Kombine Kullanımı Hedefleme Koku Ampul Nöronlar In Vivo Elektroporasyon ve Gal4 Tabanlı Enhancer Trap Zebra balığı Hatları

Özet

Genetik manipülasyon zamansal ve mekansal çözünürlükte karıştırmayı ki biyolojik olayların spektrum belirler. Burada zamansal ve mekansal ayrık In vivo elektroporasyon,.

Özet

In vivo elektroporasyon C olanlar da dahil olmak üzere, gelişmekte olan embriyolar belirli bölgelere ifade plazmid DNA, RNAi reaktifleri ve morfolino anti-sense oligonükleotidler sunmak için güçlü bir yöntemdir elegans, civciv, Xenopus, Zebra balığı, ¹ ve fare. Zebra balığı, in vivo elektroporasyon bu reaktifler ^2-7 teslimat için mükemmel bir mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip olduğu gösterilmiştir. Belirli bir gelişme aşamasında, bu reaktiflerin birleştirmek için izin verdiğinden bu yöntem zamansal çözünürlüğü önemlidir. Electroporated vektörleri ifade 6 saat içinde ⁷ nedeniyle oluşur Dahası, bu yöntem, transgenik yaklaşımlar daha zamanında . Tek bir hücrenin ^{2, 6} hedefleyen mekansal çözünürlüğü son derece hassas olabilir reaktifler, bir doku ya da yapı içinde belirli bir hücre popülasyonu içine dahil etmek için sık sık tercih edilir . Birden fazla hücreyi hedef, in vivo elektroporasyon embriyo belirli bir bölgeye teslimat için verimli Bununla birlikte, özellikle gelişmekte olan sinir sistemi içinde, bu özel hücre tipleri yalnızca mekansal ayrık elektroporasyon yoluyla hedef zordur. Alternatif olarak, artırıcı tuzak transgenik hatları transgenlerin ⁸ mükemmel hücre türüne özgü ifade sunuyoruz. Burada, özellikle zebrafish koku alma ampul nöronların gelişmekte olan hedef, in vivo ^{elektroporasyon 7,} 9 mekansal ayrık transgenik Gal4 tabanlı arttırıcı tuzak ^hatları 8 birleştiren bir yaklaşım açıklar . Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 (eski GA80_9) arttırıcı tuzak hattı daha önce bir zebrafish Beyin de dahil olmak üzere gelişmekte olan beynin birden fazla bölgede mCherry aracılı hedefli transgenik ifade görüntüler, optimize Gal4 (KalTA4) transkripsiyonel aktivatör ⁸ tarif serebellum, ön beyin, ve koku ampul. Özellikle GFP ifade koku ampul, birden fazla Gal4 bağlayıcı siteleri (UAS) kontrolü altında GFP kodlama sırası ile plazmid hedef için 24-28 saat sonrası fertilizasyon (hpf) önbeyin ön ucunu electroporated oldu. Bu yöntem önbeyin birden fazla bölgeye plazmid DNA içeriyor olsa da, GFP ifadesi yalnızca transgenically KalTA4 transkripsiyon faktörü ifade hücrelerinde meydana gelir. Böylece GA080_9 transgenik hattı kullanarak, bu yaklaşım sadece gelişmekte olan koku alma ampul GFP ifade açtı. Koku ampul ¹⁰ mitral hücreler için daha önce açıklandığı gibi, bu yaklaşım ile hedeflenen GFP ifade hücreleri, tipik aksonal projeksiyonlar gösterdi . Bu yöntem aynı zamanda mekansal ve zamansal ayrık-fonksiyon kaybı analizi için bir yöntem sağlayacak kısa saç tokası RNA girişim ifade plazmid da dahil olmak üzere diğer reaktiflerin hedeflenen teslim için kullanılan olabilir.

