Ориентация обонятельных нейронов лампы с использованием комбинированных В Vivo Электропорация и Gal4 основе Enhancer Ловушка данио рерио Линии

Резюме

Временным и пространственным разрешением генетических манипуляций определяет спектр биологических явлений, что они могут нарушать. Здесь мы используем во времени и пространстве дискретных В естественных условиях Электропорации, в сочетании с трансгенными линиями данио, чтобы вызвать экспрессию GFP трансгенов в частности, в нейронах развивающихся обонятельной луковице.

Аннотация

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse ¹. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents ^2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours ⁷, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell ^{2, 6}, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes ⁸. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines ⁸ with spatially discrete in vivo electroporation ^{7, 9} to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)^hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described ⁸, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb ¹⁰. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

протокол

1. Трансгенные эмбрионов

1. Здесь мы используем трансгенные линии данио, созданных с помощью транспозонов-опосредованной усилитель ловушку метод ^8. Трансгенные вставки включает в себя два кодирующих последовательностей: KalTA4, данио-оптимизированная версия Gal4 транскрипционный активатор, а красный флуоресцентный белок, mCherry. Ловушка усилитель метод дает линий трансгенных данио рерио, что выразить это трансгенные кассету под контролем эндогенных последовательность усилитель. Таким образом, в зависимости от личности определенной последовательности усилитель, выражение обеих KalTA4 и mCherry локализовано в конкретных регионах развивающегося мозга. Для Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 линии, что мы используем здесь, выражение локализован на несколько сайтов в задний мозг, передний мозг, и, что особенно важно здесь, обонятельной луковице ⁸ (см. также рис 1.) . С учетом этой структуры выражения и локализации кассету в геноме, трансгенов, по прогнозам, будет под контролем промотора zic4 ⁸ (см. также http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ нейровизуализации / lines_distel / главная .).
2. Взрослый Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 рыбы гетерозиготных по трансгенные вставки, как правило, в паре с WT (АВ) рыбы, что приводит к приблизительно 50% трансгенных потомство. (Для более высокий процент потомства трансгенных, два гетерозигот может быть повязана.)
3. Для того, чтобы блокировать образование пигмента и облегчения флуоресцентные изображения, лечить трансгенных эмбрионов с 100 мкМ N-фенилтиомочевиной (ПТУ), начиная с 6-8 HPF.

2. Монтаж эмбрионов

1. На 24-28 HPF, передача эмбрионов яйцо водой без ПТУ. Определить трансгенных эмбрионов путем экспрессии mCherry использованием флуоресцентного микроскопа. Удалить хорионического мембраны из трансгенных эмбрионов с использованием тонких щипцов. Трансфер эмбрионов освобождены от хориона в чашке Петри содержащей буфер электропорации плюс 0,02% tricaine [Электропорация буфера: 180 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl _2, 5 мМ HEPES, рН 7,2] ^4. Позвольте 2 минуты для анестезии вступили в силу, прежде чем приступить к установке шаг.
2. Подготовка 0,5% раствор с низкой температурой плавления агарозы в буфере электропорации плюс tricaine в микроволновую печь решение, и затем накладывают раствор в 34-37 ° С инкубатор. Как только температура раствора агарозы имеет уравновешенный, место большое падение (~ 500 мкл) раствора агарозы до центра 60 мм чашки Петри. Добавить 6-8 наркозом эмбрионов этой капли агарозы.
3. Использование тонких щипцы (или штраф концов сократить советы пипетки microloader), положение эмбриона, что все они располагались в том же направлении и выровнены в вертикальном ряду. Чтобы укрепить агарозы, и ловушка эмбрионов в должность, место блюдо на большую чашку Петри с 2-3 мм льда.
4. После агарозном укрепил, наводнение блюдо с электропорации буфера плюс tricaine, гарантируя, что решение полностью покрывает затвердевшей агарозы капли.

