Spesifik genlerin aşırı ekspresyonu veya demonte sonra Ramos B Hücreleri somatik hipermutasyon Değerlendirilmesi

Özet

Biz aşırı ekspresyonu veya shRNA insan Ramos B-hücre hattı ve bu hücrelerin nasıl somatik hipermutasyon ölçmek için yapıları içeren. Retroviral veya lentiviral enfeksiyonları nasıl gerçekleştirileceği tarif

Özet

V (D) J rekombinasyon tarafından oluşturulan düşük afinite antikorları B hücreleri ile onların yaşam başlar. Ancak, bir patojen tespit üzerine, immünglobulin (Ig) geninin değişken (V) bölgesinde yüksek afiniteli antikorlar ^1,2, yaklaşık 100.000 kat daha fazla somatik hipermutasyon (SHM) ile genomun geri kalanından daha mutasyona uğramış olan. Buna ek olarak, sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS), belirli bir patojen için gerekli olan immün yanıtın türüne bağlı olarak farklı efektör fonksiyonları ile antikor üretir. Hem KSS ve SHM uracils üretmek için DNA'da sitozin kalıntılarının deaminates aktivasyonla indüklenen sitidinin deaminaz (AID), tarafından başlatılan. Bu uracils sonuçta, mutasyon ^ve 1-3 rekombinasyon, tamir yollarının hata eğilimli formları tarafından işlenir .

SHM ve CSR moleküler ayrıntıları mevcut anlayış farelerde çalışmaların bir kombinasyonu gelen, birincil hücreler, hücre hatları ve hücre-free deneyler. Fare modelleri birçok onarım faktörler (örneğin UNG, Msh2, Msh6, Exo1 ve polimeraz η) ^4-10 için kritik roller gösteren genetik tırnakları ile altın standart olmaya devam etmektedir. Ancak, bütün genleri nakavt çalışmaları için mükellef bulunmaktadır. Örneğin, birkaç çift iplikli sonu onarım proteinleri tırnakları embryonically ölümcül veya B-hücre gelişimi ^11-14 bozar. Ayrıca, bazen SHM veya KSS bir proteinin belirli bir işlevi nakavt neden daha fazla küresel hasar maskelenmiş olabilir. Buna ek olarak, farelerde deneyler bu yana aday ^genler 15-18 tanımlanması ve karakterize hücre hatları tek tek genlerin ifadesi giderek daha popüler bir ilk adım haline gelmiştir değiştirerek, uzun süreli olabilir .

Ramos - yapısal SHM uğrar Burkitt lenfoma hücre hattı - SHM ^18-24 incelemek için popüler bir hücre-line model olmuştur. Ramos hücrelerinin bir avantajı yerleşik rahat yarı olmasıSHM, nicel bir ölçüsüdür. Vahşi tip hücreleri mutasyonlar, bazı mutasyonların IgM ifade knock out pick up, IgM ifade ve. Bu nedenle, floresan ile aktive olan hücre tarama (FACS) IgM kaybı assaying SHM düzeyi için hızlı okuma sağlar. SHM daha nicel ölçümü doğrudan antikor genleri sıralama elde edilebilir.

Ramos hücreleri transfect zor olduğundan, biz istikrarlı ve türevleri üretmek, sırasıyla aşırı ekspresyonu kaset ya da kısa bir saç tokası RNA (shRNA), ya içeren retroviral veya lentiviral yapıları hücrelerini enfekte artış ya da bireysel bir gen ifade düşürdü. Burada, biz Ramos hücreleri enfekte ve sonra SHM (Şekil 1) belirli genlerin rolünü araştırmak için bu hücrelerin nasıl kullandıklarını açıklar.

