유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림

요약

우리는기도를 통해 anesthetized 생쥐의 폐에 시험 물질의 비 수술 전달을 보여줍니다. 이 방법은 세균과 바이러스 병원균, 크린 시토킨, 항체, 구슬, 화학, 또는 염료로 폐 노출 수 있습니다. 우리는 더 이상 수확 및 유동세포계측법에 대한 폐, 폐 배수 림프절 (LDLNs) 처리 설명합니다.

초록

이러한 폐포 macrophages 및 폐 돌기 세포 (LDCs)로 Phagocytic 세포가 지속적으로 폐에서 폐포 공간에서 항원을 샘플. LDCs는 특히 폐 배수 림프절 (LDLNs)들이 immunogens ^1,2의 다양한 적절한 면역 반응을 시작 T 세포 흡입 항원을 제시 어디에.로 마이 그 레이션하는 것으로 알려져 있습니다 생쥐의 폐, 공기 항원 사이의 상호 작용 모델하려면, 항원은 intratracheally ⁵ 에어로졸 ⁶ 등 intranasally ^1,3,4 관리하실 수 있습니다. 각 경로로 배달 고유 기술 기술과 실험을 설계하기 전에 고려해야 할 제한 사항을 포함한다. 예를 들어, 비강 및 aerosolized 노출은 폐와 상부 호흡기의 넓이 모두에 항원을 제공합니다. 따라서 항원 가능성이 결과의 해석을 복잡, 비강 관련 림프 조직 (NALT) ^7에 액세스할 수 있습니다. 또한, 삼키는, 재채기와 마우스의 호흡 속도는 전달 복용에 불일치가 발생할 수 있습니다. 상부 호흡 트랙트의 참여가 어떤 연구를 위해 선호하는 수 있지만, 그것은 특히 폐에서 시작된 이벤트에 초점을 실험을 복잡하게하실 수 있습니다. 그것은 폐에에 직접 테스트 자료를 제공하고 NALT를 무시으로이 설정에서, intratracheal (IT) 경로가 바람직합니다. 많은 그것 주입 프로토콜은 구강이나 폐에에 액세스할 수있는 기관의 수술 노출을 통해 기관 중 시각 삽관법를 포함. 여기에, 우리는 기지에 대한 간단한, 일관성, 비 수술 방법을 설명합니다. 기관의 개통은 후두경를 사용하여 시각이며 구부러진 gavage 바늘은 다음 innoculum를 제공하는 기관에 직접 삽입됩니다. 우리는 또한 수확 및 유동세포계측법에 의해 항원 인신 매매의 분석 LDLNs 및 폐의 처리를위한 절차를 설명합니다.

프로토콜

1. 과정을하기 전에 준비를 다음과 같은 항목을 수집

1. 절차를 수행하는 동안 마우스를 묶을 수있는 목조 플랫폼 구축을위한) 그림 1A에있는 이미지 참조) 및 1B하시기 바랍니다.
2. HBSS + 1.25mg/ml Collagenase TypeIV 또는 2.5 MG / ML Collagenase D - 림프절에 대한 소화 믹스
3. 폐에 대한 소화 믹스 - HBSS가 + 1 MG / ML Collagenase
4. LDLNs을 시각화하기 위해 intraperitoneal 주사 PBS에서 라텍스 구슬 (1시 20분)를 희석

참고 : LDLNs 찾아 작은 열심히하고 있습니다. 그들을 찾는 방법에 대한 자세한 내용은 마우스로 빨간색 형광 라텍스 구슬이 IP 희석 1시 20분의 200μl 주입. 복막이 LDLNs ⁸ 빼낸. 24 hpi은 위에 설명된대로 마우스의 흉강을 폭로. LDLNs은 복막 캐비티에서 탈진 비즈에서 분홍색 표시됩니다.

