Создание двумерных рисунком Подложки для конфайнмента белков и клеточных

Резюме

Самоорганизующихся монослоев (ЗРК), составленный из длинной цепи алканов тиолов на золото обеспечивают четко определенные субстраты для образования белка моделей и камеру. Микроконтактной печати hexadecanethiol использованием полидиметилсилоксан (PDMS) штамп следует засыпка с гликоля прекращено алканов тиоловых мономера производит шаблон, в котором белки и клетки адсорбировать только штамп hexadecanethiol регионе.

Аннотация

Микроконтактной печати обеспечивает быстрое, очень воспроизводимый метод для создания четко определенных субстратов узорной. Микроконтактной ^{1 Во время} печати можно использовать для непосредственно печатать большое число молекул, включая белки, ДНК, ^{2, 3} и силанов, ⁴ формирование собственного монослоев (ЗРК) с длинной цепочкой алкан тиолов на золото обеспечивает простой способ ограничить белки и клетки для конкретных моделей содержащих клей и устойчивые регионы. Это заключение может быть использован для контроля морфологии клеток и используется для изучения различных вопросов в белке и клеточной биологии. Здесь мы опишем общий метод создания четко определенных белков модели для сотовых исследования ⁵ Этот процесс включает в себя три этапа:. Производство мастер узорной использованием фотолитографии, создание штампа PDMS, и микроконтактной печать золотом покрытие подложки. Как только рисунком, эти субстраты культуры клеток способны ограничиваясь белков и / или клетки (первичные клетки или клеточные линии), чтобы узор.

Использование самоорганизующихся монослоя химии позволяет точный контроль над узорной белок / клетка клей регионов и неклейкой регионах; это не может быть достигнута с использованием прямого штамповки белка. Hexadecanethiol, длинной цепи алканов тиоловых используются на этапе печати микроконтакта производит гидрофобной поверхности, которая легко адсорбирует белка из раствора. Гликоля прекращено тиол, используемый для засыпки непечатные регионов подложке, создается монослой, которая устойчива к адсорбции белка и, следовательно, роста клеток. ^Шесть Эти тиоловых мономеров производят хорошо структурированный монослоев, что точно определить регионы субстрат, который может поддерживать адсорбции белка и роста клеток. В результате этих субстратов полезны для широкого круга приложений от изучения межклеточных поведения ⁷ до создания микроэлектроники ^8.

Хотя другие виды монослоя химии были использованы для исследования клеточных культур, в том числе работы из нашей группы, используя trichlorosilanes для создания шаблонов непосредственно на стеклянных подложках, ⁹ узорной монослоев формируется из алкан тиолов на золото являются прямыми, чтобы подготовиться. Более того, мономеров, используемых для подготовки монослоя имеются в продаже, стабильной, и не требуют хранения или обработки в инертной атмосфере. Узорные субстратов приготовленный из тиолов алканов также могут быть переработаны и использованы повторно несколько раз, сохраняя камеру ^10.

протокол

1. Подготовка рисунком Master (рис. 1)

1. Центр кремниевой пластины на спин-для нанесения покрытий и промойте пластину с ацетоном на первоначальном этапе, из двух циклов спин программы в таблице 1. Ацетон испаряется во время второго этапа программы спина оставляя чистую, сухую подложку.
2. Применить примерно 1 мл AZ9245 фоторезистом / в (в диаметре), чтобы пластины и спин-слой, используя условия, описанные в таблице 1.
3. Soft-печь фоторезиста покрытием пластин при 110 ° С в течение 2 м с использованием высокой однородностью плитой.
4. Photopattern подложке, используя либо прямой записи системы фотолитографии или система маски Aligner и соответствующую маску. Маски можно приобрести у ряда коммерческих источников. Кроме того, прозрачные пленки печатается с УФ-абсорбирующие чернила, приклеенный к оптическим квартиру, могут быть использованы для производства моделей с большими возможностями.
5. Разработка узорной пластины в 1:02 400K Разработчик: полупроводниковые класса деионизированной воды на 1 м 45 с при легком помешивании. Тщательно промойте полупроводниковых класса деионизированной водой и насухо потока азота (N ₂₎ газа. План развития можно проверить с помощью микроскопа с УФ-фильтром. Если картина не полностью разработана, пластины могут быть возвращены в разработке решения для дополнительного времени.

