Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA topi infettati

Riepilogo

Un metodo per l'isolamento di aderenti leucociti infiammatori dai vasi sanguigni cerebrali dei Plasmodium berghei ANKA topi infettati è descritto. Il metodo consente la quantificazione e caratterizzazione fenotipica di leucociti isolati dopo colorazione con anticorpi fluorescenti e successiva analisi mediante citometria a flusso.

Abstract

Si descrive un metodo per l'isolamento e la caratterizzazione di cellule infiammatorie aderenti da vasi sanguigni cerebrali di P. berghei ANKA topi infettati. L'infezione di ceppi sensibili del mouse con questo risultati di deformazione parassita nella induzione di sperimentale malaria cerebrale, una sindrome neurologica che riassume alcuni aspetti importanti del Plasmodium falciparum mediata da malaria grave in ^1,2 esseri umani. Forme mature di sangue stadi malaria esprimere proteine ​​parassite sulla superficie del eritrociti infetti, che consente loro di legarsi a cellule endoteliali vascolari. Questo processo induce ostruzioni del flusso sanguigno, causando ipossia e ³ emorragie e stimola anche il reclutamento di leucociti infiammatori al sito di sequestro parassita.

A differenza di altre infezioni, ad esempio virus neutrotopic ^4-6, sia la malaria-parassitati globuli rossi (PRBC), così come associati inflammleucociti stre rimangono sequestrati all'interno dei vasi sanguigni e non infiltrante il parenchima cerebrale. Perciò, per evitare la contaminazione di leucociti sequestrati con cellule circolanti non-infiammatorie, ampia perfusione intracardial di topi infetti-prima dell'estrazione di organi e lavorazione dei tessuti è necessario in questa procedura per rimuovere il comparto sangue. Dopo la perfusione, i cervelli vengono raccolte e sezionati in piccoli pezzi. La struttura del tessuto è ulteriormente disturbato da trattamento enzimatico con collagenasi D e DNAsi I. L'omogenato cerebrale risultante viene poi centrifugato su un gradiente di Percoll che permette la separazione dei cervelli sequestrati leucociti (BSL) mielina e detriti da altri tessuti. Cellule isolate vengono quindi lavate, contati utilizzando un emocitometro e colorate con anticorpi fluorescenti per la successiva analisi mediante citometria a flusso.

Questa procedura consente una completa caratterizzazione fenotipica dei leucociti infiammatori migrazione al cervello in response a vari stimoli, compreso il colpo così come le infezioni virali o parassitarie. Il metodo prevede anche un utile strumento per la valutazione di nuovi trattamenti antinfiammatori in pre-clinici modelli animali.

Protocollo

1. L'infezione di topi con P. berghei-ANKA

1. Sbrinamento un'aliquota di crioconservati P. berghei ANKA PRBC.
2. Trattenere una malaria cerebrale resistente topo BALB / c donatore (8-12 settimane di età) con la tecnica a due mani di ritenuta. Iniettare il mouse con 100-200 ml di PRBC utilizzando un insulina siringa da 1 ml (28G ago). Di routine, 1-2 topi donatori vengono iniettati.
3. In 4-5 giorni post-infezione (pi) rimuovere topo donatore da gabbia e collocarla su una workstation o un tampone monouso di lavoro.
4. Delicatamente frenare il mouse alla fine della coda e con le forbici piccole tagliare la punta della coda (circa 1 mm). In alternativa, una foratura piccola coda usando un ago 25 G può essere eseguita.
5. Una goccia di sangue dalla vena della coda del topo in prossimità della fine di un frosted-end vetrino da microscopio.
6. Posizionare una seconda slitta (spreader) su un angolo di 45 ° e sostenerlo nella goccia di sangue. Una volta che il sangue si estende lungo il bordo, premere il divaricatore-slide vigiliaolo attraverso il vetrino da microscopio per rendere la striscio di sangue. Lasciare lo striscio asciugare all'aria.
7. Fissare strisci di sangue in metanolo 100% per 30 sec e poi colorare i vetrini in Giemsa appena preparato per 10 min.
8. Sciacquare striscio di sangue con acqua corrente per 1 minuto, permette di asciugare vetrino ed esaminare al microscopio (100x, immersione in olio). Enumerare PRBC nel 1000 eritrociti e calcolare parassitemia per cento. Topi donatori dovrebbero raggiungere livelli parassitemia tra il 2,5-5% prima di poter essere sanguinato per infezione di animali da laboratorio.
9. Raccogliere il sangue dal topo donatore da retro-orbitale sanguinamento usando un micro-ematocrito eparinizzata tubo capillare. Tutti gli esperimenti sono eseguiti in conformità con la Sala Walter & Eliza Istituto animali previste dal Comitato Etico. A seconda delle esigenze locali animali Ethic Comitatologia sanguinamento altre potrebbero essere utilizzate. Sciogliere quantità di sangue in mezzo RPMI ad una concentrazione finale di 1x10 ⁶ pRBC/0.2 ml. Si consideri cheun ematocrito normale mouse è ~ 6x10 ⁹ cellule rosse del sangue / 1 ml.
10. Infect C57BL sperimentale / 6 topi (8-12 settimane) iniettando per via intraperitoneale (ip) 1x10 ⁶ pRBC/0.2 ml.
11. Per monitorare i livelli di parassitemia di topi infettati seguire i passaggi 1,3-1,8. Parassitemia deve essere determinato ogni 2-3 giorni a partire dal giorno 2 o 3 pi
12. Insorgenza di malaria grave in C57BL / 6 topi potrebbe manifestarsi come aspetto ingobbito, ruffed pelliccia e bassa attività. Alcuni topi possono recuperare in questa fase, ma la progressione della perdita di auto-raddrizzante riflesso indica malattia irreversibile e gli animali devono essere sottoposti a eutanasia.

