Isolement et analyse de Brain-séquestrés de leucocytes<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-souris infectées

Résumé

Une méthode pour l'isolement des adhérents leucocytes inflammatoires des vaisseaux sanguins du cerveau de Plasmodium berghei ANKA-souris infectées est décrite. La méthode permet la quantification ainsi que la caractérisation phénotypique des leucocytes isolés après coloration avec des anticorps fluorescents et leur analyse ultérieure par cytométrie en flux.

Résumé

Nous décrivons une méthode pour l'isolement et la caractérisation des cellules adhérentes inflammatoires des vaisseaux sanguins du cerveau de P. berghei ANKA-souris infectées. L'infection des souris sensibles avec les souches cela se traduit souche de parasite dans l'induction de la malaria cérébrale expérimentale, un syndrome neurologique qui récapitule certains aspects importants de Plasmodium falciparum à médiation paludisme grave chez les humains ^1,2. Formes matures du sang étapes paludisme exprimer des protéines parasites sur la surface de l'érythrocyte infecté, ce qui leur permet de se lier à des cellules endothéliales vasculaires. Ce processus induit obstruction du flux sanguin, ce qui entraîne une hypoxie et des hémorragies ³ et stimule également le recrutement des leucocytes inflammatoires au site de la séquestration du parasite.

Contrairement à d'autres infections, à savoir les virus neutrotopic ^4-6, les deux paludisme globules rouges parasités (pRBC) ainsi que associé Inflammleucocytes Atory reste séquestré dans les vaisseaux sanguins plutôt que de s'infiltrer dans le parenchyme cérébral. Ainsi, pour éviter la contamination des leucocytes séquestrés avec des non-inflammatoires des cellules circulantes, vaste perfusion intracardiaque de souris infectées par-avant prélèvement d'organes et de traitement des tissus est nécessaire dans cette procédure pour retirer le compartiment sanguin. Après la perfusion, les cerveaux sont prélevés et disséqués en petits morceaux. La structure du tissu est encore perturbée par un traitement enzymatique avec de la collagénase D et DNAse I. L'homogénat de cerveau résultant est ensuite centrifugé sur un gradient Percoll qui permet de séparer le cerveau séquestrés leucocytes (BSL) de la myéline et des débris d'autres tissus. Les cellules isolées sont ensuite lavées, comptées à l'aide d'un hémocytomètre et colorées avec des anticorps fluorescents pour une analyse ultérieure par cytométrie en flux.

Cette procédure permet la caractérisation phénotypique complète des leucocytes inflammatoires de migrer vers le cerveau reréponse à divers stimuli, y compris les accidents vasculaires cérébraux ainsi que les infections virales ou parasitaires. La méthode fournit également un outil utile pour l'évaluation de nouveaux traitements anti-inflammatoires dans des modèles animaux précliniques.

Protocole

1. L'infection des souris avec P. berghei ANKA-

1. Décongeler une aliquote de cryoconservé P. berghei ANKA pRBC.
2. Retenir un paludisme cérébral résistant souris BALB / c donateurs (8-12 semaines d'âge) en utilisant la technique de retenue à deux mains. Injecter la souris avec 100-200 ul de pRBC l'aide d'une seringue de 1 ml d'insuline (28G aiguille). Régulièrement, 1-2 souris donneuses sont injectés.
3. Sur les 4-5 jours post-infection (pi) retirer souris donneuse de la cage et le placer sur une station de travail ou un tampon jetable de travail.
4. Doucement restreindre la souris par le bout de la queue et l'utilisation de petits ciseaux couper le bout de la queue (environ 1 mm). Alternativement, une ponction petite queue à l'aide d'une aiguille 25 G pourrait être réalisée.
5. Déposer une goutte de sang de veine de la queue de la souris vers la fin d'une lame de microscope dépoli fin.
6. Placez une deuxième lame (spreader) sur un angle de 45 ° et le sauvegarder dans la goutte de sang. Une fois le sang se propage le long du bord, pousser la veille épandeur-slideeul à travers la lame du microscope pour faire le frottis sanguin. Laisser le frottis sécher à l'air.
7. Fixer les frottis sanguins dans le méthanol à 100% pendant 30 secondes, puis tache diapositives au Giemsa fraîchement préparée pendant 10 min.
8. Rincer frottis de sang avec l'eau courante pendant 1 min, laisser sécher à l'air et à examiner glissière sous le microscope (100x immersion dans l'huile,). Énumérer pRBC à moins de 1000 érythrocytes et de calculer la parasitémie pour cent. Souris donneuses devraient atteindre des niveaux de parasitémie entre 2,5-5% avant d'être saigné pour l'infection des animaux de laboratoire.
9. Recueillir le sang de la souris donneuse par saignement rétro-orbitaire en utilisant un micro-hématocrite hépariné tube capillaire. Toutes les expériences sont réalisées en conformité avec les exigences Walter et Eliza Hall Institute du Comité d'éthique animale. En fonction des besoins des animaux locaux comité d'éthique procédures autres saignements peuvent être utilisés. Dissoudre la quantité requise de sang dans le milieu RPMI à une concentration finale de 1.10 ⁶ pRBC/0.2 ml. Considérez queun hématocrite normal de la souris est de ~ 6x10 ⁹ cellules rouges du sang / 1 ml.
10. Infect C57BL expérimentale / 6 souris (8-12 semaines) par injection intrapéritonéale (ip) 1x10 ⁶ pRBC/0.2 ml.
11. Pour surveiller les niveaux de parasitémie de souris infectées suivez les étapes 1.3 à 1.8. Parasitémie doit être déterminé tous les 2-3 jours à partir du jour 2 ou 3 pi
12. L'apparition du paludisme grave chez souris C57BL / 6 peut se manifester comme apparence voûtée, la gélinotte fourrure et une faible activité. Certaines souris peut recouvrer à ce stade, mais la progression de la perte de l'auto-réflexe de redressement indique maladie irréversible et les animaux doivent être euthanasiés.