Protokol

1. Transgenik embriyolar

1. Burada zebrafish transpozon-aracılı arttırıcı tuzak yöntemi ⁸ yoluyla oluşturulan bir transgenik hattı kullanıyor. KalTA4, Gal4 transkripsiyonel aktivatör bir zebrafish optimize edilmiş sürümü ve kırmızı floresan proteini, mCherry: transgenik eklemek iki kodlama dizileri içerir. Endojen bir arttırıcı sırası kontrolü altında bu transgenik kaset ifade transgenik zebrafish arttırıcı tuzak yöntemi verim hatları. Böylece, belirli bir arttırıcı dizisi kimliğini bağlı olarak, her iki KalTA4 ve mCherry ifade, gelişmekte olan beynin belirli bölgelerde lokalize olur. Et (: Gal4TA4, UAS: zic4 mCherry) ^hzm5 doğrultusunda biz burada kullanmakta olduğunuz, burada özel bir önem ifade, arka beyin, ön beyin, çeşitli sitelere lokalize ve koku ampulü ⁸ (Şekil 1 bkz.) . Bu model, ifade ve genom içinde kaset lokalizasyonu göz önüne alındığında, transgenlerin (ayrıca bkz. Zic4 organizatörü ⁸ kontrolü altında olması tahmin edilmektedir http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ nörogörüntüleme / lines_distel / ana ).
2. Yetişkin Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) transgenik eklemek için heterozigot ^hzm5 balıkları genellikle yaklaşık% 50 oranında transgenik yavrular önde gelen WT balık (AB) ile evlendirilen. (Transgenik yavruların daha yüksek bir yüzdesi, iki heterozigot evlendirilen olabilir.)
3. Pigment oluşumunu engellemek ve floresan görüntüleme kolaylaştırmak, transgenik embriyolar 6-8 hpf az 100 mcM N-phenylthiourea (PTU) başında tedavi için.

2. Montaj embriyolar

1. 24-28 hpf, yumurta su PTU olmadan embriyo transferi. MCherry floresan mikroskop kullanılarak ifade transgenik embriyolar belirleyin. Ince forseps kullanılarak transgenik embriyolar koryonik membran çıkarın. ^4: Transfer embriyolar elektroporasyon tampon artı% 0,02 tricaine [180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl _2, 5 mM Hepes, pH 7.2 Elektroporasyon Tampon] içeren Petri koryon kurtulmuş. Anestezi için 2 dakika montaj adıma geçmeden önce yürürlüğe girmesi için izin verin.
2. Çözüm mikrodalga ve ardından çözüm 34-37 ° C inkübatör içine yerleştirerek,% 0.5 'lik düşük erime noktalı agaroz elektroporasyon tampon artı tricaine bir çözüm hazırlayın. Agaroz çözüm sıcaklık dengelenmiş sonra, agaroz çözüm merkezine 60 mm Petri kabında büyük bir damla (~ 500 ul) yerleştirin. 6-8 anestezi embriyolar agaroz bu damla ekleyin.
3. Ince forseps (ya da kesilmiş Microloader pipetlemeyin ipuçları ince biter) kullanarak, konumu, hepsi aynı yöne bakan ve dikey bir satır dizilen bu tür embriyoların. Agaroz katılaşmaya ve pozisyon embriyolar tuzak için, 2-3 mm buz büyük bir Petri kabı üzerine çanak yerleştirin.
4. Agaroz katılaşmış sonra, çözüm tamamen katılaşmış agaroz damla kapsar sağlamak, tabak elektroporasyon tampon artı tricaine sel.