3. Микро-инъекции ДНК плазмиды экспрессии

1. Подготовка GFP плазмиды экспрессии использования миди или макси-приготовительные плазмиды комплект изоляции (например, Qiagen). Приостановить плазмиды, чтобы конечная концентрация 0,5 мкг / мкл стерильной воды плюс 0,03% фенола красного цвета. Для обонятельной луковице ориентации эксперимент, описанный здесь, мы используем выражение плазмиду с кодирующей последовательности EGFP под контролем нескольких Gal4 сайтов связывания (14 тандеме UAS последовательности и базальных промоутер рыбы, E1b). С помощью этой плазмиды, только клетки transgenically выражения KalTA4 транскрипционный фактор будет иметь возможность выразить GFP, таким образом, посреднические целевого выражения GFP.
   Примечание: здесь мы используем фенола красного для визуализации инъекции ДНК, которая должна быть применима для ориентации других регионах развивающегося мозга, до тех пор, как регион может быть доступна из желудочков. Для нападения на другие типы клеток, которые требуют флуоресцентные визуализации, BODIPY или Quantam Dot красителей потенциально могут использоваться для визуализации инъекции под флуоресцентным освещением.
2. Микроинъекция пипетки могут быть изготовлены с использованием либо горизонтальной или вертикальной пипетки съемника. Тепло и тянуть прочности настройки будет меняться в зависимости от типа съемника, тип нагревательного элемента, а также тип стеклянные капилляры.
   Использование Саттер P-30 вертикальных съемник, использование тепла установки 980 и тянуть силы из 960 для производства длинные, конические, острые пипетки из тонкостенных капиллярных боросиликатного стекла с нитями [Саттер Инструмент # BF100-78-10]. Microinjetion пипетки вытащил с этими настройками уплотнены и должны быть разрушены еще до инъекции.
3. Используйте наконечник microloader пипетки добавить 1-2 мкл ДНК плазмиды решение инъекции пипетки.
4. Горы ибезопасный загружены пипетки в давление в системе держатель пипетки инъекции.
5. Перерыв обратно загружаются пипетку с тонким пинцетом, пока давление импульсы создают пыхтел выпуск красный раствор ДНК. Кроме того, советы можно разбить обратно, быстро проникают в воду, сложенные лаборатории Kimwipe.
   Обратите внимание: из-за введения пипетки изначально запечатаны и должны быть вручную сломанной спины, размер наконечника и объемом впрыска являются переменными. Идеально пипетки инъекции должны требовать 3-5 импульсов инъекции, чтобы полностью заполнить развивается передний мозг желудочка от 24 эмбрионов HPF (100 мс инъекции импульсов на 40 фунтов на квадратный дюйм).
6. Inject плазмиды решение ДНК в желудочки мозга развивается так, что ДНК вынужден прилегающих к и внедренного в, области мозга суждено форму обонятельной луковице. Обонятельной луковице происходит от клетки в самых передней стенки желудочка мозга. Таким образом, путем введения инъекций пипетки в желудочки, что пипетки, указывающей на переднем конце развивающегося мозга, давление впрыска сил ДНК в и прилегающих к перспективным обонятельной луковице. Inject ДНК до красного красителя отчетливо видна на переднем конце желудочка мозга. Поскольку ДНК начинает диффузного сразу, разбавляя ДНК, важно, чтобы перейти к электропорации шаг как можно скорее после инъекции (например, в течение 10 сек).

4. Электропорация

1. Электропорация осуществляется с использованием, возведенных электроды из платины Трава подкожных электродов (трава технологии # E2). Электроды присоединены к ручным зондом, и конечное расстояние между платиновыми электродами должна быть 1 мм (подробнее см. на строительство ^9). Прямоугольные импульсы электропорации производятся путем соединения электродов Трава SD-9 Стимулятор (Grass технологии, модель SD-9).
2. Установить SD-9 стимулятором для производства одного, 5 мс импульсов электропорации на 70 вольт. Расположите электроды, что положительный электрод расположен рядом с переднего конца эмбриона, в то время как отрицательный электрод сзади эмбриона голову. Вручную инициировать ~ 7-8 электропорации импульсов использованием одного коммутатора режиме SD-9 стимулятор, отделяя каждый импульс на ~ 1 сек. Соответствующее напряжение будет меняться в зависимости от возраста эмбрионов и источник напряжения используется. Младший эмбрионы требуют более низких напряжениях, чтобы избежать повреждения эмбриона, в то время как старший эмбрионы требуют более высоких напряжениях инициировать электропорации ^7.
3. Разрешить эмбрионов для восстановления, по крайней мере 10 минут после электропорации перед освобождением их от агарозы.
4. Использование тонких щипцов, свободные эмбрионы из агарозы, осторожно отслеживание контура эмбрионов, избегая при этом фактический контакт с эмбрионами самостоятельно.
5. Как только освободили, возвращение эмбрионов яйцо воды (с ПТУ, если это необходимо). Держите их при 28 ° С, пока они не для включения в образ для выражения GFP.

5. Монтаж эмбрионов для работы с изображениями

1. Трансфер эмбрионов из воды яйцо плюс ПТУ в воду яйцо плюс 0,02% tricaine. Дайте несколько минут для анестезии вступили в силу, прежде чем приступить к установке шаг.
2. Подготовка 0,5% раствор с низкой температурой плавления агарозы в яйце воды плюс tricaine в микроволновую печь решение, и затем накладывают раствор в 34-37 ° С инкубатор. Как только температура раствора агарозы имеет уравновешенный, место большое падение (~ 300 мкл) раствора агарозы до центра 35 мм чашки Петри. Добавьте один наркоз эмбриона к этой капли агарозы.
3. Использование тонких щипцы (или штраф концов сократить советы пипетки microloader), положение эмбриона, что они находятся в вертикальном положении, что дает возможность визуализировать спинной стороны развивающегося мозга с прямой микроскоп (в виде перевернутой областей потребует различной геометрии эмбриона, и различные блюда позволяющие визуализации снизу, см. ^12). Укрепить агарозы, поставив блюдо на большую чашку Петри с 2-3 мм льда. Переориентация с мелкими щипцы, вероятно, будет необходимо в течение затвердевания, чтобы эмбрион не упасть на бок.
4. После агарозном укрепил, наводнение блюдо с яйцом воды плюс tricaine обеспечение того, чтобы решение полностью покрывает затвердевшей агарозы капли.