5. 적혈구 세포 (RBC) 용해 완충액 - 0.15M NH ₄ Club 호텔, 10mM KHCO _3, 1L DH ₂ 0에서 0.1 mm까지 _나이 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). 7.2-7.4로 산도를 조정하고 실온에서 저장합니다.
6. 70μm 100μm 또는 셀 스트레이너
7. 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 = 8.0의 주식 솔루션
8. CaCl _2, MgCl _2없이 HBSS
9. 가위와 무딘 종단 포셉
10. 후두경
11. 각도에 Gavage 바늘 (22 게이지) 벤트 (그림 2)
12. 스티로폼 보드와 마우스를 확산을위한 핀
13. 톱 팬 밸런스
14. 아닐린 블루 솔루션 - H ₂ O에 10mg/ml

참고 : 우리가 사출 기술의 시연을 위해이 솔루션을 사용합니다.

2. 마우스 마취제의 준비 및 관리

1. 최종 농도가 각각 2mg/ml하고 10mg/ml 수 있도록 멸균 PBS에 Xylazine과 300ml의 혼합물을 준비합니다.
2. 최고의 팬 균형에 마우스를 달다.
3. 각각의 마우스에 필요한 복용량을 계산합니다. Xylazine (2-4 MG / kg)와 케타민을 (70-80 MG / kg) 체중에서 선량은 준비된 혼합물의 적절한 볼륨을 사용하고 intaperitoneally을 주입. 각 마우스 스트레인은 ​​마취의 최적화가 필요할 수 있습니다. 너무 마취를 받고 쥐들이 inoculum가 폐로 얻은 후에 치명적일 수있는 감소 호흡 속도가있을 수 있습니다.
4. 3~5분 후, 마취의 영향에 대한 마우스를 관찰합니다. 마우스가 완전히 anesthetized 있는지 확인하려면 다음 표지판 확인 :
   1. 호흡 속도는 느리게한다.
   2. 목 집었 때 마우스는 팔을 스트레칭 안됩니다.
   3. 뒷다리 팔다리가 자극되는 답변이되지 않습니다.
      이러한 기준이 충족되지 않으면, 몇 분 동안 기다린 후 다음 단계로 진행하기 전에 다시 확인합니다.

3. Intratracheal 주사

1. 50μl 생리에 innoculum을 준비합니다. innoculum와 살균 벤트 gavage 니들 장착되어 1ml 주사기를 입력합니다. 주사기는 유체의 모든 폐로 얻은 것을 보장하기 위해 innoculum 뒤에 100μl 공기 주머니로로드해야합니다.
2. 철사에 미치는 incisors에 의해 매달려 직각 나무 플랫폼에 마우스를 놓고 부드럽게 리본의 조각 장소에서 그것을 제지.
3. 왼손으로 후두경 켜고 (당신이 바로 손으로하는 경우)와 무딘 종료된 포셉 한 켤레를 잡아. 부드럽게 입을 열 돌을 후두경의 끝에와 포셉을 사용합니다.
4. 포셉로 혀를 뽑아서 측면에 들어요. 입 뒤쪽으로 후두경 블레이드를 안내입니다. 당신이기도의 개통을 볼 때까지 90 ° 각도로 천천히 아래로 눌러 후두경 보관하십시오. 장소에 후두경 잡아. 입에서 혀 당기는 않으며 조직 손상이 발생하지 않도록 이것은 부드럽게 이루어져야 할 때주의해야합니다.
5. 바늘에 굽어 전면 incisors에 의해 때까지 다른 손으로, 오른쪽 손으로 벤트 gavage 바늘로 장착되어 innoculum 들어있는 1ml 주사기를 가지고기도에 바늘을 삽입합니다. innoculum를 제공하기 위해 골고루 플런저를 밀어. innoculum 거품이 안됩니다. 가능한 빨리기도의 바늘을 빼낸다. 마우스는 질식 및기도가 너무 오래 차단되면 죽을 것이다. innoculum가 폐 속에 흡입 수 있도록 몇 초 동안 수직으로 마우스를 잡고.
6. 플랫폼의 마우스를 꺼내와 난방 램프 근처에 놓으십시오. 오랜 기간 동안 직접적인 열을 아래에 마우스를 두지 마십시오. 마우스 절차 (복구 시간이 종자에 따라 달라질 수 있음) 후 30 분 이내에 완전히 깨어 있어야합니다. 마우스가이 시간 동안 열심히 관찰되어야하며 너무 뜨겁거나 너무 차가운 얻을 수해서는 안됩니다, 이것은 또한 죽음에 선도적인 호흡 곤란에 쥐를 넣어 수 있습니다.