Protokol

1. Örnekleri ve hücrelerin hazırlanması

1. DNA (midiprep) aşırı ekspresyonu veya shRNA içeren yapıları ve retroviral ambalaj vektör pKat2 veya lentiviral ambalaj vektörler pVSV-G, pMDLg / pRRE ve pRSV-Rev ²⁵ orta ölçekli bir hazırlık gerçekleştirin . Her bir yapı için 6 mg DNA ve ya pKat2 pVSV-g, pMDLg / pRRE her 4 mg (retroviral enfeksiyonları için) veya 1.5 mg DNA ve pRSV-Rev ambalaj vektörler (lentiviral enfeksiyonlar için) kullanın.
2. Bosc 23 medya hazırlayın. Transfeksiyon için, düzelmeyen Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM) yanı sıra tam DMEM kullanın. Tam DMEM yapmak için, DMEM bir şişe% 1 Hepes tampon,% 1 penisilin-streptomisin-glutamin (PGS), ve% 10 yeni doğmuş buzağı serumu (NCS) ekleyin.
3. Ramos ortam hazırlayın. Enfeksiyon adım için,% 1 Hepes,% 1 PGS ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) RPMI bir şişe ekleyerek orta RPMI-1640 (RPMI) tamamlamak. Tek hücre tohumlama adım, m, 2 gün boyunca tam RPMI Ramos hücreler büyüyor, 4 dakika için 400 X g hücreleri down iplik ve steril bir şişeye filtresi 0.2 mikron ile süpernatantı filtreleme AKE "klimalı" medya. Diğer eksiksiz bir medya gibi, klimalı ortam gereklidir 4 ° C 'ye kadar saklanır.
4. , Hücrelerin% 50-60 gün Transfeksiyondan confluency olacağını gün önce transfeksiyon kadar 10 ml tam DMEM 100 mm plaka Bölünmüş 3 x ¹⁰ 6 Bosc 23 hücreleri . Transfecting planı her bir vektör için hücrelerin bir tabak olun. Kültür hücreleri çok uzun süre tutuldu olması önemlidir; düşük geçiş sayısının hücre ya da son zamanlarda çözülmüş hücrelerin transfeksiyon ve iyi bir enfeksiyonu sigorta için enfeksiyon adımları kullanın.
5. Deneyler için kontroller içerir. Transfections ve enfeksiyonlar için, bir negatif kontrol (untransfected veya bulaşmamış hücreleri) ve pozitif kontrol (GFP ve puromycin direnç geninin ifade virüs) oluşturun. ShRNA knock-down exper içiniments, şifreli veya alakasız shRNA kontrolü ile iyi bozar.

2. Bosc 23 hücreleri Transfecting

1. 37 düzelmeyen DMEM ve tam DMEM şişe Sıcak ° C
2. Bosc 23 hücrelerden ortamı çıkarın ve 5 ml tam DMEM ile değiştirin. Adım 2.6 'da kullanıma kadar 37 ° C inkübatör hücrelerin dönün.
3. 5 dakika sonra kısaca vorteks (<1 saniye), oda sıcaklığında FuGENE 6 şişe ısıtın.
4. 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe kısım 600 mcL düzelmeyen DMEM.
5. 600 mcL düzelmeyen DMEM, vorteks kısa bir süre (<1 saniye) içine 30 mcL FuGENE 6 seyreltilir ve sonra beş dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Medya doğrudan pipetle dikkatli olun. FuGENE 6 tüp kenarlarına temas etmesine izin vermeyin.
6. DMEM / FuGENE 6 karışımı, girdap bri 6 mg inşa ve ya 4 mg pKat2 (retroviral enfeksiyonları) veya 1.5 mg pVSV-G, pMDLg / pRRE her, ve pRSV-Rev (lentiviral enfeksiyonlar) ekle sonra efly (<1 saniye) ve 25 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
7. Bosc 23 hücrelere DNA / 6 DMEM / FuGENE karışımı ekleyin ve 24 saat boyunca 37 ° C inkübatör dönmek.
8. 24 saat sonra, 5 ml tam DMEM transfekte hücreler eklemek ve başka bir 24 saat süreyle 37 ° C inkübatör dönmek.