3. Plazmid DNA ifade mikro-enjeksiyon

1. Midi ve maxi-hazırlık plazmid izolasyon kiti (örneğin Qiagen) kullanılarak plazmid GFP ifade hazırlayın. Nihai konsantrasyonu 0.5 mg / ul steril su artı% 0.03 fenol kırmızısı plazmid askıya alınması. Burada anlatılan koku ampul hedef deney için, birden fazla Gal4 bağlayıcı siteleri (14 tandem UAS dizileri ve bazal balık organizatörü E1b) kontrolü altında EGFP kodlama sırası ile plazmid bir ifade kullanıyor. GFP ifade etmek mümkün olacak, transgenically KalTA4 transkripsiyon faktörü ifade bu plazmid, sadece hücreleri kullanarak, bu yüzden, GFP hedeflenen ifade aracılık.
   Not: burada biz DNA enjeksiyonları, gelişmekte olan beynin diğer bölgeleri hedefleyen için geçerli olmalıdır görünüm için fenol kırmızısı kullanarak sürece bölgede ventriküller erişilen olabilir. Bodipy veya Quantam Nokta boyalar, floresan görselleştirme gerektiren diğer hücre türleri hedef için potansiyel floresan aydınlatma altında enjeksiyon görselleştirmek için kullanılan olabilir.
2. Mikroenjeksiyon pipetler ya yatay veya dikey bir pipet çektirmenin kullanılarak imal edilebilir. Isı ve çekme gücü ayarları çektirme, gözü tipi türüne bağlı olarak değişir ve cam kapiller tüplerin türü.
   Sutter P-30 dikey çektirmenin kullanarak, uzun, sivri, keskin pipetler filamentler ile ince duvarlı kapiller borosilikat cam üretmek için bir ısı ayarı 980 ve 960 çekme kuvveti [Sutter Enstrüman # BF100-78-10]. Bu ayarlar ile çekilmiş Microinjetion pipetler kapatılır ve enjeksiyondan önce kırık olmalı.
3. DNA plazmid çözüm 1-2 ul enjeksiyon pipet eklemek için bir Microloader pipet kullanın.
4. Mount vebasınçlı enjeksiyon sistemi pipet tutucu içine yüklenen pipet güvenli.
5. Basınç bakliyat, kırmızı DNA çözüm kabarık sürüm, çıkarana kadar ince forseps ile yüklenen pipet geri kırın. Alternatif olarak, ipuçları, hızlı bir şekilde bir batık, katlanmış laboratuvar Kimwipe nüfuz ederek geri kırılmış olabilir.
   Not: enjeksiyon pipetler başlangıçta kapatılır ve elle geri kırık olması gerekir, çünkü ucu boyutu ve enjeksiyon hacmi değişkendir. İdeal enjeksiyon pipetler 24 hpf embriyolar (40 psi az 100 ms enjeksiyon bakliyat) gelişmekte olan önbeyin ventrikül tamamen doldurmak için 3-5 enjeksiyon bakliyat gerektirir.
6. Plazmid DNA çözümü gibi DNA komşu zorla ve beynin koku alma ampul formu mukadder bölge içine ardalanmalı gelişmekte olan beyin ventriküller içine enjekte edilir. Olfaktör bulb önbeyin ventrikül en ön duvarı hücrelerinden elde edilir. Böylece, gelişmekte olan beynin anterior sonuna doğru pipet işaret olduğu gibi ventriküller içine enjeksiyon pipet takarak, basınçlı enjeksiyon DNA'sına ve ileriye dönük bir koku alma ampul komşu zorlar. Kırmızı boya önbeyin ventrikül anterior sonunda açıkça görünür oluncaya kadar DNA enjekte edilir. DNA DNA seyreltilmesi, hemen diffüz başlar, çünkü enjeksiyondan sonra mümkün olduğunca çabuk elektroporasyon adım (örneğin, 10 saniye içinde) devam etmek önemlidir.

