Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Özet

Uzun zincirli altın Alkan tiyoller oluşan Kendinden monte mono tabakaları (SAMs), protein desen ve hücre hapsi oluşumu için iyi tanımlanmış substratları sağlar. Microcontact baskı ile dolgu takip polidimetilsiloksan (PDMS) damga kullanarak hexadecanethiol glikol-sonlandırılır Alkan tiyol monomer damgalı hexadecanethiol bölgede sadece protein ve hücreler adsorbe bir desen üretir.

Özet

Microcontact baskı doğrudan moleküllerin proteinler, ² DNA'nın, ³ ve silan, ⁴ benliğin oluşumu da dahil olmak üzere çok sayıda yazdırmak için istihdam edilebilir Microcontact baskı iyi tanımlanmış desenli yüzeylerin oluşturulması için hızlı, yüksek oranda tekrarlanabilir ^bir yöntem sağlar 1 monte altın uzun zincirli Alkan tiyoller mono tabakaları (SAMs) proteinleri ve hücreleri özel desenler içeren yapışkan ve dirençli bölgelerde sınırlandırmak için basit bir yol sağlar. Bu hapsi hücre morfolojisi kontrol etmek için kullanılan ve bir dizi protein ve hücre biyolojisi soruları incelemek için yararlı olabilir. Burada, biz hücresel çalışmalar için iyi tanımlanmış bir protein kalıplarının oluşturulması için genel bir yöntem açıklayacağız ⁵ Bu işlemi üç adımdan oluşur: fotolitografi kullanarak desenli ana üretim, bir PDMS damgası oluşturma ve microcontact baskı altın kaplamalı substrat. Bir kez desenli, bu hücre kültürü substratlar hapsetmesi proteinleri ve / veya desen hücreleri (birincil hücreler veya hücre hatları) yeteneğine sahiptir.

Kendinden montajlı tek tabaka kimya protein / hücre desenli yapışkanlı bölgeler ve yapışkan olmayan bölgeler üzerinde tam kontrol sağlar; doğrudan protein damgalama kullanılarak elde edilemez. Hexadecanethiol, microcontact baskı adımda kullanılan uzun zincirli Alkan tiyol, kolayca çözüm protein adsorbe hidrofobik bir yüzey oluşturur. Yüzey baskılı olmayan bölgelerde asfaltlanması için kullanılan glikol-sonlandırılır tiyol, protein adsorpsiyonu dayanıklı ve büyüme bu nedenle hücre bir tek tabaka oluşturur. ⁶ tiyol Bu monomerler tam destek substrat bölgeleri tanımlamak oldukça yapılandırılmış mono tabakaları üretmek protein adsorpsiyon ve hücre büyümesi. Sonuç olarak, bu yüzeylerin oluşturulması mikroelektronik hücrelerarası davranış ⁷ çalışmanın geniş bir uygulama yelpazesi için yararlıdır. ⁸

Tek tabaka kimya diğer türleri trichlorosilanes kullanarak doğrudan cam yüzeylerde desenleri oluşturmak için grup çalışmaları da dahil olmak üzere hücre kültürü çalışmaları için kullanılmış olmasına rağmen, altın Alkan tiyoller oluşan ⁹ desenli mono tabakaları hazırlamak için düz ileri. Ayrıca, tek tabaka hazırlanması için kullanılan monomerlerin ticari, kullanılabilir istikrarlı ve inert atmosfer altında depolama veya işleme gerek yoktur. Alkan tiyoller hazırlanan Desenli substratlar da hücre hapsi korumak, birkaç kez geri dönüşümlü ve yeniden olabilir. ¹⁰

Protokol

1. Desenli Master (Şekil 1) hazırlanması

1. Merkezi Silikon spin-lak gofret gofret ve Tablo 1'de iki zamanlı spin programının ilk adımı sırasında aseton ile durulayın. Aseton, temiz, kuru bir gofret terk spin programının ikinci adımı sırasında buharlaşır.
2. Yaklaşık 1 ml uygulayın AZ9245 Tablo 1'de açıklanan şartlar kullanarak gofret ve spin-kat fotorezist / (çapı).
3. Yumuşak fırında 110 fotorezist kaplı gofret ° C yüksek bir tekdüzelik ocak kullanarak 2 m.
4. Photopattern ya doğrudan yazma fotolitografi sistemi ya da bir maske hizalama sistemi ve uygun maske kullanarak substrat. Maskeler bir dizi ticari kaynaklardan satın alınabilir. Ayrıca, optik bir düz bantlanmış UV emici mürekkep ile basılmış saydamlar büyük özellikleri ile kalıplarını üretmek için kullanılıyor olabilir.
5. 1 m 45 s yavaşça sallanarak yarı-iletken sınıfı deiyonize su: 01:02 400K geliştirici desenli gofret geliştirin. Yarı-iletken sınıfı deiyonize su ve azot (N ₂₎ gaz akışı kuru ile iyice durulayın. Desen geliştirme UV filtresi ile bir mikroskop kullanılarak kontrol edilebilir. Desen tam gelişmiş değilse, gofret, ek süre için gelişmekte olan çözüm iade edilebilir.