3. Viral parçacıkların Hasat

1. 10 ml, 10 ml şırınga ile transfekte Bosc 23 hücreleri medya Hasat.
2. 0.45 mikron şırınga sonuna kadar filtre takın ve temiz bir 15 ml'lik polipropilen tüpe medya filtre.
3. -80 Viral medya hemen kullanın veya 1 ml, 2 ml kriyojenik flakonlarda alikotları olarak dondurmak ° C
4. Viral medya hasat sonra, verimli transfeksiyon FACS pozitif kontrol hücrelerinde meydana geldiğini teyit etmektedir. Inşa floresan (örneğin, GFP) ya da bir hücre yüzey işaretleyici (örneğin Thy1) ya içeriyorsa Bu aynı zamanda tüm örnekler için yapılabilir.

itle "> 4 Enfekte B hücreleri

1. 6 plaka enfeksiyon 24 saat önce içine tam RPMI 2 x 10 ⁵ hücre / ml Ramos hücreleri Tohum 2 ml. Yine, iyi enfeksiyon sigortalamak için düşük geçit sayısı hücreleri veya son çözülmüş hücreleri kullandığınızdan emin olun.
2. Virüsün dondurulmuş alikot kullanıyorsanız, 37 hızla viral medya Çözülme ° C
3. , 10 mg / ml polybrene 3 mcL 1 ml viral medya karıştırın. Polybrene son konsantrasyon 10 mg / mL, 3 mL hacimde olmalıdır.
4. Hücrelere pipetleme tarafından virüs / polybrene karışımı ekleyin ve iyice karıştırın. 1 ml tam RPMI ve 3 mcL polybrene iyi yerine 1 mL virüs ekleyin; gibi daha önce, biri de bulaşmamış olduğu bir kontrol olarak kullanılan olmalıdır. Eşleştirilmiş bir negatif kontrol ile iyi bir bulaştırmak için emin olun. Ayrıca FACS enfeksiyonu etkinliğini belirlemek için, GFP içeren bir vektör ile iyi bir bulaştırmak.
5. 3000 X g de 90 dakika oda sıcaklığında 6 plaka santrifüjleyin.
6. Plaka dön.48 saat boyunca 37 ° C inkübatör.
7. 4 dakika oda sıcaklığında 48 saat sonra, 400 X g 15 ml polipropilen tüp içinde enfekte olan hücreleri aşağı doğru döndürün. Hücre pelletini rahatsız emin olmak, aspirasyon medya çıkarın. Taze RPMI hücrelerin tekrar
8. FACS pozitif kontrol örneği enfeksiyon verimliliğini onaylayın. Daha önce olduğu gibi, inşa floresan (örneğin, GFP) ya da bir hücre yüzey işaretleyici (örneğin Thy1) ya içeriyorsa tüm örnekler için yapabilirsiniz.
9. (Uygunsa) hücre seçimi başlayın. Bizim shRNA içeren yapıları bir puromycin direnç kaset içerir. Biz 0.25 mikrogram / mL puromycin ile shRNA enfekte Ramos hücreleri seçin. Biz Ramos hücreleri türevleri bazen puromycin duyarlılık değişmiş göstermek ve bu nedenle, biz her türevi puromycin konsantrasyonu optimize etmek için eğriler öldürmek gerçekleştirmek bulabilirsiniz. Ayrıca bu seçimin etkin olduğunu onaylamak için puromycin bulaşmamış kontrolü hücreleri tedavi.

5. Tek hücreli tohumlama

Tek ekim iki yöntemden biri uygulanabilir: sıralama veya elle FACS.

