Neurosphere Testi İnsan Glioblastoma Multiforme Tümör Hücreleri İzolasyon ve Genişleme

Özet

Bu video protokolü neurosphere tahlil kültürü yöntemi kullanılarak insan glioblastoma mutliforme cerrahi rezeksiyon (GBM) tümör dokusu hücreleri gibi izolasyon ve kök genişlemesi göstermektedir.

Özet

Kök-benzeri hücrelerin tümörleri, meme, akciğer, kolon, prostat ve beyin gibi izole edilmiştir. Kritik bir konu, özellikle glioblastoma mutliforme (GBM), tüm bu tümörler, tümör oluşumu, ilerleme ve nüks rollerini araştırmak için tümör başlatarak hücre popülasyonu (lar) belirlemek ve yalıtmak için. Anlama tümör hücre popülasyonlarının başlatarak bu tümörler için etkili tedavi yaklaşımları bulmak için ipuçları sağlayacaktır. Sadeliği ve tekrarlanabilirlik nedeniyle neurosphere assay (NSA), bu tümör hücrelerinin birçok izolasyon ve yayılması için tercih edilen bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, cerrahi rezeksiyon insan GBM tümör dokusu kök benzeri hücreler izole etmek ve genişletmek için neurosphere kültür yöntemi göstermektedir. Prosedürleri bir başlangıç ​​kimyasal sindirim ve tümör dokusu mekanik ayrılma, ve daha sonra NSA kültürü ortaya çıkan tek bir hücre süspansiyonu kaplama içerir. 150-2, 7-10 gün sonra birincil neurospheresÇapı 00 mikron gözlenen ve daha Pasajlanması ve genişleme için hazır olabilir.

Protokol

1. Temel GBM Doku toplanması

1. Glioblastoma mutliforme (GBM), tümör, kanser tanısı ve ameliyatı geçiren bir hastanın elde edilir.
2. Nöroşirürji takım düzenlemeler yapılmalıdır. Beyin cerrahı, nöral kök hücre (MGK),% 10-15 antibiyotikler (Peniciline / Streptomisin) ile desteklenmiş bazal orta içeren uygun bir boyut tüp rezeke GBM tümör koyacaktır. Soğuk ortamda laboratuarı tarafından ameliyathaneye sağlanmalıdır. Alternatif olarak, soğuk Hepes-tamponlu minimum esansiyel orta (HEM) ve fosfat tamponlu salin (PBS) yüksek antibiyotik konsantrasyonu ile de bu amaçla kullanılabilir.
3. Rezeke edilen tümör dokusu buz üzerinde laboratuara teslim edilir ve kaputun altında yerleştirilir.

2. Tek Hücre Süspansiyon içine Primer Tümör Disosiyasyon

1. Orijinal orta / PBS Aşırı şahin tüp çıkarılır ve örnek 5-10m ile 2-3 defa yıkanır.PBS / MGK bazal orta l kan ve enkaz kaldırmak için. PBS / Orta kaldırılır ve GBM tümör dokusu bir Petri kabı yerleştirilir.
2. Dokusu küçük parçalar halinde kesilir ve trypsinization işlemi için yüzey alanını artırmak için küçük parçalar halinde 10 numaralı neşter bıçağı ile kıyılmış. Kıyma tümörün büyüklüğüne bağlı olarak 1-3 dakika sürebilir.
3. Kıyılmış doku önceden ısıtılmış% 0.05 tripsin-EDTA az 10-15 dakika boyunca 37 ° C su banyosunda 3-5ml tripsinize. Bir elektronik pipet 15 ml Falcon tüp içine küçük tümör parçaları ve tripsin aktarmak için kullanılır.
4. Inkübasyon döneminden sonra enzimatik tripsin reaksiyonu durdurmak için eşit miktarda soya tripsin inhibitörü eklenir.
5. Birkaç kez aşağı süspansiyon pipetleme ve tripsin inaktivasyon tarafından sağlanmaktadır. Sonra, süspansiyon 5min için 800rpm (110g) santrifüj pelet.
6. Süpernatant atılır ve doku parçaları steril MGK ba 1ml yeniden süspansesal orta. Kümeleri hafifçe düzgün bir sütlü tek hücre süspansiyonu elde edilene kadar (3-7 kat) aşağı yukarı pipetleme ve ayrışmış. Pipetleme adımların sayısı kıyılmış doku parçacıklarının büyüklüğü doğrudan bağlıdır. Uzun ve güçlü mekanik ayrılma, hücre ölümü ve kürenin oluşumunda bir azalma meydana gelebilir kaçınılmalıdır.
7. Un-ayrışmış parçaları ve enkaz kaldırmak için, 10-15 ml bazal orta tüp eklenir ve hücre süspansiyonu 50ml tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden geçirilerek süzülür.
8. Süzülmüş süspansiyon 5min 800rpm (110g) santrifüj edilir. Süpernatant daha sonra atılır.
9. Pelletted hücreler daha sonra yeniden süspanse hücre sayımı için tam MGK orta 1-2ml.

