Isolamento e Análise de Cérebro-sequestrados de Leucócitos<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA infectadas Mice

Resumo

Um método para o isolamento de leucócitos aderentes inflamatórios dos vasos sanguíneos do cérebro Plasmodium berghei ANKA camundongos infectados é descrito. O método permite a quantificação, bem como a caracterização fenotípica de leucócitos isolados, após coloração com anticorpos fluorescentes e subsequente análise por citometria de fluxo.

Resumo

Descreve-se um método para o isolamento e caracterização de células aderentes inflamatórios dos vasos sanguíneos cerebrais de P. berghei ANKA camundongos infectados. Infecção de estirpes de ratinho-sensíveis com estes resultados de deformação parasita na indução da malária cerebral experimental, uma síndrome neurológica que recapitula certos aspectos importantes da malária Plasmodium falciparum mediada grave em seres humanos ^1,2. Formas maduras de sangue fase-malária expressar proteínas parasitas sobre a superfície dos eritrócitos infectados, o que lhes permite ligar-se a células endoteliais vasculares. Este processo induz a obstrução do fluxo sanguíneo, resultando em hipóxia e hemorragias ³ e também estimula o recrutamento de leucócitos inflamatórios para o local de fixação do parasita.

Ao contrário de outras infecções, isto é, os vírus neutrotopic ^4-6, ambos os malária parasitados glóbulos vermelhos (CGV), bem como associado Inflammleucócitos Atory permanecem sequestrados no interior dos vasos sanguíneos, em vez de se infiltrar no parênquima cerebral. Assim, para evitar a contaminação dos leucócitos sequestrados com não-inflamatórios de células circulantes, perfusão intracardíaca extensa de camundongos infectados-antes da extracção e processamento de tecidos de órgãos é necessária neste procedimento para remover o compartimento do sangue. Após a perfusão, os cérebros são colhidas e dissecado em pequenos pedaços. A estrutura de tecido é adicionalmente interrompido por tratamento enzimático com colagenase D e I. DNAse O homogenato de cérebro resultante é então centrifugado num gradiente de Percoll, que permite a separação de cérebro-sequestradas leucócitos (BSL) de mielina e detritos de outro tecido. As células isoladas são então lavadas, contadas utilizando um hemocitómetro e coradas com anticorpos fluorescentes para posterior análise por citometria de fluxo.

Este procedimento permite a caracterização fenotípica abrangente de leucócitos inflamatórios migrar para o cérebro em response a vários estímulos, incluindo acidente vascular cerebral, bem como infecções virais ou parasitárias. O método também proporciona um instrumento útil para a avaliação de novos tratamentos anti-inflamatórias em modelos pré-clínicos com animais.

Protocolo

1. Infecção de camundongos com P. berghei ANKA-

1. Descongelação uma alíquota de P. criopreservado berghei ANKA CHA.
2. Conter um cerebral malária resistente rato BALB / c dador (8-12 semanas de idade), utilizando a técnica de retenção de duas mãos. Injectar mouse com 100-200 ul de concentrado de hemácias utilizando uma seringa de insulina 1 ml (28G agulha). Rotineiramente, 1-2 camundongos doadores são injetados.
3. Em 4-5 dias pós-infecção (pi) remover camundongo doador de gaiola e coloque-o em uma estação de trabalho ou uma almofada descartável de trabalho.
4. Suavemente conter rato pela extremidade da cauda e usando uma tesoura pequena corte da ponta da cauda (cerca de 1 mm). Alternativamente, uma pequena cauda punção utilizando uma agulha de 25 G pode ser realizada.
5. Colocar uma gota de sangue a partir da veia da cauda do rato, perto da extremidade de uma lâmina de microscópio fosco end.
6. Coloque uma segunda corrediça (espalhador) num ângulo de 45 ° e guardá-lo para a gota de sangue. Quando o sangue se espalha ao longo da borda, empurre o véspera spreader slide-omente através da lâmina de microscópio para fazer o exame de sangue. Permitir o esfregaço secar ao ar.
7. Fix esfregaços de sangue em metanol a 100% durante 30 segundos e, em seguida, as lâminas em mancha de Giemsa preparada de fresco durante 10 min.
8. Enxaguar esfregaço de sangue com água corrente durante 1 minuto, deixa-se secar ao ar e examinar lâmina sob o microscópio (100x imersão em óleo). Enumerar CHA dentro 1.000 eritrócitos e calcular parasitemia por cento. Ratinhos dadores devem atingir níveis de parasitemia entre 2,5-5% antes de serem sangrados para a infecção de animais de experiência.
9. Recolher o sangue do rato doador por sangramento retro-orbital com um tubo de micro-hematócrito capilar heparinizado. Todos os experimentos são realizados em conformidade com o Walter & Eliza Hall Institute animal, as exigências do Comitê de Ética. Dependendo locais animal, as exigências do Comitê de Ética procedimentos sangramento outros possam ser usados. Dissolver a quantidade necessária de sangue em meio RPMI a uma concentração final de 1x10 ml ⁶ pRBC/0.2. Considere queum hematócrito normal de murganho é ~ 6x10 ⁹ células vermelhas do sangue / 1 ml.
10. Infect C57BL experimental / 6 machos (8-12 semanas de idade) por injecção intraperitoneal (ip) 1x10 ⁶ ml pRBC/0.2.
11. Para monitorar os níveis de parasitemia de camundongos infectados siga os passos de 1,3-1,8. Parasitemia deve ser determinada em cada 2-3 dias, começando no dia 2 ou 3 pi
12. O início da malária grave em camundongos C57BL / 6 pode se manifestar como a aparência corcunda, ruffed pele e baixa atividade. Alguns ratos podem se recuperar nesta fase, mas a progressão para a perda de auto-alinhamento reflexo indica doença irreversível e os animais devem ser sacrificados.