4. Elektroporasyon

1. Elektroporasyon Çim platin subdermal elektrotlar (Çim Teknoloji # E2) yapılan kendini inşa elektrotlar kullanılarak yapılmaktadır. Elektrotlar, elde tutulan bir prob ve son platin elektrot arasındaki mesafe 1 mm (inşaat ile ilgili detaylar için ⁹⁾ olmalıdır. Kare dalga elektroporasyon bakliyat Çim SD-9 Stimülatör (Çim Teknolojisi, Model SD-9) elektrotlar bağlayarak üretilmektedir.
2. 70 volt tek, 5 ms elektroporasyon darbeleri üretmek için SD-9 stimülatörü ayarlayın. Elektrot, negatif elektrot embriyo kafasının arka ise pozitif elektrot, embriyo ön sonuna kadar yanında konumlandırılmış gibi yerleştirin. El ~ 1 sn her darbe ayıran, SD-9 stimülatörü tek mod anahtarı kullanılarak ~ 7-8 elektroporasyon bakliyat başlatın. Uygun gerilimler embriyoların yaş ve kullanılan gerilim kaynağı bağlı olarak değişecektir. Eski embriyolar elektroporasyon ⁷ başlatmak için yüksek gerilimi ise Genç embriyolar, embriyo zarar vermemek için daha düşük voltaj gerektirir.
3. Embriyoların agaroz onları kurtararak elektroporasyon sonra en az 10 dakika önce kurtarmak için izin verin.
4. Ince forseps kullanarak, embriyoların kendileri ile fiili temas kaçınarak nazikçe embriyoların anahat izleme agaroz embriyoların serbest.
5. Bir kere serbest (PTU ile gerekirse) embriyoların yumurta su geri. 28 saklayın ° C GFP ifade için görüntülü kadar.

5. Görüntüleme için Montaj embriyolar

1. Yumurta su artı PTU yumurta su artı% 0,02 tricaine embriyo transferi. Anestezi için birkaç dakika montaj adıma geçmeden önce yürürlüğe girmesi için izin verin.
2. Çözüm mikrodalga ve ardından çözüm 34-37 ° C inkübatör içine yerleştirerek, yumurta su artı tricaine düşük erime noktası agaroz% 0.5 çözeltisi hazırlayın. Agaroz çözüm sıcaklık dengelenmiş sonra, agaroz çözüm merkezine 35 mm Petri kabında büyük bir damla (~ 300 ul) yerleştirin. Agaroz Bu düşüşün bir anestezi embriyo ekleyin.
3. Ince forseps (ya da kesilmiş Microloader pipetlemeyin ipuçları ince biter) kullanarak, konumu mümkün dik bir mikroskop (ters kapsamları farklı bir embriyo geometrisi gerektirir, gelişmekte olan beynin dorsal görselleştirmek için, dik olduğunu embriyolar ve görselleştirme izin aşağıdan farklı bir çanağı; ^12). Buz 2-3 mm büyük bir Petri kabı üzerine çanağı yerleştirerek agaroz katılaşmaya. Re-yönelim ince forseps ile büyük olasılıkla yan embriyo üzerine düşmemesi sağlamak için katılaşma sırasında istenecektir.
4. Agaroz katılaşmış sonra, sel, tabak, yumurta su artı tricaine ile çözüm tamamen katılaşmış agaroz damla kapsar sağlamak.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

GFP ifade elektroporasyon 6 saat sonra gibi erken olarak görülebilir olmasına rağmen, biz burada hedeflenen hücrelerin neurite yapısı yeterince gelişmiş olduğu gibi elektroporasyon 4 gün sonra bir embriyodan görüntüleri gösteriyor. Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 transgenik arttırıcı tuzak hattı mCherry (ve KalTA4) kurucu ifade görüntüler Beyin, beyincik, ön beyin ve koku alma ampul embriyolarda 5 gün sonrası fertilizasyon (Şekil 1A ve 1C.) Embriyolar hedeflenmiş elektroporasyon (yukarıda açıklandığı gibi), gelişmekte olan koku alma ampul hücreleri (Şekil 1B, 1D, 1E) ile sınırlı olduğunu göstermek GFP ifade tarafından kurulmuştur plazmid UAS-GFP ifade vardı. Sadece hücreleri transgenically ifade KalTA4 transkripsiyon faktörü UAS-GFP plazmid ifade etkinleştirmek için edebiliyoruz. Transgenik olmayan embriyolara plazmid bu Incorporation saptanabilir GFP ifadesi yol açmaz. Böylece, UAS-GFP ve gelişmekte olan koku alma ampul hücreleri GFP münhasır ifade KalTA4 sürücü yerelleştirilmiş transgenik ifade hedeflenen elektroporasyon kombine eylem. GFP ifade hücreleri, koku alma ampul mitral hücreleri (Şekil 1B ve ^1D) 10 tipik aksonal projeksiyonlar göstermektedir . Akson projeksiyonları görselleştirmek için, rakam 1B ve 1D görüntüleri hücre gövdeleri bölgenin aşırı maruz kalmış olduğu gibi yüksek düzeyde maruz kalan gerekiyordu. Daha düşük bir seviyede maruz kalma (Şekil 1E) GFP ifade hücre gövdeleri gerçekten koku ampul (gri çizgi koku ampul sınır işaretleri Şekil 1C ve 1E karşılaştırmak) lokalize olduğunu gösterir.

