Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

Özet

Tohum bulaşmasını mantarlar tarafından tahılların yıkım daha iyi bitki-patojen etkileşimleri anlamak için sayısız araştırma çabaları açtı. Bir laboratuvar ortamında tohum-mantar etkileşimleri çalışmak için, mantar üretimi, biyokütle, ve çekirdek biyoanalizlerin kullanarak mikotoksin kontaminasyonu ölçümü için sağlam bir yöntem geliştirdi.

Özet

Tarafından tahıl çürüyen tohum bulaşmasını mantarların insan ve hayvan sağlığı için ciddi riskler söz değil, tahıl üretimini dünya çapında büyük ekonomik mücadelelerinden birisidir. Tahıl üretimi arasında, mısırın tahıl bütünlüğü ve mikotoksin tohum kontaminasyon patojen kaynaklı zararlar nedeniyle, belki de en çok etkilenen üründür. Mısırdan yetiştiricileri ve gıda ve yem işlemciler için iki en yaygın ve sorunlu mikotoksinler sırasıyla Aspergillus flavus ve Fusarium verticillioides tarafından üretilen aflatoksin ve fumonisin, vardır.

Moleküler bitki-patojen ilişkileri son yıllarda yapılan çalışmalara mantar enfeksiyonu ve mikotoksin kontaminasyonu ^1,2,3,4,5,6 için bitki cevabı ile birlikte özel mekanizmalar anlamada umut göstermiştir. Birçok laboratuvar bitki-patojen ilişkileri incelemek için çekirdek testleri kullandığınızdan, farklı biyolojik parametreleri hesaplamak için bir standart yöntem için bir ihtiyaç, bu nedenle oradaFarklı laboratuvarlarda elde edilen sonuçlar çapraz yorumlanabilir. Tohumlar üzerinde kantitatif analiz için sağlam ve tekrarlanabilir araçlar için, mantar üremesi, biyokütle, ve mikotoksin kirliliği ölçmek için in-lab çekirdek testleri ve sonraki yöntemleri geliştirmişlerdir. Dört sterilize darı çekirdekleri bir fungal süspansiyon (10 ⁶⁾ ile cam şişe içinde aşılanmış ve önceden belirlenmiş bir süre boyunca inkübe edilir. Numune şişeleri daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), bir AflaTest florimetre yöntemi kullanılarak aflatoksin miktar ve HPLC ile fumonisin kantifikasyon tarafından hemositometre, ergosterol tabanlı biyokütle analizi ile Konidyumların sayımı için seçilir.

Protokol

1. Mısırda Çekirdek Biyoassay

1. İki hafta önce, kültür 28. Patates Dekstroz Agar (PDA) üzerinde fungal patojenlere ° C
2. Onlar biyoassay şişeleri alt hizasına, ve 50 ml falcon tüpleri yer yatıyordu nedenle tercihen yassı, benzer büyüklüğü ve şekli ile çekirdekler seçin. Seçilen çekirdeklerde benzer tohum yaşı ve metaboliti kompozisyonu sağlamak için aynı ortamda aynı anda yapılmış olmalı.
3. 6% sodyum hipoklorit ile% 70 etanol, steril su ile 1 dakika ile 10 dakika ile 5 dakika için oda sıcaklığında tüpler çalkalayarak çekirdekler sterilize yüzey. Devam sallayarak ise steril su ile, her zaman 5 dakika, üç kez yıkayın. Otoklavlanmış havlu kuru Pat çekirdekler.
4. Aspergillus flavus enfeksiyonu kolaylaştırmak için, 0.5 cm derinlikteki 18 G iğne ile embriyo-tarafında küçük bir yara oluşturur. Ancak, deneyimlerimiz daha büyük bir yara verticillioides Fusarium enfeksiyonu için gereklidir. Therefore, 0.5 mm derinlikte embriyo tarafı oyulmuş bir tıraş bıçağı kullanın.
5. Sporlar kurtarmak ve otoklavlanmış tülbentten en az 4 kat üzerinden filtreleme yerçekimi tarafından misel kaldırmak için otoklavlanmış% 0.01 Tween-20 çözümü yaklaşık 5 ml kültür plakaları sıyırarak inokulum süspansiyon hazırlayın. Hemositometre ile spor konsantrasyonu hesaplayın ve 10 ⁶ spor / A. ml uyum flavus veya F. verticillioides. Diğer türler patojen veya ana bilgisayar kullanıyorsanız, uygun enfeksiyon için inokulum konsantrasyonunun değerlendirilmesi önemlidir.
6. Kağıt havlu beş yaprak ve steril 100 ml su ile kaplı bir plastik kap (29.2 cm X 18.7 cm X 8.3 cm) bir nem odası oluşturun. Odası değil su veya hava geçirmez ve ilave su kağıt havlular nemli tutmak için deney boyunca ilave edilmelidir.
7. Yeri dört bir otoklavlanmış 20 ml cam sintilasyon şişeye çekirdekleri ve bunların kitle kaydedin. , 200 ul spor süspansiyonu ile inokülekap ve süspansiyon ile eşit kat çekirdeklerinde girdap. Serbestçe nem odasına hava değişimi ve yer sağlamak için kapakları gevşetin.