2. La perfusion intracardiaque de souris et d'extraction du cerveau

1. Assembler un système de perfusion par gravité manuel par fixation d'un réservoir 500 ml d'un support de colonne fixé à la partie supérieure de la colonne de support 60 cm. Raccorder des tubes en matière plastique à l'extrémité inférieure du réservoir et assurer une pince de tube pour commander l'écoulement tampon. Fixer le tube à une aiguille 23 G. Fill le réservoir avec du PBS (maintenue à 22 ° C), ouvrir et serrer permettre tampon afin de fonctionner à travers le tube pour éliminer toutes les bulles d'air.
2. Euthanasier P. berghei ANKA-souris infectée par inhalation de CO _2. Confirmer la mort par l'absence de pédale, et les réponses des voies respiratoires orbital.
3. Pin souris euthanasiées par les pattes de derrière et devant dorsalement sur une planche à dissection mousse de polystyrène contenues dans un bac en plastique. Selon le Comité des animaux sous anesthésie locale exigences d'éthique pourrait être administré avant le début de pefusion intracardiaque.
4. Essuyez la face ventrale avec de l'éthanol à 70%.
5. Utilisez de grands ciseaux et des pinces pour ouvrir la peau le long de la ligne médiane pour exposer la cavité thoracique. Pli cutané et la broche sur les côtés.
6. Tenez le sternum avec des pinces fines et couper le diaphragme et le long des deux côtés du sternum couper les côtes. Prenez soin de ne pas endommager les gros vaisseaux sanguins.
7. La broche de la cage thoracique du sternum lâchement à côté de la tête.
8. Tenez esprit ventriculesh pince fine et soigneusement inciser oreillette droite avec des ciseaux fins.
9. Insérez l'aiguille 23G attaché au système de perfusion par gravité dans le ventricule gauche vers l'aorte ascendante tandis que le PBS est en cours d'exécution. Insérez seulement 0,5 cm de la pointe de l'aiguille.
10. Perfuser la souris pendant 5 min ou jusqu'à ce que l'effluent est clair.
11. Détacher la souris et le poser sur son abdomen. Essuyez la tête avec de l'éthanol à 70%.
12. Utilisation de grands ciseaux, faire une coupe juste au-dessus de la zone de la moelle épinière cervicale.
13. Utilisez des ciseaux fins pour faire une médiane caudale-rostrale coupe à partir de la base du crâne et la peau d'écart pour exposer le crâne.
14. Tenant la tête, placez les lames de ciseaux petits dans chaque cavité orbitaire et faire une coupure entre les orbites.
15. Faites une coupe longitudinale le long de la suture sagittale et détachez soigneusement le crâne sur chaque hémisphère du cerveau vers l'extérieur.
16. Avec une spatule, soulevez doucement le cerveau et le placer dans un tube à centrifuger de 10 ml contenant du milieu RPMI.

3. Isolement de Brain-séquestrés leucocytes (BSL)

1. Travailler dans une enceinte de sécurité, le lieu fraîchement récoltées cerveau au-dessus d'un tamis cellulaire en acier inoxydable (40-60 mesh) dans une boîte de Pétri contenant 3-5 ml de milieu de culture RPMI tissus.
2. Coupez le tissu cérébral en petits morceaux.
3. Appuyez sur de petits morceaux de tissu cérébral à travers le filtre cellulaire à l'aide d'un piston de cristal.
4. Transfert homogénat de cerveau dans un tube de 10 ml et centrifuger à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C.
5. Dissoudre le culot dans 3 ml de milieu RPMI, contenant 0,05% de collagénase D et DNAse I. 2U/ml
6. Tournez mélange pendant 30 min à température ambiante. Éliminer les débris cellulaires en poussant le mélange à travers un tamis de nylon 70 um cellule et / ou par incubation sur de la glace pendant 5 min.
7. Lay homogénat de cerveau sur un coussin de 7 ml de Percoll 30% et centrifuger à 400 xg (sans freins) pendant 20 min à température ambiante.
8. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon de lyse des globules rouges du sang et incuber sur de la glace pendant 5 min àlyser pRBC adhérent, qui n'a pu être retirée du cerveau par perfusion intracardiaque.
9. Ajouter 9 ml de milieu RPMI, laver les cellules et centrifuger à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C.
10. Remettre en suspension BSL contenant du pellet dans 50-100 pi de milieu RPMI et transférer les cellules dans un tube Eppendorf.
11. Diluer une aliquote de 5-10 pi de l'échantillon de cellules 1:2 dans du bleu trypan pour l'identification de cellules viables.
12. Compter les cellules viables sous le microscope à l'aide d'un hémocytomètre. A partir du jour de pi 6, lorsque P. berghei ANKA-souris infectées présentent des signes neurologiques, 20,000-100,000 BSLs peut être récupéré.

