Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

Özet

Beyin kan damarlarının gelen yapışık inflamatuar lökositlerin izolasyonu için bir yöntem Plasmodium berghei ANKA ile enfekte olmuş fareler tarif edilmektedir. Yöntemi flow sitometri ile floresan antikorlar ve müteakip analizler ile boyanarak miktarının yanı sıra izole lökositlerin fenotipik karakterizasyonu sağlar.

Özet

Biz P. beyin kan damarlarından yapışık inflamatuar hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu için bir yöntem tarif berghei ANKA-enfekte fareler. Deneysel serebral sıtma indüksiyon, bir nörolojik sendromu bu parazitin suşu sonuçlar duyarlı fare suşlarının enfeksiyonu insanlarda ^1,2 Plasmodium falciparum aracılı şiddetli sıtma özetlediği bazı önemli yönleri olduğunu. Kan aşama sıtma Olgun formlar vasküler endotel hücreleri ile bağlamak sağlar enfekte eritrosit, yüzeyi üzerinde parazit proteinleri ifade eder. Bu süreç hipoksi ve kanamalar ³ sonuçlanan kan akımında engel indükler ve aynı zamanda parazit sekestrasyon sitesine inflamatuvar lökositlerin işe uyarır.

Diğer enfeksiyonlar, örneğin neutrotopic virüsler ^4-6, sıtma-parazitlenmiş kırmızı kan hücreleri (pRBC) yanı sıra ilişkili yatkın aksine, hemekspirayon lökositlerin kan damarları içindeki yerine beyin parankimi infiltre daha münzevi kalır. Böylece non-inflamatuar dolaşan hücre, organ çıkarma ve doku işleme öncesi enfekte-farelerin geniş intracardial perfüzyon ile sekestre lökositlerin kirlenmesini önlemek için kan bölmesi çıkarmak için bu prosedürü gereklidir. Perfüzyon sonra, beyinleri hasat edilir ve küçük parçalar halinde disseke. Dokuların yapısı daha da oluşan beyin homojenat sonra miyelin ve diğer doku enkaz beyin sekestre lökositlerin ayrılması (BSL) sağlayan bir Percoll degrade üzerinde santrifüj edilir Kollajenaz D ve DNAz I. ile enzimatik tedavi ile bozulur. İzole hücreler daha sonra yıkanır, flow sitometri ile sonraki analiz için floresan antikorlar ile hemasitometre ve lekeli kullanılarak sayıldı.

Bu prosedür inflamatuvar lökositlerin kapsamlı fenotipik karakterizasyonu re beyin göç veriyorinme gibi viral veya paraziter enfeksiyonlar gibi çeşitli uyarılara yanıtı. Yöntemi de klinik öncesi hayvan modellerinde yeni anti-inflamatuvar tedaviler değerlendirilmesi için yararlı bir araç sağlar.