Not: tohumlar ya da bu yöntemler de tarif edilenden başka mantarlar için, inokulum gerekli miktarını farklı olabilir ve deneysel olarak elde edilmelidir.

8. ° C'de 7 gün boyunca 28 ya da arzu edilen kadar bir 12-h-light/12-h-dark ışık periyodu altında çekirdekler inkübe.

2. Konidyumların Enumeration

1. Enfeksiyon döneminden sonra, 1 dakika boyunca iyice enfekte çekirdekleri ve vorteks içeren sintilasyon şişelere otoklavlanmış% 0.01 Tween-20 5 ml ekleyin.
2. Geniş çaplı bir pipet kullanarak, hemen% 0.01 Tween-20 (veya enfeksiyon bağlı olarak gerektiği gibi sulandırmak) 1.8 ml içeren 2.0 ml Eppendorf tüplere spor süspansiyon iki ayrı 200 ul hacimde transfer ederek sulandırın.
3. Bir hemositometre ⁴ ile iki kez 200 ul tablet numaralandırve tedaviler arasında Konidyumların düzeylerini karşılaştırmaktır.

3. Aflatoksin Niceleme

1. % 80 metanol ve 0.05 g NaCl, 1 dakika süreyle yüksek bir hızda kapak ve karışım 20 ml ile 1 numuneden 50 ml blender kabına çekirdekler ekleyin.
2. Temiz bir koleksiyon geminin üzerinde bir oluklu filtre kağıdı yerleştirin ve filtre içine özü dökün.
3. Temiz bir gemiye süzüntü 10 ml transfer, 20 ml saf H ₂ O ekleyin ve iyice karıştırın.
4. Temiz bir kap içine bir 1.5 mikron cam mikro filtre ile filtre örneği.
5. Afla Testi kolonuna süzüldü ekstresinin 1 ml uygulamak ve sıkıştırılmış hava kullanarak, boşaltılır kadar 1-2 damlası / saniye arasında bir oranda kolonundan süzüldü özü zorlar.
6. Distile H ₂ O 1 ml ile iki kez sütun yıkayın ve damla / saniye hava yoluyla gelene kadar 1-2 de sütun geçer.
7. Damla / bir cam küvet içinde toplanan ikinci sınıf bir anda 1-2 1ml 100% HPLC saflıkta metanol ile Zehir sütun.
8. Eklemek1 eluat için Afla Testi Geliştirici ml ve iyice karıştırın. Yer kalibre florimetre içine küvet ve 60 sn okuyun.

Not: Aflatest FGIS protokolünün kullanıldığı zaman, gelen florimetre ölçümü 100 ml ekstre numunenin bir ilk 50 gram dayanarak hesaplanır. Eğer su ile seyreltme örneğin göz önüne alınırsa, 1 ml numunesinin 0,166 gram temsil eden bir kolonuna tatbik edildi. Yani, protokol değiştirirken, hesap içine örneklem büyüklüğü farklılıkları ve ilk ekstraksiyon çözeltisi almak gerekir. Örneğin, çekirdeklerin 2 gram 20 ml% 80 metanol içinde ekstre edilir. Bu, 0.1 gr / ml 'dir. Bu örnek 1 ml 2 ml su ile karıştırılmış olduğu zaman, sıvı numune oranı artık 0,033 gram / ml 'dir. Bu örnek 100 ppb arasında bir florimetre okuma verirse, gerçek konsantrasyon, ppb = (0,166 gram X 100 ppb) / 0.1 gram), ya da 166 ppb olan 0,166 için numune oranı, dayanmaktadır. Alternatif aflatoksin Niceleyici içinkatyon yöntemleri, kaynak 7 bakın.