3. Hücre Sayımı ve Kaplama

1. Hücre süspansiyonu 10 mcL 0.04% Tripan mavi bir 1ml Eppendorf tüp içinde 90 mcL eklenir.
   Not: diğer uygun hücre dilüsyonuAfin grup de kullanılıyor olabilir.
2. Süspansiyonu karıştırmak için pipet ve aşağı yukarı. Hücre yoğunluğu saymak için 10 hücre / tripan mavi karışımı mcL hemasitometre aktarılır.
3. Hücreler,% 0.2 heparin (2μg/ml) 20ng/ml EGF, 10 ng bFGF ve 1μl/ml ile desteklenmiş tam MGK orta (MGK bazal, orta ve MGK proliferasyon takviyesi 09:01 oranında bir karışımı) kaplama. uygun doku kültürü gemiler. Orta, 5, 20 ve 40 ml, T25, T80 ve T175 şişeler için kullanılır. Antibiyotikler, kontaminasyon olasılığını azaltmak için 1:100 konsantrasyonda orta eklenebilir.
4. Balon, 37 ° C ve% 5 _CO 2 inkübatör sette yer almaktadır .

4. GBM elde edilen küre Pasajlanması ve genişleme:

1. Neurospheres ortalama büyüklüğü 150-200 mikron çapında ulaştığında, kültür altkültürü için hazırdır. Her balonun içeriği uygun bir boyut steril Tiss kaldırılır ve yerleştirilirue kültür tüp ve 800 rpm (110 gr) oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj.
2. Süpernatant kaldırılır ve pelet 1 ml% 0.05 tripsin-EDTA yeniden süspanse.
3. Optimal bir trypsinization ulaşmak için, hücre süspansiyonu, 37 ° C'de 2-3 dakika süreyle su banyosunda inkübe edilir. Tripsin faaliyeti durdurmak için soya tripsin inhibitörü eşit hacimli hücre süspansiyonu ilave edilir ve hücre süspansiyonu hafifçe aşağı yukarı pipetlenir ve.
4. Hücre süspansiyonu için 800 rpm (110g) 5 dakika santrifüj edilir. Sonra, süpernatantı kaldırılır ve hücrelerin MGK orta 1 ml yeniden süspanse.
5. Daha önce açıklandığı gibi bir hücre sayımı yapılır.
6. Hücrelerinin büyüme faktörleri ve uygun büyüklükte doku kültürü damarlarda önceki bölümde açıklandığı gibi kaplama ile takviye tam MGK orta 5x10 ⁴ hücre / ml konsantrasyonda kaplanmıştır.
7. Nemli bir 37 ° C inkübe Ortaöğretim neurospheres 7-10 gün içinde oluşur% 5 CO ₂ ified inkübatör.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