Protokol

1. P. ile Fare enfeksiyonu berghei-ANKA

1. Defrost kriyoprezerve P. bir kısım berghei ANKA pRBC.
2. Iki elli emniyet tekniği kullanılarak serebral sıtma dirençli BALB / c donör fare (8-12 hafta-eski) dizginlemek. Bir 1 ml insülin şırınga (28G iğne) kullanarak pRBC 100-200 ul fare enjekte. Rutin olarak, 1-2 verici farelere enjekte edilir.
3. Enfeksiyon sonrası 4-5 gün hakkında (pi) kafes donör fare çıkarın ve bir iş istasyonu veya bir tek çalışma yüzeyi üzerine yerleştirin.
4. Yavaşça kuyruk sonuna fare dizginlemek ve küçük makas kullanarak (yaklaşık 1 mm) kuyruk ucu kesilir. Alternatif olarak, 25 G iğne kullanılarak küçük bir kuyruk ponksiyon olabilir.
5. Bir buzlu uç mikroskop lamı sonuna farenin kuyruk damarından kan bir damla yerleştirin.
6. 45 ° açı ile ilgili ikinci bir slayt (yayıcı) yerleştirin ve kan damlasını içine geri. Kan kenarı boyunca yayılır sonra, serpme-slayt arifesinde itinkan yayması yapmak için mikroskop lamı üzerinde nly. Smear kurumaya bırakın.
7. 10 dakika için taze hazırlanan Giemsa slaytlar leke sonra 30 sn için% 100 metanol kan smear Fix.
8. 1 dakika boyunca su ile çalışan yaymada durulayın, hava-kuru izin ve mikroskop (100x, immersiyon yağı) altında slayt inceleyin. 1000 eritrositler içinde pRBC numaralandırmak ve yüzde parazitemi hesaplayabilirsiniz. Onlar deney hayvanı enfeksiyon için bled önce Donör farelerin 2.5-5% arası parazitemi düzeylerine ulaşmak gerekir.
9. Bir heparinize mikro-hematokrit kapiller tüp kullanarak retroorbital kanama ile donör fare kan toplayın. Tüm deneyler Walter & Eliza Hall Institute Hayvan Etik Komitesi gereksinimleri ile uygun olarak gerçekleştirilir. Yerel Hayvan Etik Kurulu gereksinimlerine bağlı olarak diğer kanama prosedürler kullanılabilir. 1X10 pRBC/0.2 ⁶ ml 'lik bir nihai konsantrasyon RPMI medyumu içinde kan gerekli miktarda eritilir. DüşününNormal bir fare hematokrit ~ 6x10 ⁹ kırmızı kan hücrelerinin / 1 ml 'dir.
10. Intraperitoneal (ip) 1x10 ⁶ pRBC/0.2 ml enjekte edilerek deneysel C57BL / 6 fareler (8-12 haftalık) Infect.
11. Enfekte farelerde parazitemi düzeylerini izlemek için adımları 1.3-1.8 izleyin. Parazitemi günde 2 ya da 3 pi başlayarak 2-3 gün her bir tespit edilmesi gerekmektedir
12. Fareler kambur görünümü olarak tezahür olabilir C57BL içinde / 6 şiddetli sıtma Onset, kürk ve düşük aktiviteli ruffed. Bazı fareler bu aşamada kurtarmak olabilir, ama kendini doğrulma refleksini kaybı ilerleme geri dönüşümsüz hastalık gösterir ve hayvan ötenazi gerekir.

2. Fareler ve Beyin Extraction Intracardial Perfüzyon

1. Bir 60 cm kolon stand üst bağlı bir kolon için bir tutucu 500 ml rezervuar sabitleyerek bir kılavuz ağırlık perfüzyon sistemi birleştirin. Rezervuarın alt ucuna plastik boru bağlayın ve tampon akışını kontrol etmek için bir boru kelepçesi sabitleyin. Bir 23 G iğne hortumu takın. FilPBS (22 ° C'de tutulur) ile rezervuar l, kelepçe ve tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için tüp aracılığıyla çalıştırmak için tampon izin açın.
2. Ötenazi P. CO ₂ Solunması berghei ANKA-enfekte fare. Pedalı, orbital ve solunum tepkilerin yokluğu ölüm onaylayın.
3. Dorsal bir plastik tepsi içinde bulunan bir styrofoam diseksiyon gemide arka ve ön pençeleri tarafından ötenazi fare Pin. Yerel Hayvan Etik Komitesi gereksinimleri anestezi bağlı intracardial pefusion önceden başlaması idare edilebileceği.
4. % 70 etanol ile ventral tarafta silin.
5. Göğüs boşluğu göstermek için orta hat boyunca cildi açmak için büyük bir makas ve forseps kullanın. Yanlarına Kıvrım ve pin cilt.
6. Ince forseps ile sternumun tutun ve diyafram kesmek ve sternumun her iki yanında kaburga severing. Herhangi bir büyük kan damarlarına zarar vermemeye özen gösterin.
7. Kafasına gevşek yanındaki sternum ile göğüs kafesi Pin.
8. Ventriküller zekâ tutunh ince forseps ve ince makas ile dikkatlice kazımak sağ atrium.
9. PBS çalışırken asendan aorta doğru sol ventrikül içine yerçekimi perfüzyon sistemine takılı 23G iğne takın. Iğne ucu sadece 0.5 cm yerleştirin.
10. 5 dakika için ya da atık kadar fare serpmek açıktır.
11. Ayır farenin ve karın üzerinde yatıyordu. % 70 etanol ile kafasını temizleyin.
12. Büyük makas kullanarak, sadece servikal spinal kord alanı üzerinde bir kesim yapmak.
13. Medyan kaudal-rostral kesim kafatası maruz uzak kafatası tabanında başlayan ve cilt soyma yapmak için ince makas kullanın.
14. Başımı tutarak, her yörünge boşluğuna küçük bir makas bıçakları yerleştirin ve yörüngeleri arasında bir kesim yapmak.
15. Sutur boyunca uzunlamasına kesilmiş olun ve dikkatlice dışarı doğru her beyin yarımkürede kafatası kabuğu.
16. Bir spatula kullanarak, yavaşça beyin kaldırın ve RPMI medyumu içeren 10 ml santrifüj tüpüne yerleştirin.