4. Fumonisin B1 (FB1) Analizi

1. Mantar misiri yetiştirilen edildiğinde, agitasyon olmadan, oda sıcaklığında asetonitril / su (50/50, v / v) 10 ml bir gece boyunca örnekleri özü. Daha sonra, deiyonize su (6 ml) ile özü (2 ml) bir karışımı, ve C-18 katı faz çıkarımı ile doğrudan (8 ml) bir karışımı, bu geçerlidir.
2. Örnek yüklemeden önce, şart 2 ml su, ardından 2 ml asetonitril ile durulanması ile C-18 sütunu katı faz ekstraksiyonu.
3. Örnek yerleştirilmesinden sonra, kolon Asetonitril / su (15/85, v / v) ve 2 ml ardından 2 ml su ile yıkanır. HPLC analizi (FB1 içeren) için örnek asetonitril / su (70/30, v / v) 2 ml ile elüt edilmektedir.
4. 0.1 ml borat tamponu (0.05 M borik acid/0.05 M sodyum borat [50/50, v / v], pH 8.5) ve 0,1 ihtiva eden bir şişeye kolon eluat, 0.1 ml aktararak o-phthaldehyde (OPA) ile FB1 türevlendirmek ml OPA (aseton içinde 0.1 mg / mlmerkaptoetanol) -% 0.5 'i ile itrile.
5. Acetonitrile/0.01 M borik asit (40/60, v / v) ile 0.5 ml ilave edilerek 10 dk sonra reaksiyon durdur.
6. Analitik bir Zorbax ODS kolon (4.6 150 mm) ve Değişken dalga boylu Shimatzu RF-10Axl floresans dedektör (eksitasyon 335 nm / 440 nm emisyon) ile donatılmış bir Shimadzu HPLC LC-20AT sisteminde FB1 analiz edin.
7. A lineer gradyan kullanılır (çözücü A: acetonitrile/0.1 M sodyum fosfat (40/60), pH 3.3; çözücü B: asetonitril / 0.1 M sodyum fosfat (60/40), pH 3.3) olup aşağıdaki gibidir ve gradyan programı: % 100 A 5 dakika süre ile 10 dak,% 100 B,% 100 B.
8. HPLC ile analiz FB1 standartlarına ve pik alanı ölçümleri standart eğri oluşturmak için kullanılır. Daha sonra, FB1 standart eğri ile pik alanları karşılaştırılarak bir örnek FB1 seviyesini ölçmek.

5.. Ergosterol Analizi

1. 7-14 gün için mısır taneleri Kültür mantarı.
2. Met: inkübasyon süresinden sonra, kloroform ile 10 ml ilaveHer şişe içinde anol (02:01, hac / hac). Bir kez eklendi, ve numuneler çalkalanır ve daha sonra 24 saat için oda sıcaklığında karanlıkta şişeleri inkübe edilir.
3. 24 saat sonra, numuneler santrifüj edilir ve süpernatan toplamak ve 0.45 um Naylon zar filtresinden.
4. Doğrudan 4.6 U ODS-C18 kolon (200 Å, 250 ± 4.6 mm) ve Shimadzu SPD-20A / UV 282 nm de izlemek için ayarlanmış VIS detektör ile donatılmış bir Shimadzu HPLC LC-20AT sisteme örnek enjekte.
5. 1.5 ml / min mobil faz olarak bir akış hızında metanol (% 100) kullanılır. HPLC dereceli ergosterol üretilen standart eğrisine örneklerin pik alanları karşılaştırılarak örneklerinde ergosterol miktar belirleyin.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Iki üç gün için bir nem odası, aşılama ve inkübasyon ardından, mantar üremesi çekirdekleri görünmeye başlaması gerekir. Yedi gün tedavi sonrası, tedavi edilen bitkiler üzerinde vejetatif büyümeyi, whil açıkça görünür olmalıdıre sahte denetimleri (Şekil 1B, üst) bulaşmamış olmalıdır. Uzun kuluçka dönemleri daha bol bitki büyümesi (Şekil 1B, alt) için elverişli. Koşullar altında burada tarif (Şekil 2G), A. flavus vahşi tip NRRL sırasıyla 8, 6, ve 8 gün, az kolonizasyon, aflatoksin birikimi ve Konidyumların üretim 3357 görüntülenen maksimum değerleri (Şekil 2, AC). Ancak, mikotoksin kontaminasyonu ve conidiation ergosterol birim kıyaslandığında, yüksek seviyelerde (Şekil 2, DE) sırasıyla 4 ve 6 gün gözlendi. Şekil 2F bu mantar biyokütle bağımlı maksimum değer gözlemler özetlemektedir. İlginçtir, 4-6 gün sonrası aşılama arasında, çekirdekler gibi zaman ders (Şekil 2H, alt) örneklerinden total RNA tarafından görülen nükleik asit yıkımı, uğrarlar.

Kendi de dahil olmak üzere çeşitli çalışmalar, postmena vared F. verticilliodies mısırdan çekirdekleri ^{2,8,9,10,11,12} üzerinde enfeksiyon ve başarıyla zaman noktaları gözlemler gibi 7-13 gün kullanılır. Yöntemleri kullanarak burada anlatılan, 3,500-8,000 ng / g çekirdek ^4,13 ve ergosterol seviyeleri gelen fumonisin seviyeleri fumonisin (üstte) ve ergosterol (alt için 5.000-10.000 gelen ng / g çekirdek ^14,13. Şekil 3 temsilcisi zirveleri ) HPLC kromatogramları gelen. Ergosterol ölçüm da absorbans spektrumları ¹⁵ aracılığıyla gerçekleştirilebilir.