GBM tümör dokusu hasat tek hücre kaplama sonra, tümör kök hücrelerinin hızla çoğalmasına ve (video ve bkz. Şekil 1), 3-4 gün içinde birkaç hücreden oluşan küçük hücre kümeleri oluşturmak. Bu kümeler büyüdükçe, onlar 150-200 mikron formu (video ve Bakınız Şekil 2) ortalama çapı 7-8 gün böylece daha küresel bir şekil, uygun faz parlak küreler kazanır. Yüksek büyütme, sağlıklı küreler genellikle çevre microspikes göstermektedir. Kültür başlatılması, kültür binging olmayan ayrışmış kümeleri varlığı nedeniyle ve gerçek bir küre gibi karıştırılmamalıdır sonra 1-2 gün içinde kümeler gibi büyük bir küre olması. Primer tümörün küre kültür enkaz miktarı ilk doku kaynağı bağlı olarak değişir ve çevresindeki beyin dokusu içerir olsun ya da olmasın. Uygun doku hazırlama tekniklerienzimatik ve mekanik ayrılma ve örnek sonraki filtrasyon dahil olmak üzere yeterli miktarda orta kültür az enkaz neden olabilir.

Şekil 1. Primer GBM küre kaplama 4 gün sonra kültür. Tümör kök benzeri hücreler çoğalmaya başlar ve 3-4 gün içinde küçük hücre kümeleri oluşturmak. Orijinal büyütme, 20x.

Şekil 2 Passage kaplama 8 gün sonra bir GBM kültür alanında. Orijinal büyütme, 20x.

Tartışmalar

Normal yetişkin ve fetal beyinleri ^{1, 2, 3, 4,} nöral kök ve progenitör hücreler izole etmek için ve kök ^gibi, 5 ^{akciğer, prostat} 6 7, göğüs ^{ve beyin 8,} 9 gibi kanserli dokuların hücreleri neurosphere tahlil da tümör olmuştur sık tercih edilen yöntem olarak kullanılmaktadır. Ex vivo multipotency, implantasyon üzerine yeni tümörler oluşturmak için yeteneği ve kendini yenileme, bu basit ve tekrarlanabilir testi kullanılarak, bir somatik kök hücreler olarak benzer özellikler göstermektedir rezeke edilen tümör dokusu hücreleri belirsiz bir sayıda üretebilirsiniz. Bu hücreler, hücre-hücre etkileşimleri, ve farklılaşma, göç, istila ve hücre ölümü de dahil olmak üzere temel kanser hücre biyolojisi çalışma olabilir. Buna ek olarak, izole tümör kök hücrelerinin tümörleri, form, ilerleme ve nüks ve aynı zamanda çalışma sonunda tedavi için bilgi verebilir altta yatan kaynaklanan hücresel mekanizmaları aydınlatmak için paha biçilmez bir araç sağlar.seçenekleri.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Tip	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
NeuroCult MGK Bazal Orta (İnsan)	Orta	Stem Cell Teknolojileri	05750
NeuroCult MGK Silahların Yayılmasını Önleme Takviyeler (İnsan)	Orta ek	Stem Cell Teknolojileri	05753
% 0.05 tripsin-EDTA	Reaktif	Gibco	25300-062
* MEM	Reaktif	Gibco	41500-018	HEM bileşeni
* Hepes	Reaktif	Sigma	H4034	HEM bileşeni
* Damıtılmış su	Reaktif	Gibco	15230-147
** DNaz I	Reaktif	Roche	104159
** Soya tripsin inhibitörü	Reaktif	Sigma	T6522
Pen / Strep	Reaktif	Gibco	15140-122
No: 10 neşter bıçak	Cerrahi alet	BD	371610
Petri Dish	Kültür eşya	BD Falcon	353003
Küçük forseps	Cerrahi aletler	Güzel Bilim Araçları	11050-10
Hücre süzgeç	Elek	BD Falcon	352340
T25 şişesi	Kültür eşya	Nalge Nunc uluslararası	136196
T80 şişesi	Kültür eşya	Uluslararası Nalge Nunc	178905
15 ml tüpler	Kültür eşya	BD Falcon	352096
50 ml tüpler	Kültür eşya	BD Falcon	352070
EGF	Büyüme faktörü	Ar-Ge	2028-EG
b-FGF	Büyüme faktörü	Ar-Ge	3139-FB
Heparin	Büyüme faktörü	Sigma	H4784	PBS içinde Sulandırılmış