1. FACS: tohum, 1 hücreli bir tabak adaptörü ile kullanın / FACS sıralayıcı iyi bir 96 plaka% 40 RPMI/40%% klimalı media/20 FBS 100 mcL ile önceden doldurulmuş. Bu yöntem çok daha tek bir hücre klonlar plaka başına verir.
2. Elle: hücreleri sayın. % 40 RPMI/40%% klimalı media/20 FBS 10 hücre / ml 'ye bir kısım hücreler sulandırınız. Seyreltilmiş hücrelerin her numaralı seribaşı plaka için 10 ml kullanın. Farklı klonlar, bu nedenle birkaç plakaları farklı konsantrasyonlarda (3 ila 20 hücre / ml 'ye kadar) kurmak için yararlıdır, bu aşamada değişken kurtarma gösterecektir. Birden fazla hücre doğan klonların önlemek için daha az çıkıntılar) üreten birini kullanın. 100 mcL ile seyreltilmiş hücrelerinin tohum 96-iyi plakalar, çok kanallı pipet kullanın.
3. 2 hafta boyunca 37 ° C inkübatör tabak yerleştirin.
4. Bireysel kuyular kontrol under hücrelerinin varlığı tohumlama bir gün sonra onaylamak için mikroskop. Tek hücreler doğru derinlikte odaklanma ihtiyacı nedeniyle bulmak zor olabilir. 96-plaka altındaki baskılı iyi sayılar üzerinde yoğunlaşırken yardımcı olacaktır. Hücreleri çoğu kuyu hücre beri FACS sıralayıcı numaralı seribaşı bulmak daha kolay.
5. 2 hafta sonra, büyüyen koloniler zor, alttan plakaları bakarak çıplak gözle görülebilir. Bunlar mikroskop altında görmek çok daha kolay. Kolonileri farklı kuyularda aynı kenarı boyunca büyümeye bir tabak iyi ve tipik koloniler kenarlarında büyümek eğilimindedir. Mark sağlam hücre büyümesi ile kuyu ve 1 ml RPMI 24 kuyucuğu hücreleri transferi ve 37 ° C inkübatör dönmek.
6. 1 x 10 1 - ⁵ x 10 ⁶ hücre / ml hücreleri koruyun. 4 dakika oda sıcaklığında 400 X g hücreler eğirme ve gerektiği gibi medya kaldırarak medya değiştirin. 1 ml taze RPMI ile değiştirin.
7. Birkaç d sonrabüyüme AYS, 6 plaka hücreleri transferi ve 37 ° C inkübatör büyümeye devam.
8. 3 hafta sonra, klonlar IgM kaybı (aşağıda açıklandığı gibi) için analiz eder.
9. 2 hafta boyunca hücreler büyümeye devam eder ve daha sonra 5 haftalık bir zaman noktasında klonlar yeniden analiz.

6. Analizi: IgM kaybı (3 hafta ile 5 hafta)

1. Kısım 5 x 10 ⁵ 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe her kuyudan hücreleri ve oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g hücreleri aşağı doğru döndürün. Lekesiz bir kontrol için shRNA-knock-down kontrol ve kuyu her hücrelerin yanı sıra bir numune kullanın.
2. 1 mL PBS hücrelerin yıkayın ve sonra oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g tekrar döndürebilirsiniz.
3. 50 mcL, PBS (lekesiz kontrolü) veya PBS içinde süspanse edin + PE-etiketli α-insan IgM antikoru seyreltme 01:20. 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.
4. 4 dakika oda sıcaklığında 400 X g hücreleri aşağı spin.
5. C yıkayın400 X g PBS ve spin 4 dakika için 1 ml oda sıcaklığında her zaman iki kere arşın.
6. PBS 100 mcL supernatant ve tekrar süspansiyon haline getirin çıkarın. Yeniden süspanse boyanan hücreler FACS tüpüne aktarın.
7. FACS makine kullanarak hücrelerin analiz edin.
8. ShRNA çaldı aşağı hücreleri vs kontrolleri hücrelerin IgM yüzde karşılaştırın. Daha önce de belirtildiği gibi, gibi FACS tarafından ölçülen IgM kaybı Ramos hücreleri içinde SHM güvenilir bir yarı-nicel bir ölçüsüdür.

7. Analiz: kantitatif RT-PCR (5 hafta) knock-down onaylayın

1. Kısım 3 x 10 ⁶ Her kuyudan hücreleri ve oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g de aşağı doğru döndürün.
2. RNA hücre kısım hazırlayın. Biz üretici tavsiyelerine göre TRIzol kullanın.
3. RNA hazırlık cDNA hazırlayın. Biz üretici tavsiyelerine göre 2 mikrogram RNA ve Üstsimge II.
4. CDNA doğrulayıcı için kantitatif PCR gerçekleştirinm tak-down. Biz 10 mcL toplam reaksiyon hacmi bir normalleşme kontrolü ve SYBR FAST qPCR kiti gibi GAPDH kullanın.