6. Представитель Результаты:

Хотя GFP выражение можно наблюдать уже через 6 часов после электропорации, здесь мы показываем изображения из эмбриона через 4 дня после электропорации, что нейритов структуры клеток-мишеней имеет достаточно развитой. Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 трансгенных усилитель ловушку строке отображается учредительных выражение mCherry (и KalTA4) в задний мозг, мозжечок, передний мозг, и обонятельной луковицы у эмбрионов на 5 дней после оплодотворения (рис. 1А и 1С). Эмбрионы, которые имели UAS-GFP плазмиды экспрессии, объединенных целевых электропорации (как описано выше), показывают, GFP выражение, которое ограничивается клетками обонятельной луковицы развивается (рис. 1В, 1D и 1E). Только клетки transgenically экспрессирующих KalTA4 транскрипционного фактора способны активировать выражения из этого UAS-GFP плазмиды. Включение этой плазмиды в не-трансгенных эмбрионов не приводит к какой-либо обнаруживаемых выражения GFP. Таким образом, совместное действие целевых электропорации UAS-GFP и локализованные трансгенных выражение KalTA4 драйвера, что приводит к эксклюзивным выражением GFP в клетках развивающихся обонятельной луковице. GFP-экспрессирующие клетки показаны типичные аксонального проекции обонятельной луковице митральной клетки (рис. 1B и 1D) ^10. Для того, чтобы визуализировать аксон прогнозы, изображения в рисунок 1B и 1D должны были быть выставлены на высоких уровнях, что области клеточных тел были хорошо передержке. Низкий уровень экспозиции (рис. 1E) показывает, что клетка органы, выражающие GFP действительно локализованы в обонятельную луковицу (ср. рис 1С и 1E;. Серая линия марки границе обонятельной луковице).

Рисунок 1. Целевые GFP выражение в обонятельную луковицу 5 эмбрионов данио DPF. Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) ^hzm5 трансгенных усилитель ловушку линии, показывает учредительные выражение mCherry в задний мозг, мозжечок, передний мозг, и обонятельной луковицы (А и С, mCherry флуоресценции показано красным цветом). Это выражение mCherry опосредовано трансгенных Gal4-выражения. Эмбрионы, которые были электропорации с UAS-GFP вектора экспрессии на 28 HPF, дисплей целевых GFP выражение в обонятельной луковице через 5 дней после оплодотворения (B, D и Е, GFP флуоресценции показано зеленым цветом. Эмбриона же, как в и С). Ниже экспозиции изображение внизу (E) показывает, что GFP выражение ограничено клеточных тел обонятельной луковице. Серая линия обозначает границу обонятельной луковице. Яркий поле (серого), зеленая флуоресценция (зеленый), и красной флуоресценции (красный) изображения были взять с Olympus BX60 флуоресцентного микроскопа.

Обсуждение

Здесь мы описали метод электропорации в естественных условиях в данио, которая использует усилитель ловушку Gal4 трансгенной линии с целевым выражением электропорации трансгенов в конкретных популяцию клеток в развивающемся обонятельной луковице. Такой подход сочетает в себе отличные временным разрешением в естественных условиях электропорации ⁷ с камерного типа конкретное выражение посредничестве усилитель ловушку линий трансгенных ^8. Хотя здесь мы описали адресности обонятельной луковице, в естественных условиях электропорации может быть использована для целевых других регионах развивающейся нервной системы ^2-7, и усилитель ловушку линии доступны с целевых выражение Gal4 в различных специфических типов клеток или тканей ^{8, 11.} Конечно, это электропорации технику также должны быть пригодны для других combinatioral генетические подходы, такие как LexA или Тет системы ^{13, 14, 15.} Главное преимущество электропорации является то, что не нужно делать дополнительные трансгенных линий учетом того, что подходящей Gal4 онлайн доступен. Это экономит шесть месяцев.

В естественных условиях электропорация позволяет включение олигонуклеотидов в нейроны и их прекурсоров на любом конкретном этапе развития нервной системы представляет интерес ^7. Это временное разрешение является особенно выгодным для потерей функции анализа, поскольку он может обойти проблемы, с таргетинга генов, которые имеют существенные функции на более ранних стадиях развития. Метод, который мы опишем здесь также может быть использован включить потерей функции реагентов в том числе RNAi олигонуклеотиды или конструкции и морфолино антисмысловых олигонуклеотидов, ^{4, 7.} Плазмиды управляемой реагентов, таких как доминантно-негативного экспрессии белка плазмид или короткое шпильки RNAi плазмид может быть также взято под контроль Gal4 UAS, что позволяет для точного типа определенную ячейку выражение мы показали здесь для выражения GFP.

Материалы