Not: En iyi sonuç için, temiz bir ortamda photopatterning yürütülen olmalıdır.

2. PDMS Damga hazırlanması (Şekil 2)

1. 10:1 kilo reçine sertleştirici karışım hazırlayın: Sylgard 182 (PDMS) ve tamamen tek bir petri karışımı ile master (photopatterned gofret) kapsayacak.
2. De-gaz PDMS kaplı kabarcıklar görülebilir ve damga 1,5 saat boyunca 65 ° C'de fırında tedavisi için izin kadar usta bir vakum desikatöre Kür için, önce ana çanak alt yüzeyi de gazla adım sırasında artabilir emin olun önemlidir.
3. Ana dışarı damga PDMS kesin ve uygun boyutu ile düzeltin. Pul, toz ve enkaz korumak için kapalı bir kap (up özelliği tarafı) saklayın.

3. Desenli Altın Yüzey Hazırlama (Şekil 3)

1. No 25 mm hazırlayın. 10 m. oksijen plazma ile onları tedavi için 1 yuvarlak cam metal birikimi lamelleri N ₂ gaz akışı ile her adım arasında kurutma, etanol ile iki kez 18.2 M deiyonize su ile iki kez durulayın.
2. Elektron demeti biriktirme sistemi kullanarak bir çok cep 150 Å altın, mevduat 50 Å titanyum izledi. Titanyum tabakası birikimi ve altın tabakası arasındaki evaporatör havalandırma etmeyin. Alternatif olarak, altın kaplı lamelleri bir tedarikçi çeşitli satın alınabilir, ancak, metal katmanlar, elektron ışını, buharlaşma ve termal değil buharlaşma tarafından hazırlanan olduğu önemlidir. Kullanmadan önce ^11: dışında bir kaynaktan satın aldıysanız, altın substratlar plazma oksidasyon veya "piranha" (% 30 H ₂ O ₂ 07:03 Conc H ₂ SO ₄₎ tarafından temizlenebilir olabilir.

Not: "Piranha" çözüm organik bileşiklerin varlığını patlayıcı.

3. Damgalama çözüm, mutlak etanol içinde 10 mM hexadecanethiol, ve dolgu çözüm, mutlak etanol içinde 1 mM glikol sonlandırılmış tiyol hazırlayın.
4. Etanol ile damga N ₂ gazı ile durulayın ve iyice kurulayın. Tamamen kaplı kadar PDMS damga damla damla çözüm damgalama uygulayın. N ₂ gaz damga ile iyice kurulayın. 5a ve 5b PDMS damga özelliklerine göre uygun olarak devam edin.
5. 1. Altın yüzey üzerine hafifçe damga basın ve tek tabaka oluşturmak için izin vermek için 15 sn
   2. Yüzey batık sağlanması, altın substrat 18.2 M deiyonize su içeren bir petri kaplarına yerleştirin. Altın yüzey üzerine hafifçe damga basın ve tek tabaka oluşturmak için izin vermek için 15 sn
6. N ₂ gazı ile kurutma, her yıkayın ve bir petri substrat yerleştirdikten sonra etanol ile damgalı yüzey iki kez durulayın .
7. Çözüm dolgu Kapak Yüzey ve buharlaşmasını önlemek için parafilm çanak mühür.
8. Arka plan tek tabaka, 12-14 saat süreyle karanlıkta form izin ver
9. Dolgu çözüm desenli lamel çıkarın ve her durulama sonra N ₂ gazı ile kurutma, etanol ile iki defa yıkayınız .