4. 유동세포계측법을위한 수확 및 가공 폐 배수 림프절 및 폐

1. AVMA의 안락사 가이드라인 당 등 원하는 방법을 사용하여 마우스를 희생. 이것은 개별적인 수확 결과에 따라 다를 수 있습니다. pentobarbital 나트륨 않는 치명의 관리는 적절한 안락사 프로 시저의 예입니다. 우리는 CO _2에 의해 안락사의 부정적인 폐 효과를 보지 못했어요.
2. 해부 보드에 팔, 다리를 핀. 가위로 복부 쪽의 중간을 따라 절개를합니다. 부드럽게 피부를 끌어와 가슴 벽 근육을 노출.
3. 복부 장기 노출 가슴 벽 근육을 통해 incisions하십시오.
4. 포셉 주사의 횡경막과 흉골의 끝을 잡고. 흉곽의 양쪽을 따라 횡경막을 잘라요.
5. 해부 보드 표면에 평행하게 가위가 양쪽에있는 dorso - 복부 라인을 따라 흉강을 통해 절단과 함께.
6. 약간 최대 갈빗대 리프트. 심장의 오른쪽에, 그냥 thymus 아래 두 개의 림프절을 찾습니다. 약간 큰 셋째 림프절은 기관에 직각으로 실행하는 작은 동맥 혈관 아래에 위치하고 있습니다. 하베스트 림프절 림프절의 소화 믹스 1 ML에.
7. 림프절을 수확 후 포셉 한 쌍의으로 마음을 잡고 다른과 폐를 잡아. 6 잘 판에 얼음 차가운 PBS의 3ml에 수확 폐.
8. , 폐 엽 (叶)을 별도의 PBS를 기음과 집게와 가위를 사용하여 작은 조각으로 엽 (叶)을 들어온다. 폐에 대한 소화 믹스의 3ml를 추가합니다. 이 단계 동안 얼음에 6 판 잘 보관하십시오.
9. 37 30 분 25-30 분 및 폐를 위해 림프절을 품어 ° C. 얼음 반응과 장소를 중지 소화 혼합물의 각 10mM의 최종 농도 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다.
10. 3ml 주사기를 사용하여, 18GA 바늘을 통해 3 번 폐 부분을 전달합니다. 1ml 주사기의 플런저의 백 엔드를 사용하여 70 100μm 셀 strainers 통해 폐와 LNs의 매쉬는 조각. ^{칼슘이없는} HBSS의 10ml와 세포 strainers 와시 ^+와 MG ^{2 +.} 5 분 500 XG에 원심 분리기.
11. RBC의 용해 버퍼 5 ML에서 펠렛을 Resuspend 및 실내 온도에서 3 분 알을 품다. ^{칼슘이없는} HBSS의 10ml 추가 ^+와 MG ^{2 +} 용해를 끄지 수 있습니다. 5 분 500 XG에 원심 분리기. 각각 10ml와 5ml에 폐 및 LDLN 단세포 suspensions을 가져 오십시오. trypan 파랑 제외하여 hemacytometer를 사용하여 라이브 세포를 계산합니다. 세포는 이제 유동세포계측법을 위해 얼룩이 준비가 된 것입니다. 폐 1 엽은 유동세포계측법 충분한 수 있습니다. 기타 엽 (叶)은 이러한 조직학에 대한 크린 시토킨 또는 조직에 대한 homogenates 같은 마우스 내의 다른 실험적인 질문에 사용될 수 있습니다.