Şekil 1. 5 dpf'e zebrafish embriyo koku ampul GFP ifade Hedeflenen. Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 transgenik arttırıcı tuzak hattı mCherry Beyin, beyincik, ön beyin ve koku alma ampul (A ve C, mCherry floresan kırmızı ile gösterilen) kurucu ifade görüntüler. MCherry Bu ifade, transgenik Gal4 ifade aracılık. UAS-GFP ekspresyon vektörü ile 28 hpf electroporated edilmiştir Embriyolar, A, yeşil gösterilen hedef, GFP 5 gün sonrası döllenme koku ampul (B, D ifadesi, ve E, GFP floresans aynı embriyo ekran ve C). Alt kısmında daha düşük bir pozlama görüntü (E) bu GFP ifade koku ampul hücre gövdeleri ile sınırlıdır. Gri çizgi koku ampul sınır gösterir. Parlak alan (gri ölçek), yeşil floresan (yeşil) ve kırmızı floresan (kırmızı) görüntüleri Olympus BX60 floresan mikroskobu ile.

Tartışmalar

Burada electroporated transgen ifade gelişmekte olan koku alma ampul hücrelerin belirli bir nüfus hedef arttırıcı tuzak Gal4 transgenik hat kullanan zebrafish in vivo elektroporasyon yöntemi bir tarif var. Bu yaklaşım arttırıcı tuzak transgenik hatları ⁸ aracılı hücre türüne özgü bir ifade ile, in vivo ^{elektroporasyon} 7 mükemmel zamansal çözünürlüğü birleştiriyor . Rağmen in vivo elektroporasyon koku ampul hedefleme açıklanan gelişmekte olan sinir sistemi ^2-7 diğer bölgeleri hedef için kullanılabilir ve birçok farklı özel hücre tipleri veya dokuların Gal4 hedeflenen ifade arttırıcı tuzak hatlarına mevcuttur ^{8, 11.} Tabii ki, bu elektroporasyon teknik Lexa veya Tet sistemleri ^{13, 14, 15} gibi diğer combinatioral genetik yaklaşımlar için de uygun olmalıdır. Elektroporasyon önemli bir avantajı, uygun bir Gal4-line kullanılabilir olduğunu verilen ek transgenik hatları yapmaya gerek olmadığını. Bu altı ay kaydeder.

In vivo elektroporasyon nöronlar ve bunların öncüleri olan, sinir sistemi gelişimi belirli bir ^aşamasında ilgi 7 ne olursa olsun içine oligonükleotidler birleştirmek için sağlar. Bu temporal çözünürlük, önceki gelişim aşamalarında önemli işlevlere sahiptir hedef genleri ile ilgili sorunları aşmak için-fonksiyon kaybı analizi için özellikle avantajlıdır. Biz burada açıklamak yöntemi de RNAi oligonükleotidler veya yapıları ve morfolino anlamda anti-oligonükleotidler ^{4, 7} de dahil olmak üzere-fonksiyon kaybı reaktifler dahil etmek için kullanılabilir. Plazmid odaklı reaktifler, dominant-negatif protein ifade plazmid veya kısa saç tokası RNAi plazmid gibi hassas hücre tipine özgü ifade GFP ifade için buraya göstermiştir için izin Gal4 UAS kontrol altına olabilir.

Malzemeler