8. Analiz: Genomik sıralama (5 hafta)

1. Kısım 5 x 10 ⁶ Her kuyudan hücreleri ve oda sıcaklığında 4 dakika için 400 X g de aşağı doğru döndürün.
2. Bu hücrelerden genomik DNA izole edin. Biz üretici tavsiyelerine göre Wizard SV genomik DNA saflaştırma kiti kullanın.
3. PCR, Ig V ^{genleri 19} (Tablo 1) ve ilgi KAPA HiFi DNA polimeraz kullanarak herhangi bir diğer genler genomik DNA yükseltmek . Biz düşük hata oranları nedeniyle bu polimeraz kullanabilirsiniz, ancak herhangi bir yüksek sadakat PCR Polimeraz kabul edilebilir olmalıdır.
4. Jel QIAquick jel ekstraksiyon kiti kullanarak% 1 agaroz jel üzerinde PCR ürünleri arındırmak.
5. Diğerleri yok iken bazı polimerazları, PCR ürünleri 3 'uçları tek bir deoksiadenozin (A) kalıntı eklemek. Bu 3 'A kuyrukları TOPO TA için gerekli olanklonlama adımı. KAPA HiFi polimeraz 3 'A kuyrukları bırakmaz. A-tail, 72 ° C'de 30 dakika süreyle 3 mcL 10x Taq reaksiyon tamponu, 1 mcL 10 mM dNTP ve 1 birim Taq polimeraz 25 mcL jel saflaştırılmış PCR ürünü kuluçka PCR ürünleri.
6. TOPO TA Klonlama kiti kullanılarak jel saflaştırılmış PCR ürünleri klonlama. Sağlanan E. TOPO reaksiyon ürünleri Dönüşümü coli DH5α-T1 ^R 100 mcg / ml ampisilin ve üretici tavsiyelerine göre 1.6 mg X-gal ile desteklenmiş içeren LB / Agar plakaları yetkili hücreleri ve plakası.
7. Sıralama için ayrı ayrı koloniler gönder.
8. Türleri ve mutasyonlar yerleri belirlemek için dizi analizi yapın.

9 - Temsilcisi Sonuçlar:

Önce de belirttiğim gibi, biz, hem de GFP yanı sıra bir puromycin direnç geninin ifade pozitif kontrol viral vektör kullanın. Genellikle iki günde% 50-75 GFP ⁺ hücrelertransfeksiyon sonra. Enfeksiyonlarda, genellikle% 50-70 oranında hücreler enfeksiyon ⁺ iki gün sonra ancak seçim öncesi GFP bakın. Seçimi tamamlandıktan sonra, hücrelerin>% 95 GFP ^+.

Temsilcisi deneyler olarak, eksprese YARDIM veya Ramos hücrelerinde tamir faktörü aşağı vurma etkilerini göstermektedir. Özellikle, biz Bosc 23 hücre içine retroviral ambalaj vektör pKat2 birlikte Thy1.1 bir IRES sitesi ile bağlantılı YARDIM retroviral aşırı ekspresyonu vektör transfekte. Virüs içeren medya süzüldükten sonra Ramos hücreleri enfekte etmek için kullanılır oldu. Her iki vahşi tip (WT) ve YARDIM eksprese ^(AID hi) hücreleri tek hücre (Şekil 3 QRT-PCR (Şekil 2) ve IgM FACS tarafından kaybı için gen ekspresyonu için analiz edildi ve bu noktada, tohumlari ve 3 hafta boyunca yetişen .) FACS boyama için, hücreler PE-etiketli α-insan IgM antikoru yanı sıra 1:400 sulandırılmış FITC etiketli α-sıçan CD90/mouse seyreltilmiş hem de 1:20 ile inkübe edildi.CD90.1 (Thy1.1) antikoru. Ayrı bir deneyde, ya ilgisiz bir shRNA (kontrol) veya karşı shRNA SHM karşı korumak için beklenen bir hi-fi DNA tamir faktörü içeren lentiviruses Bosc 23 hücreleri yapıldı ve ardından YARDIM ^hi klon Ramos hücrelerinin içine bulaşmış. Yine, gen ekspresyonu (Şekil 4) ve IgM kaybı (Şekil 5) 3 hafta sonra, tek bir hücre klonlar olarak incelendi. Tamir faktörü SHM sırasında mutasyonlar karşı koruma sağlamak için düşünülen bu yana, biz faktör yokluğunda IgM kaybı ve SHM bir artış görüyoruz. Biz nakavt, SHM ile ilişkili mutasyonlar üreten ilgili bir faktör olsaydı, bunun yerine IgM kaybı bir azalma gördük.