4. Immunophénotypage de BSL en cytométrie en flux Multicolore

1. Centrifuger les cellules à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 50 ul de tampon de coloration (PBS, 1% sérum de veau foetal (FCS), 2 mM EDTA).
2. Ajouter le pl 1 sur purifiée anti-CD16/32 anticorps (Fcblock).
3. Incuber les cellules pendant 10 min sur la glace.
4. Laver les cellules avec 1 ml de tampon de coloration. Centrifuger les cellules à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C et aspirer le surnageant.
5. Resuspendre les cellules dans 50 ul de tampon de coloration contenant prédéterminés dilutions optimales de exigées anticorps fluorescents, c'est à dire anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR et anti-NK1.1.
6. Incuber pendant 1 heure sur la glace.
7. Laver les cellules avec 1 ml de tampon de coloration. Centrifuger les cellules à 250 xg pendant 10 min à 4 ° C et aspirer le surnageant.
8. Remettre en suspension les cellules dans 100 ul de PBS.
9. Transférer des cellules dans un tube de plastique de cytométrie de flux.
10. L'aide d'un cytomètre en flux, accumuler au moins 5.000-10.000 événements. Des contrôles de cellules non colorées et des échantillons de rémunération fluorochromes doivent être incluses au besoin.
11. Analyser les résultats en utilisant un logiciel approprié cytométrie en flux.

Résultats

Les résultats de la Fig. 2 pourcentages montrent et le nombre absolu des différentes populations BSL récupérés à partir de cerveaux de souris perfusés ou unperfused contrôle infectées par la malaria et naïf. Isolé BSL ont été colorés avec du PE-anti-NK1.1 et APC-anti-TCR-β anticorps comme indiqué dans le texte du Protocole. Conformément aux conclusions précédentes ^7-9, αβTCR ^cellules T comprend une forte proportion de la piscine BSL dans le cerveau des perfusés infectés par l...

Discussion

L'isolement et l'analyse de BSL est une méthode qui permet la caractérisation et la quantification des cellules inflammatoires qui migrent vers le cerveau en réponse à une lésion tissulaire ou d'une infection chez des souris modèles expérimentaux. L'introduction d'une étape de perfusion intracardiaque pour le retrait du compartiment sanguin avant l'extraction d'organes et de l'isolement cellulaire ultérieur est utile pour prévenir la contamination de cellules inflammatoires avec...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
			Solutions et tampons
Giemsa azur éosine solution de bleu de méthylène	Merck Millipore	1.09204.0500	Dilution 1:10 dans de l'eau distillée
Milieu RPMI			Souris tonicité
Souris tonicité PBS			Phosphate de sodium 20 mM, 0,149 NaCl, pH 7,3
0,4% bleu trypan	Sigma Aldrich	T-8154	Dilution 1:2
Collagénase D	Biochimique Worthington
DeoxyribonuClease (DNAse) Je	Sigma Aldrich	D4263-5VL	À partir de pancréas de bovin
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	Solution à 30% dans du PBS
Ultrapure Tris	Invitrogen	15505-020
Le chlorure d'ammonium (NH 4 Cl)	AnalaR	10017
Rouge tampon de lyse cellulaire			17 mM Tris, 14nm NH 4 Cl, pH 7,2
FCS	Gibco	1009
Sel disodique d'EDTA	Merck	10093.5V	0,1 M, pH 7,2
			Les anticorps et les conjugués d'
Anti-souris CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2	BD Pharmingen	553142	1 pl dans 50 ul de tampon de coloration (0.5mg/50 ml)
FITC anti-souris CD4, clone H129.19	BD Pharmingen	553651
PE anti-souris NK1.1, clone PK136	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5 anti-souris CD8, clone 53-6-7	BD Pharmingen	551162
APC anti-souris TCR-β, clone H57-597	BD Pharmingen	553174
PE anti-souris CXCR3, clone 220803	R & D Systems	FAB1685P
Biotinylé anti-souris CCR5, clone C34-3448	BD Pharmingen	559922
Streptavidine-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
			Équipement et matériel
Lame de microscope SuperFrost	Lomb Menzel-Gläser
Pinces à dissection, ciseaux	REDA Instrumente
500 ml de PBS réservoir	Nalgene
Tube en caoutchouc
Aiguille 23G	BD PrecisionGlide	302008
Kit de dissociation cellulaire contenant un métal tamis	Sigma Aldrich	CD-1
70 um filtre cellulaire en nylon	BD Falcon	352350
Hémocytomètre	Neubauer GmbH	717810
Tubes de cytométrie en flux	BD Falcon	352008