3. Beyin-sekestre Lökosit izolasyonu (BSL)

1. Bir güvenlik kabini içinde çalışarak, yerde taze RPMI doku kültür ortamı 3-5 ml içeren bir Petri kabındaki bir paslanmaz çelik hücre süzgecinden (40-60 mesh boyutu) üstüne beyin hasat.
2. Küçük parçalar halinde beyin dokusu kesin.
3. Bir kristal piston kullanarak hücre süzgecinden beyin dokusunun küçük parçalar bastırın.
4. 4, 10 dakika boyunca 250 ° C'de xg'de 10 ml tüp ve santrifüj ile beyin Homojenat, transfer
5. % 0.05 collagenase, D ve 2U/ml DNAz I içeren RPMI medyumu, 3 ml içinde çözülür pelet
6. Oda sıcaklığında 30 dakika için karışım döndürün. Bir 70 mikron naylon hücre süzgecinden ve / ya da itme karışım 5 dakika süreyle buz üzerinde inkübe ederek hücre artıkları çıkarın.
7. Oda sıcaklığında 20 dakika için 400 x g'da (herhangi bir fren) bir 7 ml% 30 Percoll yastık ve santrifüj üzerine beyin Homojenat yerleştirin.
8. 5 dakika için buz üzerinde kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile inkübe 1 ml pelet yeniden süspanseintracardial perfüzyon beyin kaldırılır olamazdı yapışık pRBC, lyse.
9. RPMI medyumu 9 mL, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 250 x g santrifüj ile hücreler yıkamak
10. RPMI medyumu ile bir Eppendorf tüpü transfer hücre 50-100 ul içinde süspanse BSL içeren pelet.
11. Yaşayabilir hücrelerin tanımlanması için Tripan mavi hücre örneği bir 5-10 ul alikot 1:02 seyreltin.
12. Hemasitometre kullanarak mikroskop altında canlı hücreleri saymak. Günde 6 pi itibaren, P. Gönderen berghei ANKA-enfekte farelerde 20,000-100,000 BSLs telafi edilebilir, nörolojik belirtiler gösterir.

4. Multicolour akış sitometri yöntemi ile BSL immünofeotipleme

1. 4, 10 dakika boyunca 250 ° C'de x g'de santrifüjleyin hücreleri, (PBS,% 1 dana fetus serumu (FCS), 2 mM EDTA) ile boyanarak 50 ul tampon içinde tekrar süspansiyon topak süpernatantı ve aspire.
2. Anti-CD16/32 antikor (Fcblock) saflaştırılmış 1 ul ekle.
3. 1 için hücreler inkübeBuz üzerinde 0 dk.
4. Boyama Tampon 1 ml ile hücreleri yıkayın. 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleyin hücreleri ve süpernatan aspire.
5. Gerekli floresan antikor önceden belirlenmiş en uygun seyreltmeler, yani anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR ve anti-NK1.1 ihtiva eden tampon Boyama 50 ul içinde süspanse hücreler.
6. Buz üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin.
7. Boyama Tampon 1 ml ile hücreleri yıkayın. 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleyin hücreleri ve süpernatan aspire.
8. PBS içinde 100 ul hücre içinde yeniden süspanse edin.
9. Bir akım sitometri plastik tüp hücreleri aktarın.
10. Bir akış sitometresinin kullanarak, en az 5.000-10.000 olaylar kazanmak. Gerektiği gibi uygun boyanmamış hücre kontrolleri ve florokrom tazminat örnekleri dahil edilmelidir.
11. Uygun akım sitometri yazılımını kullanarak sonuçları analiz edin.