Примечание: Для достижения наилучших результатов photopatterning должны проводиться в чистом помещении окружающей среды.

2. Подготовка PDMS Stamp (рис. 2)

1. Подготовка 10:01 по весу смолы: отвердителя смесь Sylgard 182 (PDMS) и полностью покрывают мастер (photopatterned пластины) с смеси в одноразовых чашках Петри.
2. Де-газ PDMS покрытые мастером в вакуум эксикаторе до исчезновения пузырей видны и позволяют вылечить штамп в духовке при температуре 65 ° С в течение 1,5 ч. До лечения, важно убедиться, что мастер в нижней части блюда, как это может подниматься на поверхность во время дегазации шаг.
3. Вырезать PDMS штамп из мастера и отделки для соответствующего размера. Магазин штамп в закрытой емкости (функция стороной вверх), чтобы защитить его от пыли и мусора.

3. Подготовка основания Золотой рисунком (рис. 3)

1. Подготовка 25 мм нет. 1 раунд покровные стекла для осаждения металлов, рассматривая их с кислородной плазмы на 10 м. Промыть два раза с 18,2 МОм деионизированной водой, а затем два раза с этанолом, сушка с потоком газа N ₂ после каждого шага.
2. Использование нескольких карманных электронно-лучевого напыления системы, депозит 50 титановой затем 150 золотых. Не выход испарителя между осаждением слоя титана и золота слоя. Кроме того, с золотым покрытием покровные могут быть приобретены у различных поставщиков, однако, важно, чтобы слои металла получают путем электронно-лучевого испарения и не термическое испарение. Если купить у внешнего источника, золото подложки могут быть очищены путем окисления плазмы или "пираньи" (7:3 Конц H ₂ SO _4. 30% H ₂ O ₂₎ ¹¹ перед использованием.

Примечание: "Пиранья" Решение взрывчатого вещества в присутствии органических соединений.

3. Подготовка штамповки раствор, 10 мМ hexadecanethiol в абсолютном этаноле, и засыпка решение, 1 мМ гликоля прекращено тиоловых в абсолютном этаноле.
4. Промыть штамп с этанолом и тщательно высушите с N ₂ газа. Применение штамповки решение по каплям штамп PDMS до полного покрытия. Сухой штамп тщательно N ₂ газа. Приступить к 5a или 5b по мере необходимости на основе особенностей штамп PDMS.
5. 1. Осторожно надавите на печать золотой подложке и позволяют формировать монослой в течение 15 сек
   2. Место золотой подложки в чашке Петри содержащего 18,2 МОм деионизированной воды, обеспечивая субстрат водой. Осторожно надавите на печать золотой подложке и позволяют формировать монослой в течение 15 сек
6. Промыть штамп подложки в два раза с этанолом, сушка с N ₂ газа после каждого полоскания и место субстрата в чашке Петри.
7. Обложка подложки с обратной засыпки решение и печатью блюдо с парафильмом для предотвращения испарения.
8. Разрешить фоном для формирования монослоя в темноте в течение 12-14 ч.
9. Удалить узорной покровное от засыпки раствора и прополоскать в два раза с этанолом, сушка с N ₂ газа после каждого полоскания.

4. Применение белков и клеток на рисунке субстрат

1. Место узорной покровное в маленькой чашке Петри или в камере культуре клеток и покрытие с 500 мкл в 1 мл фосфатного Дульбеко буферного раствора (DPBS). DPBS должна полностью покрывать субстрат во время инкубации белка для обеспечения равномерного покрытия белка.
2. Добавить концентрированный раствор белка DPBS и перемешать раствор трубыTing в несколько раз. Инкубируйте белковая смесь с подложкой при температуре 37 ° С в течение 1 ч. Заключительные концентраций ламинина и фибронектина, как правило, 12 мкг / мл и 20 мкг / мл, соответственно. Белки могут быть помечены амин реактивной флуоресцентного красителя, что обеспечивает удобство визуализации картины. Тем не менее, меченого белка следует смешивать 1:1 с немеченого белка, как белка маркировки может повлиять на биологическую активность.
3. После инкубации промыть субстрат тщательно DPBS (4-5x) для удаления несвязанных белков, осторожно, чтобы не сухой субстрат или привести его в воздух-вода. После первых трех полосканий, добавить примерно 500 мкл полной СМИ рост клеток для поддержания мокрой поверхности.
4. Замените питательной среды использовали для полоскания подложки со свежей информации.
5. Диссоциируют и посчитать клетки для нанесения покрытий на подложку. Либо диссоциированных первичные элементы, такие как нейроны гиппокампа, или увековечены клеточные линии, например, СНО-К1 клетки, могут быть использованы.
6. Пластина диссоциированных клеток на подложке. Обычно от 30 до 200 клеток / мм ² используются.