2. Perfusão intracardíaca de Ratos e Extração Cérebro

1. Montar um sistema de perfusão manual de gravidade pela obtenção de um reservatório de 500 ml, a um suporte de coluna ligada à parte superior de um suporte de coluna de 60 cm. Conectar tubos de plástico para a extremidade inferior do reservatório e fixar o grampo de tubo para controlar o fluxo de tampão. Anexar tubo a uma agulha G 23. Fill-se o reservatório com PBS (mantida a 22 ° C), abrir e permitir apertar tampão para ser executado através do tubo para remover todas as bolhas de ar.
2. Euthanize P. berghei ANKA rato infectado por inalação de CO _2. Confirmar a morte pela ausência de pedal, orbital e as respostas respiratórias.
3. Pin do mouse sacrificados pelas patas traseiras e frente dorsal em uma placa de isopor dissecção contida em uma bandeja de plástico. Dependendo locais de Ética Comitê de anestesia animal requisitos podem ser administrados antes de início pefusion intracardíaca.
4. Wipe lado ventral com etanol a 70%.
5. Use uma tesoura grande e pinças para abrir pele ao longo da linha média para expor a cavidade torácica. Dobras cutâneas e pino para os lados.
6. Segure o esterno com uma pinça fina e cortar o diafragma e ao longo de ambos os lados do esterno cortando as costelas. Tome cuidado para não danificar os grandes vasos sanguíneos.
7. Pin da caixa torácica pelo esterno frouxamente ao lado da cabeça.
8. Segure sagacidade ventrículosfórceps h finos e cuidadosamente inciso átrio direito com tesoura fina.
9. Inserir a agulha 23G ligado a sistema de perfusão gravidade em ventrículo esquerdo para a aorta ascendente, enquanto PBS está em execução. Inserir apenas 0,5 cm da ponta da agulha.
10. Perfundir rato por 5 minutos ou até o efluente é clara.
11. Desafixar mouse e colocá-lo em seu abdômen. Limpe a cabeça com etanol 70%.
12. Com uma tesoura de grande porte, fazer um corte logo acima da área da medula espinhal cervical.
13. Use uma tesoura fina para fazer um corte caudo-rostral mediana começando na base do crânio e casca da pele para expor o crânio.
14. Segurando a cabeça, colocar as lâminas de uma tesoura pequena em cada cavidade orbital e fazer um corte entre as órbitas.
15. Faça um corte longitudinal ao longo da sutura sagital e cuidadosamente descascar o crânio em cada hemisfério cerebral para fora.
16. Usando uma espátula, levantar suavemente o cérebro e colocá-lo dentro de um tubo de centrífuga de 10 ml contendo meio RPMI.

3. Isolamento de Brain-sequestradas Leucócitos (BSL)

1. Trabalhando numa câmara de segurança, lugar recentemente colhido cérebro em cima de uma peneira de aço inoxidável de células (40-60 malhas) em uma placa de Petri contendo 3-5 ml de meio de cultura RPMI tecido.
2. Corte o tecido cerebral em pedaços pequenos.
3. Empurrar pequenos fragmentos de tecido do cérebro de células através do filtro utilizando um êmbolo de cristal.
4. Transferir homogenato de cérebro de um tubo de 10 ml e centrifugar a 250 xg durante 10 min a 4 ° C.
5. Dissolver sedimento em 3 ml de meio RPMI, contendo 0,05% de colagenase D e 2U/ml DNAse I.
6. Girar mistura durante 30 min à temperatura ambiente. Remover os detritos celulares, empurrando-se a mistura através de um filtro de 70 | iM de células de nylon e / ou através de incubação em gelo durante 5 min.
7. Lay homogenato de cérebro em uma almofada de 7 ml de Percoll a 30% e centrifuga-se a 400 xg (sem travões) durante 20 min à temperatura ambiente.
8. Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de lise de sangue vermelho de células e incubado em gelo durante 5 min alisar CHA aderente, a qual não pode ser removido a partir do cérebro por perfusão intracardíaca.
9. Adicionar 9 ml de meio RPMI, lavar e centrifugar as células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C.
10. Ressuspender o pellet contendo BSL em 50-100 ul de meio RPMI e transferir as células para um tubo de Eppendorf.
11. Diluir uma alíquota de 5-10 uL da amostra de células 1:2 em azul de tripano para a identificação de células viáveis.
12. Contar as células viáveis ​​no microscópio utilizando um hemocitómetro. A partir de dia 6 pi, quando P. berghei ANKA camundongos infectados exibem sinais neurológicos, 20,000-100,000 BSLs pode ser recuperado.