2. Perfusione Intracardial di topi e di estrazione del cervello

1. Assemblare un sistema manuale di perfusione gravità assicurando un serbatoio di 500 ml di una colonna di supporto fissato alla parte superiore di una colonna di supporto 60 cm. Collegare tubo di plastica per l'estremità inferiore del serbatoio e fissare un morsetto del tubo per controllare il flusso del buffer. Collegare il tubo di un ago 23 G. Fill il serbatoio con PBS (mantenuto a 22 ° C), aprire la fascetta e permettono di eseguire tampone attraverso il tubo per rimuovere tutte le bolle d'aria.
2. Eutanasia P. berghei ANKA-infetto mouse CO ₂ inalazione. Confermare la morte per mancanza di pedale, orbitale e le risposte respiratorie.
3. Pin del mouse eutanasia dalle zampe posteriori e anteriori dorsalmente su una tavola di dissezione di polistirolo contenute in un vassoio di plastica. A seconda del locale Comitato di Etica degli animali anestesia requisiti possono essere somministrati prima di inizio pefusion intracardial.
4. Pulire lato ventrale con il 70% di etanolo.
5. Usare le forbici grandi e pinze per aprire la pelle lungo la linea mediana per esporre la cavità toracica. Piegare la pelle e il pin ai lati.
6. Tenere sterno con pinza sottile e tagliare il diaframma e lungo i due lati dello sterno tranciamento delle costole. Fare attenzione a non danneggiare i grandi vasi sanguigni.
7. Pin la gabbia toracica dalla sterno liberamente accanto alla testa.
8. Tenere spirito ventricolih pinza sottile e accuratamente incise atrio destro con le forbici sottili.
9. Inserire l'ago 23G collegato al sistema di perfusione gravità in ventricolo sinistro verso l'aorta ascendente, mentre è in esecuzione PBS. Inserire solo 0,5 cm dalla punta dell'ago.
10. Perfusione del mouse per 5 minuti o fino a quando effluenti è chiara.
11. Sblocca il mouse e lo posi sul suo addome. Pulire la testa con il 70% di etanolo.
12. Utilizzando le forbici grandi, fare un taglio appena sopra la zona cervicale del midollo spinale.
13. Utilizzare le forbici pregiati per fare una mediana caudale-rostrale taglio a partire dalla base del cranio e la pelle a buccia per scoprire l'cranio.
14. Tenendo la testa, posizionare le lame di una forbice piccole in ciascuna cavità orbitale ed effettuare un taglio tra le orbite.
15. Praticare un taglio longitudinale lungo la sutura sagittale e con attenzione buccia il teschio su ogni emisfero del cervello verso l'esterno.
16. Con una spatola, sollevare delicatamente il cervello e metterlo in una provetta da centrifuga da 10 ml contenente mezzo RPMI.

3. Isolamento di Brain-sequestrati leucociti (BSL)

1. Lavorare in una cappa di sicurezza, posto appena prelevato cervello sopra un filtro in acciaio inossidabile cella (40-60 maglia) in una piastra Petri contenente 3-5 ml di mezzo di coltura RPMI tessuto.
2. Tagliare il tessuto cerebrale in piccoli pezzi.
3. Spingere piccoli pezzi di tessuto cerebrale attraverso il filtro cella utilizzando uno stantuffo cristallo.
4. Trasferire omogenato cerebrale in una provetta da 10 ml e centrifugare a 250 xg per 10 min a 4 ° C.
5. Sciogliere pellet in 3 ml di mezzo RPMI, contenente 0,05% Collagenase D e 2U/ml DNAsi I.
6. Ruotare miscela per 30 min a temperatura ambiente. Rimuovere i detriti cellulari spingendo la miscela attraverso un filtro 70 micron cella nylon e / o mediante incubazione in ghiaccio per 5 min.
7. Lay omogenato cerebrale su un cuscino 7 ml di Percoll 30% e centrifugare a 400 xg (senza freni) per 20 min a temperatura ambiente.
8. Risospendere il pellet in 1 ml di tampone di lisi cellulare rosso sangue e incubare in ghiaccio per 5 min alisare PRBC aderente, che non può essere rimosso dal cervello mediante perfusione intracardial.
9. Aggiungere 9 ml di terreno RPMI, lavare le cellule e centrifugare a 250 xg per 10 min a 4 ° C.
10. Risospendere BSL contenenti pellet in 50-100 ml di mezzo RPMI e trasferire le cellule su un tubo Eppendorf.
11. Diluire un'aliquota 5-10 microlitri del campione cellulare 1:2 in Trypan blu per l'identificazione di cellule vitali.
12. Contare le cellule vitali al microscopio utilizzando un emocitometro. Dal giorno 6 in poi, quando pi P. berghei ANKA topi infettati mostrare segni neurologici, 20,000-100,000 BSLs possono essere recuperati.