5. Представитель Результаты:

Рисунок 1. Общая схема для фотолитографии подготовке мастер узорные. В этом процессе, кремниевой пластины очищают ацетоном, покрытых фоторезистом, подвергается картина интересов, а также картины развивается.

Рисунок 2. Общая схема подготовки штамп PDMS. В этом процессе, мастер узорной покрыта Sylgard (10:1 смола: отвердитель), де-газом в вакуум-эксикаторе, вылечить в духовке при температуре 60 ° С, а нарезанная по размеру.

Рисунок 3. Общая схема для подложки рисунка. В этом процессе, стеклянные подложки покрывают титана (50а) и золота (150A) с помощью электронного пучка испарителя, узорчатое по микроконтактной печати hexadecanethiol использованием штампа PDMS, засыпаны гликоль прекращено тиолов алкана, и покрыты флуоресцентно меченых белков.

Рисунок 4. Рисунком мастера () и PDMS штамп (B) подготовлен с использованием описанных методов. Шкала бары 100 мкм.

Рисунок 5. Рисунком ЗРК визуализированы с AlexaFluor 647-меченый фибронектин (А) и СНО-К1 камеру (В). Шкала бары 100 мкм.

Рисунок 6. Рисунком ламинин засеяно E18 мыши нейронов гиппокампа на 4 дня в пробирке. AlexaFluor 350-сопряженных анти-ламинин антител Образец используется для визуализации () и E18 мыши нейронов гиппокампа окрашиваются с MitoTracker Красная 580 (В). Шкала бары 100 мкм.

Рисунок 7. Потенциальные ловушки в узорной подготовки субстрата визуализируется AlexaFluor 647-сопряженных фибронектина адсорбции. () Недостаточное перемешивание приводит к неравномерному адсорбции белка. (B) Неравномерное применение давления во время штамповки приводит к частичной передаче Паттен. (C) Избыточное давление во время штамповки может привести к краху штамп. (D) Воздействие на узорной поверхности воды интерфейс воздуха во время промывки может привести в фоновом режиме адсорбции белка. Шкала бары 100 мкм.

Рисунок 8. Подводная структурирование может производить модели с мелкими чертами, которые трудно печатать обычными печати микроконтактной в воздухе. Изображения () и (Б) показывают, различных регионов по той же схеме, напечатанной с тем же штампом PDMS в воздухе () или деионизированной воды (B). 10 мкм всей линии поддержки, которые окружают картины (добавлено, чтобы предотвратить крах штамп) рассматриваются в (), однако, меньше точки функции, как показано в (Б) не видно. Это свидетельствует о том, что печать в воздухе хорошо работает для больших возможностей, но печать в воде может быть необходимо для моделей с меньшими возможностями. Шкала баров 20 мкм.

Цикл	Ускорение скорости (об / сек)	Конечная скорость (оборотов в минуту)	Раз (а)
1	500	1000	5
2	3800	3800	30

Таблица 1.Два цикла спин Программа использовалась для создания 4,5 мкм покрытия AZ9245 на кремниевой пластине.