Şekil 1. Fungal biyokütle, sporogenesis ve mikotoksin üretimi ve çekirdek biyoanalizlerin gelen vejetatif büyüme temsilcisi sonuçlarının ölçülmesi için akış çizelgesi. Mısırdan çekirdeklerde fungal patogenezi değerlendirmek için kullanılan temel biyolojik parametreleri ölçümü için açıklanan yönteme özetleyen A) akış çizelgesi. B) Temsilcisiçekirdek biyoanalizlerin için sonuçlar. Top, A. flavus (NRRL3357) B73 genetik arka planda mısırdan çekirdeklerde vejetatif büyümeyi. Tohumlar 10 ⁶ spor / ml ve resimlerin 200 ul 7 gün sonrası aşılama çekildi ekildi. Alt, F. verticillioides B73 plan 13 gün sonrası enfeksiyon çekirdekler aşılandı. Çekirdekler 10 ⁶ sporların / mL 'lik 200 ul ile inoküle edildi.

Şekil 2. Aspergillus flavus çekirdek biyoassay zaman tabii. B73 çekirdekler 10 ⁶ sporların / ml Aspergillus flavus konidial süspansiyonun 200 ul ile aşılandı ve 2-8 gün (G) inkübe edildi. (Ortalama ± SE n = 3-4) tüm değerler 4 çekirdeklerin kuru ağırlığının ortalama belirlenmiştir. A) Colonization (ergosterol dayalı), (B) aflatoksin, ve (C) conidiation yukarıda açıklanan yöntemler kullanılarak ölçüldü. E) Aflatoksin ve (F) conidiation gösterilirh ergosterol vasıtasıyla ölçülmüş olarak fungal biyokütle bir fonksiyonu olarak. F) ergosterol, aflatoksin birikimi ve fungal biyokütle bir fonksiyonu olarak conidiation için maksimum değerler - her türlü miktar için maksimum değerleri% 100 olarak gözlendi. Zaman dersten toplam RNA kulvar için (H) 1 mg.

Şekil 3. Fumonisin B1 (üstte) ve Fusarium verticillioides (M3125) ile enfekte çekirdekleri izole ergosterol (alt) Temsilcisi Yüksek Performans Sıvı Kromatografi (HPLC) kromatogramları.

Tartışmalar

Burada anlatılan yöntemler kapsamlı test ve fungal kolonizasyon, sporogenesis ve mikotoksin üretimi için ölçülebilir sonuçlar nesil sağlam olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, bu yöntemler mycotoxigenic mantarların (örn. yer fıstığı, buğday, pamuk, fıstık vb) ile kontaminasyon duyarlı olan diğer bitki türlerinin tohumları için geçerli olmalıdır. Yetkili bitki-patojen etkileşimi analizleri için, tohumların yaşatılması şarttır. Tohum canlılığını korurken çekirdeğin embriyo tar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	# Kataloğa
Patates Dekstroz Agar	Fisher Scientifc	S71659A
Tween-20	Fisher Scientifc	BP337-100
Plastik inkübasyon konteyner	Sterilite	1713LAB06
Karıştırıcı	Vicam	20200
24 cm Yivli Filtre Kağıtları	Vicam	31240
1.5 mikron cam mikrofiber	Vicam	31955
Afla Testi sütununda	Vicam	G1024
Afrla Testi Geliştirici	Vicam	32010
Metanol	Vicam	35016
Asetonitril	Fisher Scientifc	AC14952-0025
Etanol	Fisher Scientifc	AC39769-0025
C-18 katı faz ekstraksiyon kolon (Hazırlık Eylül SPE C18 Sütun)	Fisher Scientifc	60108-304
O-fitalaldehit (OPA)	Sigma Chemical Co	79.760-5g
Asit borik	Fisher Scientifc	BP168-500
Sodyum borat	Fisher Scientifc	RDCS0330500
Merkaptoetanol	Fisher Scientifc	45-000-231
Shimadzu HPLC LC-20AT (Pompa)	Shimadzu Scientific Instruments, Inc	LC-20AT
Zorbax ODS kolon (4.6x150mm)	Agilent Technologies	443905-902
Shimatzu RF-10Axl floresans dedektör	Shimadzu Scientific Instruments, Inc	RF-10AXL
Sodyum fosfat	Fisher Scientifc	AC38987-0010
FB1 standartları	Sigma Chemical Co	F1147-1mg
Kloroform	VWR	MK444410
0,45 um Naylon zar (HPLC) ile 13 mm şırınga filtresi	Pall Hayat Bilgisi	4426
Ergosterol	Sigma-Aldrich	45.480-50G-F
Sintilasyon şişeleri	VWR	66021-602
Sodyum klorür	Vicam	G1124