélange préparé et injecter intaperitoneally. Chaque souche de souris peut nécessiter l'optimisation de l'anesthésie. Les souris ayant reçu trop d'anesthésie peut avoir un taux de respiration réduite qui pourrait être fatale après l'inoculum est instillée dans les poumons.
4. Après 3-5 minutes, observer la souris pour les effets de l'anesthésie. Vérifiez les signes suivants afin de confirmer que la souris est totalement anesthésié:
   1. Le taux de respiration devrait ralentir.
   2. La souris ne doit pas étirer son bras quand ramassé par le cou.
   3. Il ne devrait pas y avoir de réponse lorsque les membres postérieurs sont stimulés.
      Si ces critères ne sont pas remplies, attendez quelques minutes et vérifier de nouveau avant de procéder à l'étape suivante.

3. Injection intratrachéale

1. Préparer l'inoculum dans une solution saline 50 pl. Remplir une seringue 1ml munie d'une aiguille stérile de gavage plié avec l'inoculum. La seringue doit être chargé avec une poche d'air derrière le 100 ul d'inoculum pour s'assurer que l'ensemble du fluide est instillée dans le poumon.
2. Placez la souris sur la plate-forme inclinée bois suspendue par ses incisives sur le fil et freiner doucement en place avec un morceau de ruban.
3. Allumez le laryngoscope avec votre main gauche (si vous êtes droitier) et de saisir une paire de pince émoussée terminée. Utilisez la pointe du laryngoscope et la pince pour détacher délicatement la bouche ouverte.
4. Avec la pince, tirez la langue dehors et maintenez-le sur le côté. Guide de la lame de laryngoscope vers l'arrière de la bouche. Gardez le laryngoscope enfoncée très doucement dans un angle de 90 ° jusqu'à ce que vous voyez à l'ouverture de la trachée. Tenez le laryngoscope en place. Des précautions doivent être prises lorsque vous tirez la langue de la bouche et cela doit être fait avec précaution afin de ne survient des dommages tissulaires.
5. Avec votre autre main, prenez la seringue 1ml contenant l'inoculum, équipé de l'aiguille plié gavage avec votre main droite et insérer l'aiguille dans la trachée jusqu'à ce que le coude de l'aiguille est par les incisives. Poussez le piston pour offrir équitablement l'inoculum. L'inoculum doit pas bulle. Retirez l'aiguille de la trachée dès que possible. Souris suffoquent et meurent si la trachée est bloquée depuis trop longtemps. Tenir la souris verticale pendant quelques secondes afin de permettre inoculum pour être inhalées dans les poumons.
6. Prenez la souris hors de la plate-forme et le placer près d'une lampe chauffante. Ne laissez pas les souris sous la chaleur directe pour des périodes de temps prolongées. La souris devrait être pleinement éveillé dans les 30 min après la procédure (temps de récupération peut varier en fonction des souches). Les souris doivent être observées avec diligence pendant ce temps et ne devraient pas être autorisés à avoir trop chaud ou trop froid, cela pourrait aussi mettre la souris dans une détresse respiratoire conduisant à la mort.

4. Récolte et transformation des noeuds lymphatiques drainant du poumon et des poumons pour la cytométrie en flux

1. Sacrifice des souris en utilisant la méthode souhaitée selon les lignes directrices d'euthanasie AVMA. Cela peut varier selon les résultats de récolte individuelles. L'administration d'une mortelle de pentobarbital de sodium ne soit un exemple d'une procédure d'euthanasie appropriées. Nous n'avons pas vu les effets négatifs pulmonaires de l'euthanasie par le CO _2.
2. Epingler les bras et les jambes sur une planche à dissection. Faire une incision le long du milieu de la face ventrale avec des ciseaux. Tirez doucement sur la peau et exposer les muscles de la paroi thoracique.
3. Faire des incisions à travers les muscles de la paroi thoracique afin d'exposer les organes abdominaux.
4. Tenir la pointe du sternum à la pince et la ponction de la membrane. Couper la membrane le long des côtés de la cage thoracique.
5. Avec les ciseaux parallèles à la surface du panneau de dissection, couper à travers la cavité thoracique long de la ligne dorso-ventrale des deux côtés.
6. Soulevez légèrement la cage thoracique en place. Sur le côté droit du cœur, juste en dessous du thymus, la recherche de deux ganglions lymphatiques. Un ganglion lymphatique légèrement plus grand tiers sont situées au-dessous d'un vaisseau sanguin artériel petite perpendiculaire à la trachée. Récolte des ganglions lymphatiques dans 1 ml de mélange de la digestion des ganglions lymphatiques.
7. Après la récolte des ganglions lymphatiques, maintenez le cœur avec une paire de pinces et de saisir les poumons avec un autre. Poumons récolte dans 3ml de PBS glacé dans une plaque à 6 puits.
8. Séparer les lobes des poumons, aspirer PBS et hachez les lobes en petits morceaux à l'aide de pinces et ciseaux. Ajouter 3 ml du mélange de digestion pour les poumons. Conservez la plaque de 6 puits sur la glace pendant cette étape.
9. Incuber les ganglions lymphatiques pendant 25-30 minutes et les poumons pendant 30 min à 37 ° C. Ajouter EDTA à une concentration finale de 10 mM de chacun des mélanges de digestion pour arrêter la réaction et la placer sur la glace.
10. En utilisant une seringue de 3 ml, passer des morceaux de poumons à travers une aiguille de 18GA 3 fois. Écraser les morceaux de poumons et les ganglions travers les tamis cellulaire de 70 100 microns en utilisant l'extrémité arrière d'un piston de la seringue 1ml. Lavez les crépines cellule avec 10ml de HBSS sans Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +.} Centrifuger à 500 xg pendant 5 min.
11. Reprendre le culot dans 5 ml de tampon de lyse RBC et incuber pendant 3 min à température ambiante. Ajouter 10 ml de HBSS sans Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +} pour étancher la lyse. Centrifuger à 500 xg pendant 5 min. Amener les poumons et les suspensions LDLN seule cellule à 10ml et 5ml respectivement. Nombre des cellules vivantes en utilisant un hématimètre par exclusion du bleu trypan. Les cellules sont maintenant prêts à tacher la cytométrie en flux. 1 lobe du poumon pourrait être suffisant pour la cytométrie de flux. Autres lobes peut être utilisé pour d'autres questions expérimentales au sein de la même souris comme les broyats de cytokines ou de tissus pour l'histologie.