Для подготовки PDMS штампов для образования узорной субстратов, мастер в фоторезист первой сфабрикованы (рис. 1, 4А). Мастер обратная печать и создается с помощью либо прямой записи системы литографии или маски Aligner. При положительном фоторезиста, например, AZ9245, используется для производства мастер, сопротивляться покрытием пластины под действием света с той же схеме, которая появится на окончательный субстрат. Хотя это не всегда возможно, было сообщено, что идеальным соотношением сторон (функция размера, чтобы противостоять толщины) для мастеров штамп PDMS 1:2. ¹³ Мы обнаружили, что пропорции 1:40 возможны, в зависимости от характера узора. AZ9245 покрытием пластин кремния в условиях, описанных здесь дают фоторезиста с номинальной толщиной 4,5 мкм. Мы обнаружили, что эта толщина AZ9245 может быть использована для производства PDMS мастеров с функциями, начиная от> 100 мкм до 2 мкм.

PDMS марки отлиты из Sylgard 182 (или Sylgard 184) с помощью мастера изготавливают из фоторезиста (рис. 2). Фоторезист мастера могут быть использованы несколько раз, чтобы создать много копий одного и того же штампа. После затвердевания PDMS, штампы удаляются из мастер использованием лезвия бритвы и в результате штамп может быть визуализированы под микроскопом, поставив штамп стороне особенность вниз на стекло покровное (рисунок 4B)

Правильное штамповки приводит к резкому, четкой закономерности белок, который может быть визуализированы с применением флуоресцентно меченых белков (рис. 3 и 5). Кроме того, иммуногистохимии могут быть использованы для визуализации белка картина после фиксации клеток (рис. 6). Рост клеток хорошо ограничивается белка шаблон для увековечены клеточных линий и первичных элементов (рис. 5 и 6).

Хотя этот метод легко освоить, несколько общих проблем может возникнуть. Применение белка без достаточного перемешивания концентрированного раствора белка в DPBS может привести к неравномерному модели белка (рис. 7а). Неправильное штамповки может привести к частичной передаче шаблон или штамп распада (рис. 7B-C). Кроме того, выставляя узорной субстрата, содержащего адсорбированные белки в воздухе может привести к нарушению монослоя вызывая уменьшилось сопротивление в фоновом режиме (рис. 7D). Шаблоны состоят из очень маленьких особенностей (<5 мкм) и высокой пропорции часто требуют использования подводных микроконтактной печати. В этой процедуре (3.5b) вода используется в качестве барьера для предотвращения hexadecanethiol от сдачи на подложку за пределами шаблона (рис. 8). ¹⁴

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Ряд вопросов может возникнуть в литографических производство мастер использовал для создания штампа PDMS. Недодержка из сопротивляться покрытием пластин приводит туманные и нечеткие модели и переоблучения противостоять покрытие пластин приводит к увеличении или отсутствие возможно?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Кремниевая пластина	Вафельные Reclaim услуги		2 дюйма
Спиновые для нанесения покрытий / плитке	Брюер науки	Cee 200CB Спин-Выпекать системы
AZ9245 Фоторезист	Мейс Chemical Company	105880034-1160
Прямая запись фотолитографии системы	Microtech SRL	LW325 LaserWriter системы
Маска Aligner	HTG	3hr
Я 400K разработчика	Мейс Chemical Company	105880018-1160
Sylgard 182 Kit Эластомер Силиконовый	Dow Corning
25 мм нет. 1 раунд покровные стекла	VWR	16004-310
Плазменные окислителя	Динер	Фемто
Титан части Камис	Объединенные		99,95%
Золото гранул	Камис Объединенные		99,999% чистой
Электронно-лучевой испаритель	Курт Дж. Lesker	PVD 75 Тонкие системы осаждения фильм	с электронно-лучевой аксессуар
Hexadecanethiol	Альфа Aesar	A11362
1-mercaptoundec-11-ил)-тетра (этиленгликоля)	Sigma Aldrich	674508
Этанол	Pharmco-aaper	111000200	200 доказательства, абсолютные
Парафильмом	VWR	52858-000
DPBS	VWR	4500-434	Без кальция и магния
Мышь Ламинин я	VWR	95036-762
Плазменные человек Фибронектин	Invitrogen	33016-015
AlexaFluor ® 647 карбоновой кислоты, сукцинимидил эфир	Invitrogen	-20006
MitoTracker Красный 580	Invitrogen	M22425
AlexaFluor ® 350 карбоновой кислоты, сукцинимидил эфир	Invitrogen	-10168
Анти-ламинин антител	Fisher Scientific	AB2034MI