4. Tipizzazione di BSL di Citometria a Flusso Multicolor

1. Centrifugare le cellule a 250 xg per 10 min a 4 ° C, aspirare il surnatante e risospendere pellet in 50 pl di tampone colorazione (PBS, 1% di siero fetale bovino (FCS), 2 mM EDTA).
2. Aggiungere il 1 ml di anticorpo purificato anti-CD16/32 (Fcblock).
3. Incubare le cellule per 10 min in ghiaccio.
4. Lavare le cellule con 1 ml di tampone di colorazione. Centrifugare le cellule a 250 xg per 10 min a 4 ° C e aspirare il surnatante.
5. Risospendere le cellule in 50 pl di tampone contenente colorazione diluizioni ottimali predeterminate di richieste anticorpi fluorescenti, ovvero anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR e anti-NK1.1.
6. Incubare per 1 ora su ghiaccio.
7. Lavare le cellule con 1 ml di tampone di colorazione. Centrifugare le cellule a 250 xg per 10 min a 4 ° C e aspirare il surnatante.
8. Risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS.
9. Trasferire le cellule a un tubo di plastica di citometria a flusso.
10. Utilizzando un citofluorimetro, acquisire almeno 5.000-10.000 eventi. Adeguati controlli e campioni di cellule non marcate con fluorocromi di compensazione dovrebbe essere incluso come richiesto.
11. Analizzare i risultati utilizzando il software appropriato citometria a flusso.

Risultati

I risultati in Fig. 2 percentuali di spettacoli e di numeri assoluti delle diverse popolazioni BSL recuperati da cervelli di perfusi o unperfused topi di controllo della malaria-infettati e ingenuo. Isolato BSL sono state colorate con PE-anti-NK1.1 e APC-anti-TCR β-anticorpi, come indicato nel testo del protocollo. In linea con i risultati precedenti ^7-9, αβTCR ⁺ cellule T comprende una percentuale elevata della piscina BSL nel cervello di perfusi malaria topi infettati (giorno 6 pi). Questa pop...

Discussione

L'isolamento e l'analisi di BSL è un metodo che permette la caratterizzazione e la quantificazione delle cellule infiammatorie migrazione al cervello in risposta al danno tissutale o infezione in modelli murini sperimentali. L'introduzione di una fase di perfusione intracardial per la rimozione del comparto sangue prima dell'estrazione organi e isolamento cellulare successiva è utile per prevenire la contaminazione di cellule infiammatorie con leucociti circolanti non-infiammatorie. Questo potrebbe non...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
			Soluzioni e tamponi
Giemsa azur eosina blu metilene soluzione	Merck Millipore	1.09204.0500	Diluizione 1:10 in acqua distillata
RPMI media			Mouse tonicità
Mouse tonicità PBS			20 mM fosfato di sodio, 0,149 NaCl, pH 7,3
0,4% Trypan Blue	Sigma Aldrich	T-8154	1:2
Collagenasi D	Biochimica Worthington
Deoxyribonuclease (DNAsi) I	Sigma Aldrich	D4263-5VL	Da pancreas bovino
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	Soluzione al 30% in PBS
Ultrapura Tris	Invitrogen	15505-020
Cloruro di ammonio (NH 4 Cl)	AnalaR	10017
Red Cell Lysis Buffer			17 mM Tris, 14nM NH 4 Cl, pH 7,2
FCS	Gibco	1009
EDTA sale disodico	Merck	10093.5V	0,1 M, pH 7,2
			Anticorpi e coniugati
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2	BD Pharmingen	553142	1 ml in 50 microlitri tampone di colorazione (0.5mg/50 ml)
FITC-anti-topo CD4, clone H129.19	BD Pharmingen	553651
PE-anti-topo NK1.1, clone PK136	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5-anti-topo CD8, clone 53-6-7	BD Pharmingen	551162
APC-anti-topo TCR-β, clone H57-597	BD Pharmingen	553174
PE-anti-topo CXCR3, clone 220803	R & D Systems	FAB1685P
Biotinilato anti-topo-CCR5, clone C34-3448	BD Pharmingen	559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
			Attrezzature e materiali
SuperFrost vetrino da microscopio	Lomb Menzel-Glaser
Pinze, forbici dissezione	REDA Instrumente
500 ml PBS serbatoio	Nalgene
Tubi in gomma vulcanizzata
Ago 23G	BD PrecisionGlide	302008
Cella dissociazione kit contenenti metalli setaccio	Sigma Aldrich	CD-1
70 micron nylon filtro cella	BD Falcon	352350
Emocitometro	Neubauer GmbH	717810
Citometria a Flusso tubi	BD Falcon	352008