5. 대표 결과 :

즉시에게 주사를 다음과 폐 LDCs와 폐포 macrophages은 폐의 폐포 공간에서 항원을 획득. 그림 3은 CD11c + (LDCs 및 폐포 macrophages에 대한 표현)의 비율이 찬란 표시 바실러스 anthracis 포자 양성 반응 세포가 30 분 이후 그 주사를 보여줍니다. 이때 폐 단일 세포 현탁액에서 CD45 + CD11c + 세포의 ~ 15.9 %가 바실러스 anthracis 포자 (그림 3, 하단 패널)을 숨겨. 폐에서 CD11c + 세포의 자세한 특성 들어, 김 및 Braciale ⁴ 참조하십시오. 찬란 분류 구슬은 일상적 LDLNs ⁹ 미립자 항원의 거래를 평가하는 데 사용됩니다. 폐에에서 LDLNs이 전송을 평가하기 위해, 형광 라텍스 구슬은 LPS와 LDLNs 24 hpi에서 분석했다 그것을 주입했다. LDLNs에서 CD11c ^{안녕 세포의} 약 4 % 24hpi (그림 4)에서 형광 구슬을 숨겨. 이러한 대표적인 실험이 프로토콜은 효율적으로 LDLNs에 폐 후 트래픽이 그들을 흡입 항원 미립자를 얻기위한 세포를 추적하는 데 사용할 수있는 것을 보여줍니다.

그림 1. )는 사출 동안 쥐를 억제를위한 나무 플랫폼. 나무 블록은 각도로 절단되어 금속 막대는 앞에서 볼 그림 1A 장착되어 있었다)과 측면보기 그림 1B. 전선의 작은 조각은 마우스의 전면 incisors를 고정하는 금속 막대 주위에 상처가되었다. 리본의 조각이 절차를 수행하는 동안 장소에 그것을 유지하기 위해 마우스 주위 넥타이 플랫폼에 붙어 있 었지.

그림 2. 그 주사 바늘 Gavage. gavage 주사 바늘 (오른쪽)는 분사를 위해 ~ 135 ° (왼쪽)의 각도로 구부했다.

그림 3. 바실러스 anthracis을 표현하는 그것 주입 GFP (스턴 - p6GFP), 5hrs 게시물 도전을 항구 폐의 모든 CD11c + 세포의 비율입니다. AJ의 마우스는 1X로 도전했다10 ⁸ GFP - 바실러스 anthracis 포자 및 폐가 5hrs 게시물 감염에서 분석했다. 도트 플롯은 CD11c의 비율이 표시 + 바실러스 anthracis 양성 반응이 폐 세포를.

그림 4. 림프절에게 I. t 사출 다음과 같은 24 시간을 배출 폐에서 형광 구슬의 탐지 (노랑 / 녹색). AJ 마우스는 IT와 LDLNs가 24hpi 분석했다 10μg LPS (오른쪽 패널)과 PBS (왼쪽 패널) 또는 5x10 ⁹ Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) 중 하나를 제공했다. 대표 도트 플롯은 항구 형광 구슬은 빈 채널 역모를 꾸몄다 LDLNs에서 CD11c ^{안녕 세포의} 비율을 보여줍니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

우리는 폐에서 LDLNs에 바실러스 anthracis 포자의 인신 매매를 공부하기 위해이 프로토콜을 이용합니다. 유사한 어플 리케이션의 경우, 폐에 전달 입자의 개수는 신중하게 주입 자료가 유동세포계측법하여 LDLNs에서 검색된 수 있도록 선택하여야한다. 우리는 또한 성공적으로 세포 찬란 표시된 항체를 사용하여 특정 폐 세포 집단의 라벨링의 입양 전송을 위해이 방법을 사용했습니다. 또한,이 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
70μm 셀 stariner	BD
아닐린 블루	어부	A967 - 25
동물 먹이 바늘	포퍼 앤드 손즈 병원	7920
Collagenase	시그마	C2139
Collagenase TypeIV	워싱턴
Collagenase D	로체	11088974103
DPBS	Invitrogen	14,190
Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm)	Polysciences, Inc의	17,152
염화칼슘과 마그네슘 염화물없이 HBSS	Invitrogen	14,170
케타민을 HCL (100mg/ml)	Hospira 부동산
후두경 블레이드	PennCentury, Inc의	모델 LS - 1	을 참조하십시오 www.penncentury.com
경량 광섬유 후두경	WelchAllyn	80,814
레드 형광 비즈 (0.5μm)	Invitrogen	F8812	IP 주사
Xylazine (100mg/ml)	로이드 레버 토리스