4. Desenli Yüzey Protein ve Hücreler uygulanması

1. 500 mcL 1 Dulbecco'nun Fosfat ml ile küçük bir petri veya hücre kültür odası ve kapak desenli lamel Place (DPBS) Tuzlu Tamponlu. DPBS tamamen hatta protein kapsamı sağlamak için protein inkübasyon sırasında yüzey kapsamalıdır.
2. DPBS protein konsantre bir çözüm ekleyin ve boru çözüm karıştırmakting birkaç kez. Yüzey protein karışımı 37 ° C'de için 1 saat Final laminin ve fibronektin konsantrasyonu tipik olarak sırasıyla 12 mcg / mL ve 20 mcg / ml. Protein kolay desen görünüm için izin amin reaktif floresan boya ile etiketli olabilir. Ancak, protein etiketli, etiketsiz protein ile protein etiketleme 01:01 biyolojik aktivite ile müdahale karıştırılmalıdır.
3. Inkübasyondan sonra, Yüzey kuru veya hava-su arayüzü üzerinden getirmek için özen bağlanmamış protein kaldırmak için DPBS (4 5x) ile yüzey iyice durulayın. Ilk üç durular sonra, ıslak bir zemin korumak için tam bir hücre büyümesi medya yaklaşık 500 mcL ekleyin.
4. Taze medya ile yüzey durulama için kullanılan büyüme ortamı değiştirin.
5. Ilgimiz yüzeye kaplama için hücreleri saymak. CHO-K1 hücreleri gibi hipokampal nöron, ya da hücre hatları ölümsüzleştirdi Ya ayrışmış, birincil hücreler kullanılabilir.
6. Plaka ayrışmış hücreler yüzeye. Genellikle 30 ila 200 hücre / mm ² kullanılır.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1 desenli ana fotolitografik hazırlanması için genel şematik. Bu süreçte, bir silikon yonga, aseton ile temizlenir, ilgi desen maruz fotorezist ile kaplı ve model geliştirilmiştir.

Şekil 2 PDMS pul hazırlanması için Genel şematik. Bu süreçte, desenli ana Sylgard (10:1 reçine sertleştirici) ile kaplıdır, 60 yaşında bir fırın tedavi bir vakum desikatörde ° C de gaz verilerek ve büyüklüğüne göre kesilmemiş.

Şekil 3 substrat desenlendirme için genel şematik. Bu süreçte, cam yüzeyler bir elektron ışını glikol sonlandırılır Alkan tiyoller yeniden toprakla PDMS damga kullanarak microcontact baskı hexadecanethiol tarafından desenli evaporatör, ve floresan etiketli protein ile kaplı titanyum (50A) ve altın (150A) ile kaplıdır.

Şekil 4 Desenli ana (A) ve (B) PDMS damga açıklanan yöntemler kullanılarak hazırlanmıştır. Ölçeği bar 100μm.

Şekil 5 Desenli SAMs AlexaFluor 647 etiketli fibronektin (A) ve CHO-K1 hücre hapsi (B) ile görüntülendi. Ölçeği çubuklar 100 mikron.

Şekil 6 E18 in vitro 4 gün fare hipokampal nöronlar Desenli laminin numaralı seribaşı. AlexaFluor, 350-konjuge anti-laminin antikor desen görselleştirme (A) için kullanılır ve E18 fare hipokampal nöronlar MitoTracker Red 580 (B) ile boyandı. Ölçeği çubuklar 100 mikron.

Şekil 7 desenli yüzey hazırlığının potansiyel tuzaklar AlexaFluor fibronektin adsorpsiyon 647-konjuge tarafından görüntülendi. Düzensiz protein adsorpsiyonu (A) Yetersiz karıştırma yol açar. (B) kısmi patten transferi yol açar damgalama sırasında basınç Düzensiz uygulama. (C) damgalama sırasında aşırı basınç çöküşü damga yol açabilir. (D), durulama sırasında hava ile su yüzeyi desenli yüzey Pozlama arka plan protein adsorpsiyonu neden olabilir. Ölçeği çubuklar 100 mikron.

Şekil 8 - Batık desenlendirme, hava geleneksel microcontact baskı yazdırmak için zor küçük özellikleri ile desen üretebilir. Görüntüler (A) ve (B), aynı desenin farklı bölgelerinde hava aynı PDMS damgası (A) veya deiyonize su (B) ile yazdırılan göstermek. Surround desen (damgası çöküşü önlemeye yardımcı eklendi) 10μm çapında destek hatları (A), ancak resimde gösterildiği gibi küçük nokta özellikleri (B) görmedim. Görülür. Bu hava bu baskı daha geniş özellikler için iyi çalışır, ancak su basarken küçük özelliklere sahip modelleri için gerekli olabilir göstermektedir. Ölçek çubuklar 20 mm.

Devir	Hızlandırma Oranı (dev / s)	Nihai Hızı (rpm)	Zaman (s)
1	500	1000	5
2	3800	3800	30

Tablo 1.İki döngüsü spin program bir silikon yonga üzerinde AZ9245 4,5 mikron kalınlığında kaplama oluşturmak için kullanılır.