Sonuçlar

Şekil sonuçlanır. 2 gösteri yüzdeleri ve perfüze veya unperfused sıtma ile enfekte olmuş ve naif kontrol farelerin beyinleri kurtarıldı farklı BSL nüfus mutlak sayıları. Protokol metninde de belirtildiği gibi İzole BSL PE-anti-NK1.1 ve APC-anti-TCR-β antikorları ile boyandı. Önceki bulguları ^7-9 ile uyumlu olarak, αβTCR ⁺ T hücreleri perfüze sıtma ile enfekte farelerde (günde 6 pi) ve beyinlerinde BSL havuzu yüksek oranda oluşur. Bu nüfusun önemli ölçüde (Şekil 2A...

Tartışmalar

BSL izolasyonu ve karakterize edilmesi ve analiz deneysel fare modellerinde doku hasarı ya da enfeksiyona yanıt olarak beyin göç inflamatuar hücrelerin miktarının sağlayan bir yöntem. Organ ekstraksiyonu ve bunu izleyen hücre izolasyonu önce kan bölmesinin çıkarılması için bir intracardial perfüzyon adım giriş non-inflamatuar dolaşımdaki lökositler ile inflamatuar hücrelerin kirlenmesini önlemek için yararlıdır. Bu inflamatuar hücreler beyin parankimi ⁵ nüfuz hangi tür kemirgen ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
			Çözümler ve tamponlar
Giemsa en azur eosin metilen mavisi çözeltisi	Merck Millipore	1.09204.0500	Distile su 1:10 seyreltme
RPMI medyumu			Fare tonisite
Fare tonisite PBS			20 mM sodyum fosfat, 0.149 NaCl, pH 7.3
% 0,4 Tripan Mavisi	Sigma Aldrich	T-8154	1:02 dilüsyon
Kollajenaz D	Biyokimyasal Worthington
Deoxyribonuclease (DNAse) I	Sigma Aldrich	D4263-5VL	Sığır pankreas Gönderen
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	PBS içinde% 30 çözelti
Ultra Saf Tris	Invitrogen	15505-020
Amonyum Klorür (NH 4 Cl)	AnalaR	10017
Kırmızı Hücre Lizis Tampon			17 mM Tris, 14nm NH4CI, pH 7.2
FCS	Gibco	1009
EDTA disodyum tuzu	Merck	10093.5V	0.1M, pH 7.2
			Antikorlar ve konjugatlarının
Anti-fare CD16/CD32 (Fc Blok), klon 2.4G2	BD Pharmingen	553.142	50 ul boyama tampon içinde 1 ul (0.5mg/50 ml)
FITC-anti-fare CD4, klon H129.19	BD Pharmingen	553651
PE-anti-fare NK1.1, klon PK136	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5-anti-fare CD8, klon 53-6-7	BD Pharmingen	551162
APC-fare anti-TCR-β, klon H57-597	BD Pharmingen	553174
PE-anti-fare CXCR3, klon 220.803	R & D Systems	FAB1685P
Biotinlenmiş-anti-fare CCR5, klon C34-3448	BD Pharmingen	559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
			Ekipman ve malzeme
SuperFrost mikroskop lamı	Lomb Menzel-Glaser
Diseksiyon forseps, makas	REDA Instrumente
500 ml PBS rezervuar	Nalgene
Kauçuk hortum
23G iğne	BD PrecisionGlide	302008
Hücre ayrışma kiti metal elek içeren	Sigma Aldrich	CD-1
70 mikron naylon hücre süzgecinden	BD Falcon	352350
Hemasitometre	GmbH Neubauer	717810
Flow sitometri tüpler	BD Falcon	352008