Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Riepilogo

Illustriamo non chirurgica consegna dei materiali di prova nei polmoni di topi anestetizzati attraverso la trachea. Questo metodo permette l'esposizione dei polmoni a patogeni batterici e virali, citochine, anticorpi, perline, prodotti chimici o coloranti. Approfondiremo la raccolta ed elaborazione dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante (LDLNs) per la citometria a flusso.

Abstract

Fagociti come i macrofagi alveolari e le cellule dendritiche del polmone (PMA) in continuo campione antigeni dagli spazi alveolari dei polmoni. PMA, in particolare, sono noti a migrare verso i nodi polmone drenaggio linfatico (LDLNs) dove sono presenti gli antigeni inalati alle cellule T di avviare un'adeguata risposta immunitaria a una varietà di immunogeni ^1,2. Alle interazioni modello tra i polmoni e gli antigeni aeree nei topi, gli antigeni può essere somministrato per via intranasale ^1,3,4, intratracheally ⁵ o sotto forma di aerosol ^6. Consegna da ogni tracciato prevede distinte competenze tecniche e limitazioni che devono essere considerati prima di progettare un esperimento. Per esempio, l'esposizione intranasale e aerosol antigeni offre ad entrambi i polmoni e il tratto respiratorio superiore. Quindi antigeni possono accedere al tessuto linfoide associato nasale (NALT) ^7, potenzialmente complicare l'interpretazione dei risultati. Inoltre, la deglutizione, lo starnuto e la frequenza respiratoria del mouse può anche portare a incongruenze nelle dosi consegnate. Anche se il coinvolgimento del tratto respiratorio superiore può essere preferito per alcuni studi, può complicare esperimenti concentrandosi sugli eventi specificamente avviata nei polmoni. In questa impostazione, il intratracheale (it) percorso è preferibile in quanto offre materiali di prova direttamente nei polmoni e ignora il NALT. Molti protocolli di iniezione coinvolgere l'intubazione sia cieco della trachea attraverso la cavità orale o esposizione chirurgica della trachea per accedere ai polmoni. Qui, descriviamo un semplice, coerente, metodo non chirurgico per esso l'instillazione. L'apertura della trachea è visualizzata utilizzando un laringoscopio e un ago piegato sonda viene quindi inserito direttamente nella trachea di consegnare il innoculum. Abbiamo anche descrivere le procedure per la raccolta ed elaborazione dei LDLNs e polmoni per l'analisi del traffico di antigeni in citometria a flusso.

Protocollo

1. Prima del processo, preparare e raccogliere i seguenti elementi

1. Si prega di fare riferimento all'immagine della Figura 1a) e 1b) per la costruzione di una piattaforma di legno per trattenere il mouse durante la procedura.
2. Mix di digestione per linfonodi - HBSS + 1.25mg/ml Collagenasi TypeIV o 2,5 mg / ml Collagenasi D
3. Mix di digestione per i polmoni - HBSS + 1 mg / ml Collagenasi
4. Diluire sfere di lattice (1:20) in PBS per iniezione intraperitoneale di visualizzare i LDLNs

Nota: LDLNs sono piccoli e difficili da trovare. Per informazioni su come trovarli, iniettare 200μ....

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Discussione

Abbiamo utilizzato questo protocollo per studiare il traffico di spore di Bacillus anthracis dai polmoni al LDLNs. Per le applicazioni simili, il numero di particelle consegnato ai polmoni dovrebbero essere scelti con cura in modo che il materiale iniettato può essere rilevato nel LDLNs mediante citometria di flusso. Abbiamo anche utilizzato con successo questo metodo per il trasferimento adottivo di cellule e l'etichettatura delle popolazioni specifiche cellule del polmone utilizzando anticorpi fluorescen.......

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Cella stariner 70μm	BD
Anilina blu	Pescatore	A967-25
L'alimentazione degli animali ago	Popper e Sons Inc	7920
Collagenasi	Sigma	C2139
Collagenasi TypeIV	Worthington
Collagenasi D	Roche	11088974103
DPBS	Invitrogen	14190
Fluoresbrite YG Microsfere (0.5μm)	Polysciences, Inc	17152
HBSS senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio	Invitrogen	14170
Ketamina HCl (100mg/ml)	Hospira Inc
Laringoscopio Lama	PennCentury, Inc	Per il modello LS-1	Fare riferimento a www.penncentury.com
Leggero laringoscopio a fibre ottiche	WelchAllyn	80814
Rosso Perline fluorescente (0.5μm)	Invitrogen	F8812	Per l'iniezione ip
Xylazina (100mg/ml)	Lloyd Laboratori