Desenli yüzeyler, paslanmaz çeliğin bir ana oluşumu için PDMS pulları hazırlamak için ilk olarak imal edilir (Şekil 1 ve 4A). Ana pulu ters ve ya doğrudan yazma litografi sistemi ya da bir maske hizalama kullanılarak oluşturulur. Gibi AZ9245 olarak olumlu fotorezist, ana üretim için kullanıldığında, karşı kaplı gofret son substrat görünecektir aynı deseni ile ışığa maruz kalmaktadır. Her zaman mümkün olmasa da, PDMS pul ustaları için ideal boy oranı (kalınlığı direnmeye özelliği boyutu) 01:02 olduğu rapor edilmiştir. ¹³ niteliğine bağlı olarak, 1:40 boy oranları mümkün olduğunu bulduk desen. Burada açıklanan koşullar altında AZ9245 kaplı silikon gofret nominal kalınlığı 4.5 mm ile paslanmaz çeliğin vermek. AZ9245 bu kalınlığı> 100 mm 2 mikron arasında değişen özellikleri ile PDMS ustaları üretmek için kullanılan olabilir bulduk.

PDMS pulları fotorezist (Şekil 2) fabrikasyon ana kullanarak Sylgard 182 (veya Sylgard 184) dökme. Rezist ustaları aynı damga birçok kopyalarını oluşturmak için birden çok kez kullanılabilir. Sertleştirme PDMS sonra, pullar, bir tıraş bıçağı ve damga pulu özelliği yan cam lamel (Şekil 4B) koyarak mikroskop altında görüntülenebilmekte kullanarak ana kaldırılır

Floresan etiketli protein (Şekil 3 ve 5) uygulaması ile görülebilmesi keskin, net protein desen Uygun damgalama sonuçlanır. Alternatif olarak, immünhistokimya hücre sabitleme sonra protein deseni (Şekil 6) görselleştirmek için kullanılıyor olabilir. Hücre büyümesi ölümsüzleştirdi hücre hatları ve birincil hücreler (Şekil 5 ve 6) hem de protein desen de sınırlı.

Bu tekniği kolayca hakim olmakla birlikte, bazı ortak sorunlar ortaya çıkabilir. DPBS konsantre bir protein solüsyonu yeterli karıştırma olmadan protein uygulaması düzensiz protein desenleri (Şekil 7A) yol açabilir. Yanlış damgalama kısmi desen transfer veya damga çöküşü (Şekil 7B-C) yol açabilir. Buna ek olarak, hava adsorbe protein içeren arka planda azalmış direnç (Şekil 7D) neden tek tabaka bozabilir desenli substrat ortaya. Çok küçük (<5 mm) ve yüksek boy oranları oluşan desenler çoğu batık microcontact baskı kullanılmasını gerektirir. Bu prosedürü (3.5b) su (Şekil 8) desen dışında yüzeye yatırma hexadecanethiol önlemek için bir bariyer olarak kullanılan ¹⁴

Tartışmalar

Litografik PDMS damgası yaratılması için kullanılan ana üretim sorunları çok sayıda ortaya çıkabilir. Yetersiz pozlama muğlak ve belirsiz desenler ve genişlemiş ya da eksik özelliklere karşı kaplı gofret sonuçlarının aşırı maruz kalma dirençli kaplamalı gofret sonuçları. Genel olarak, küçük özelliklere sahip ustaların photopatterning ve gelişme parametreleri geniş optimizasyonu (fotorezist üretici tarafından önerilen parametrelerin dışına) gerektirebilir büyük özelliği boyutl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Silikon gofret	Gofret Hizmetler düşürmemek		2 inç
Spin lak / sıcak plaka	Brewer Bilim	Cee 200CB Spin-Bake Sistemi
AZ9245 rezist	Mays Chemical Company	105880034-1160
Direct-yazma fotolitografi sistemi	Microtech srl	LW325 LaserWriter Sistemi
Maske Aligner	HTG	3 saat
AZ 400K Geliştirici	Mays Chemical Company	105880018-1160
Sylgard 182 Silikon Elastomer Kiti	Dow Corning
No 25 mm. 1 yuvarlak cam lamelleri	VWR	16004-310
Plazma Oksitleyici	Diener	Femto
Titanyum adet Kamis	Anonim		Saf 99.95%
Altın pelet	Kamis Incorporated		% Saf 99.999
Elektron-ışın evaporatör	Kurt J. Lesker	PVD 75 İnce Film Biriktirme Sistemi	elektron-ışın aksesuar
Hexadecanethiol	Alfa Aesar	A11362
1-mercaptoundec-11-il) tetra (etilenglikol)	Sigma Aldrich	674508
Etanol	Pharmco-aaper	111000200	200 kanıtı, mutlak
Parafilm	VWR	52858-000
DPBS	VWR	4500-434	Kalsiyum ve magnezyum olmadan
Fare Laminin I	VWR	95036-762
İnsan Plazma Fibronektin	Invitrogen	33016-015
AlexaFluor ® 647 karboksilik asit, succinimidyl ester	Invitrogen	A-20006
MitoTracker Kırmızı 580	Invitrogen	M22425
AlexaFluor ® 350 karboksilik asit, succinimidyl ester	Invitrogen	A-10.168
Anti-laminin antikor	Fisher Scientific	AB2034MI