5. Les résultats représentatifs:

PMA et les macrophages alvéolaires dans les poumons d'acquérir de l'antigène espaces alvéolaires des poumons qui la suit immédiatement l'injection. La figure 3 montre le pourcentage de CD11c + (exprimé sur les PMA et les macrophages alvéolaires), les cellules qui sont positifs pour marqué par fluorescence des spores de Bacillus anthracis, 30 min après l'injection. A cette époque, ~ 15,9% de CD45 + CD11c + cellules dans la suspension cellulaire seul poumon abrité les spores de Bacillus anthracis (figure 3, panneaux inférieurs). Pour une caractérisation plus poussée de cellules CD11c + dans les poumons, se référer à Kim et Braciale ^4. Perles marqués par fluorescence sont couramment utilisés pour évaluer le trafic des antigènes particulaires au LDLNs ^9. Pour évaluer ce type de transport à partir de poumons d'LDLNs, des billes de latex fluorescentes ont été l'injection de LPS et de LDLNs ont été analysés à 24 hpi. Environ 4% des cellules CD11c ^Salut dans le LDLNs hébergé perles fluorescentes au 24hpi (figure 4). Ces expériences montrent que représentant de ce protocole peut être utilisé efficacement pour suivre les cellules qui acquièrent des antigènes particulaires inhalées dans les poumons et les a ensuite le trafic vers le LDLNs.

Figure 1. Plateforme en bois pour retenir souris pendant qu'elle injection. Un bloc de bois a été coupé à un angle et des barres de métal ont été équipés, vue de face Figure 1a) et la figure 1b vue de côté). Un petit morceau de fil a été enroulé autour de la barre de métal pour ancrer les incisives de la souris. Un morceau de ruban a été attachée à la plate-forme à nouer autour de la souris pour le maintenir en place pendant la procédure.

Figure 2. Gavage aiguilles d'injection pour elle. Une aiguille de gavage (à droite) a été pliés à un angle de ~ 135 ° (à gauche) pour qu'il l'injection.

Figure 3. Pourcentage de toutes les cellules CD11c + dans les poumons qui abritent l'GFP injectées exprimer Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), défi après 5h. AJ souris ont été défi avec 1x10 ⁸ spores de Bacillus anthracis GFP et les poumons ont été analysés à 5h après l'infection. Les parcelles de points montrent le pourcentage de CD11c + cellules pulmonaires qui sont positifs pour le Bacillus anthracis.

Figure 4. Détection des billes fluorescentes (jaune / vert) dans les poumons des ganglions lymphatiques drainant les 24 heures suivant i. Injection de t. AJ souris ont reçu soit du PBS (panneau de gauche) ou 5x10 ⁹ Fluoresbrite YG microsphères (0.5μm) avec 10 pg de LPS (panneau de droite) elle et LDLNs ont été analysés 24hpi. Représentant parcelles points montrent le pourcentage de cellules ^Salut CD11c dans l'LDLNs que les perles fluorescentes comploté contre le port d'un canal vide.

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Discussion

Nous avons utilisé ce protocole pour étudier le trafic de spores de Bacillus anthracis à partir des poumons vers le LDLNs. Pour des applications similaires, le nombre de particules délivré aux poumons doivent être soigneusement choisis de sorte que le matériau injecté peut être détecté dans le LDLNs par cytométrie en flux. Nous avons également utilisé avec succès cette méthode pour le transfert adoptif de cellules et d'étiquetage des populations spécifiques de cellules pulmonaires en utili...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Stariner cellulaire 70μm	BD
Bleu d'aniline	Fisher	A967-25
L'aiguille d'alimentation animale	Popper et Fils Inc	7920
Collagénase	Sigma	C2139
Collagénase TypeIV	Worthington
Collagénase D	Roche	11088974103
DPBS	Invitrogen	14190
Fluoresbrite YG microsphères (0.5μm)	Polysciences, Inc	17152
HBSS sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium	Invitrogen	14170
La kétamine HCl (100mg/ml)	Hospira Inc
Lame de laryngoscope	PennCentury, Inc	Pour le modèle LS-1	Reportez-vous à www.penncentury.com
Léger laryngoscope à fibre optique	WelchAllyn	80814
Rouge perles fluorescentes (0.5μm)	Invitrogen	F8812	Pour une injection ip
Xylazine (100mg/ml)	Laboratoires Lloyd