4. Imunofenotipagem de BSL por citometria de fluxo Multicolour

1. Centrifugar as células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 50 ul de tampão de coloração (PBS, 1% de soro fetal de vitelo (FCS), 2 mM de EDTA).
2. Adicionar a ul de uma purificado anti-CD16/32 anticorpo (Fcblock).
3. Incubar as células durante 10 min em gelo.
4. Lavar as células com 1 ml de Tampão de Coloração. Centrifugar as células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante.
5. Ressuspender as células em 50 ul de tampão de coloração contendo pré-determinadas diluições óptimas de anticorpos fluorescentes necessários, isto é, anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR e anti-NK1.1.
6. Incubar por 1 hora no gelo.
7. Lavar as células com 1 ml de Tampão de Coloração. Centrifugar as células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante.
8. Ressuspender as células em 100 ul de PBS.
9. Transferir as células para um tubo de plástico de citometria de fluxo.
10. Utilizando um citómetro de fluxo, adquirir pelo menos 5.000-10.000 eventos. Apropriados controlos de células não coradas e amostras de compensação fluorocromo devem ser incluídos, conforme necessário.
11. Analisar os resultados usando o software apropriado citometria de fluxo.

Resultados

Os resultados na Fig. 2 percentagens de shows e números absolutos de diferentes populações BSL recuperados de cérebros de ratos perfundidos ou não perfundidada controle de infectados com malária e ingênua. BSL isolado foram coradas com PE-anti-NK1.1 e APC-anti-TCR-β anticorpos, tal como indicado no texto Protocolo. Consistente com resultados anteriores ^7-9, as células T αβTCR ⁺ compreendia uma elevada proporção da piscina BSL perfundidos em cérebros de ratos infectados com malária (d...

Discussão

O isolamento e análise de BSL é um método que permite a caracterização e quantificação de células inflamatórias migram para o cérebro, em resposta a uma lesão tecidual ou infecção em modelos de ratos experimentais. A introdução de um passo de perfusão intracardíaca para a remoção do compartimento de sangue antes da extracção orgânica e o isolamento subsequente das células é útil para prevenir a contaminação de células inflamatórias com não-inflamatórios leucócitos circulantes. Isto pode n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
			Soluções e tampões
Azur Giemsa de eosina solução azul de metileno	Merck Millipore	1.09204.0500	Diluição de 1:10 em água destilada
Meio RPMI			Rato tonicidade
Rato tonicidade PBS			Fosfato de sódio 20 mM, NaCl 0,149, pH 7,3
0,4% Trypan Blue	Sigma Aldrich	T-8154	Diluição 1:2
Colagenase D	Worthington Biochemical
Deoxyribonuclease (DNAse) I	Sigma Aldrich	D4263-5VL	A partir de pâncreas bovino
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	Solução a 30% em PBS
Ultrapura Tris	Invitrogen	15505-020
Cloreto de amônio (NH 4 Cl)	AnalaR	10017
Tampão de Lise Red Cell			17 mM Tris, 14NM NH 4 Cl, pH 7,2
FCS	Gibco	1009
EDTA sal dissódico	Merck	10093.5V	0,1 M, pH 7,2
			Os anticorpos e os conjugados
Anti-rato CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2	BD Pharmingen	553142	1 ul de tampão de coloração em 50 ul (0.5mg/50 ml)
FITC anti-ratinho, clone CD4 H129.19	BD Pharmingen	553651
PE-anti-rato NK1.1, clone PK136	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5 anti-rato CD8, clone 53-6-7	BD Pharmingen	551162
APC-anti-rato de TCR-β clone, H57-597	BD Pharmingen	553174
PE-anti-rato CXCR3, clone 220803	R & D Systems	FAB1685P
Biotinilado anti-CCR5 do mouse, clone C34-3448	BD Pharmingen	559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
			Equipamento e material
SuperFrost lâmina de microscópio	Lomb Menzel-Gläser
Pinça de dissecção, tesoura	REDA Instrumente
500 ml de PBS reservatório	Nalgene
Tubo de borracha
Agulha de 23G	BD PrecisionGild	302008
Dissociação celular kit contendo metal peneira	Sigma Aldrich	CD-1
70 filtro de células mM nylon	BD Falcon	352350
Hemocitômetro	Neubauer GmbH	717810
Citometria de fluxo de tubos	BD Falcon	352008