Beklendiği gibi, Mah-PCR sonuçları, YARDIM ifade aşağıdaki YARDIM aşırı ekspresyonu vektörü (Şekil 2) ile hücrelerin enfeksiyonu belirgin bir artış göstermektedir, bu faktör karşı hedef shRNA varlığında DNA tamir faktörü damla düzeyleri (Şekil 4 .) Çünkü bireysel clonees değişebilir, gen ekspresyon düzeylerinde bazı değişiklikler görebilirsiniz. Gen ekspresyonu değişebilir, çünkü daha fazla analiz planı her klon ifade onaylamak için gereklidir. Aynı gen karşı farklı shRNAs yanı sıra, bu nedenle en büyük etkiye sahip olduğunu belirlemek için çeşitli shRNAs ekranı olmalıdır gen ekspresyonu üzerinde farklı etkileri olabilir. Demonte de immün protein düzeyinde teyit edilebilir. Benzer şekilde, bireysel klonlar IgM kaybı seviyeleri büyük ölçüde değişebilir. Bazı klonlar bir IgM mutasyon erken hücre bölünmeleri birinde meydana gelen bir "jackpot" etkisi göstermektedir - örneğin, hücrelerin IgM oldu çünkü>% 50 IgM kaybı ^{göreceksiniz} - İki hücre aşamasında . Birkaç tek hücre klonları için medyan hesaplanırken bu klonların etkisi en aza indirilmiştir.

Şekil 1 şematik için transIgM kaybı infeksiyonu, enfeksiyon ve analizi. Ayrıntılar için metne bakınız.

Şekil 2 Ramos hücreleri YARDIM aşırı ekspresyonu. WT ve YARDIM ^hi Ramos hücreleri bireysel klonlar noktası YARDIM ifade QRT-PCR ile ölçüldü klonlanmış ve 3 hafta boyunca yetişen, tek bir hücre. GAPDH ifade normalleşmesi için kullanılmıştır. WT 1 ile kurulmuştur. Medyan değeri belirtilir. * P değeri <0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir.

WT hücrelere kıyasla Şekil 3 YARDIM ^hi hücrelerin IgM kaybı Artan. Yüzey IgM 3 haftalık bir zaman noktasında FACS tarafından ölçüldü ve IgM kaybı yüzde WT ve YARDIM ^hi hücreleri için hesaplanmıştır. (A) WT klon ve YARDIM ^hi klon Temsilcisi FACS arsa. YARDIM aşırı ekspresyonu vEctor YARDIM IRES sitesi üzerinden Thy1.1 ile bağlantılı, bu yüzden ifade Thy1.1 YARDIM ifade için bir vekil olarak kullanılır vardır. (B) IgM kaybı birkaç WT ve YARDIM ^hi klonlar kantitasyonu. Medyan değeri belirtilir. * P değeri <0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir.

Şekil 4 YARDIM ^hi hücreleri tamir faktörü demonte. Hücreler ya da ilgisiz bir shRNA kontrolü (kontrol) veya ilgi shRNA (shRNA) ve tek bir hücre numaralı seribaşı ile infekte edildi. 3 hafta sonra, bireysel klonlar gen ekspresyonu QRT-PCR ile ölçüldü. GAPDH ifade normalleşmesi için kullanılmıştır. WT 1 ile kurulmuştur. Medyan değeri belirtilir. * P değeri <0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir.

Şekil 5. Artan IgM kaybıYARDIM ^hi bir onarım faktör-devrildi seviyeleri ile hücreleri. 3 haftalık bir zaman noktasında FACS çeşitli klonlar Yüzey IgM ölçüldü ve hücreleri hala eksprese YARDIM IgM kaybı yüzdesi hesaplanır. Medyan değeri belirtilir. * P değeri <0.01, bir kuyruklu Student t-test olarak hesaplanan gösterir.

Ig genleri ¹⁹ Tablo 1. Primer dizileri sürekli bölge Cμ, ağır zincir V bölgesi (V _H), ve hafif zincir V bölgesi (V _L).

Tartışmalar

Daha önce tartışıldığı üzere, antikor çeşitlendirilmesi için hücre hattı modelleri, antikor çeşitlendirilmesi sırasında farklı adımlar etkiler roman proteinleri tespit etmek için popüler bir başlangıç ​​noktası haline gelmiştir. Biz burada, Ramos, B-hücre hattı viral enfeksiyon ya knock-aşağı veya eksprese proteinlerine kullanmak için bir yöntem mevcut ve sonra SHM üzerindeki etkisini incelemek.

Bu çalışmalar için, biz WT Ramos ve YARDIM ^hi

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
6-net TC ile tedavi edilen levhalar	Corning	3516
10 ml BD Luer-Loksyringes	BD Tıp	309604
24-iyi net TC-tedavi plakalar	Corning	3526
TC-96-net bir düz dipli polistiren tedavi mikropleytin	Corning	3596
100 mm TC-tedavi kültür kaplarına	Corning	430167
Acrodisc şırınga filtreler, 0.45 mikron	Pall Yaşam Bilimleri	4604
Agar	Teknova	A7777
Agaroz	GeneMate	E-3120-500
Ampisilin	Sigma	A0166	100 mg / ml suda
BD FACSCanto II akış sitometresinde	BD Biosciences		ya da benzer
BD Falcon yuvarlak alt polistiren tüpler	BD Biosciences	352054	FACS için
Bosc 23 hücreleri	ATCC	CRL 11270
37 yeteneğine sahip CO 2 inkübatör ° C
DMEM (Dulbecco modifiye Eagle orta)	Sigma	D6429
FBS (fetal sığır serumu)	İkizler Bio-Ürünler	100-106
FITC α-rat CD90/mouse CD90.1 antikor	BioLegend	202503	FITCa-Thy1.1
FuGENE 6 Transfeksiyon Reaktif	Roche	11814443001
HEPES tamponu çözümü	Invitrogen	15630-080
KAPA HiFi DNA polimeraz	KAPA Biyosistem	KK2101
LB Broth (lysogeny suyu - Luria) Pudra	Difco	240230
MİSYON TRC shRNA bakteriyel gliserol stoku	Sigma		shRNA vektörler
NCS (yeni doğmuş buzağı serumu)	İkizler Bio-Ürünler	100-504
PBS (fosfat tampon çözelti)	Invitrogen	70011	1x su içinde seyreltilir
PE α-insan IgM antikoru	BioLegend	314508
PGS (penisilin-streptomisin-glutamin çözüm)	İkizler Bio-PÜ r ü nler	400-110
Polybrene (hexadimethrine bromür)	Sigma	107689	Suda 10 mg / ml
PureYield Plazmid Midiprep Sistemi	Promega	A2495
Puromycin	Sigma	P8833	250 mg / ml suda
QIAquick jel ekstraksiyon kiti	QIAGEN	28706
Ramos (RA 1) hücreleri	ATCC	CRL-1596
RPMI-1640 ortamı	Sigma	R8758
Üst Simge II.	Invitrogen	18064-022
SYBR FAST qPCR kiti	KAPA Biyosistem	KK4601
Taq DNA Polimeraz	Invitrogen	18038-042
TOPO TA Klonlama kiti	İnvitrogen	K4520-01
TRIzol	Invitrogen	15596-026
Sihirbazı SV Genomik DNA arıtma sistemi	Promega	A2361
X-Gal [5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside]	Growcells	C-5687	DMSO 40 mg / ml