Выделение и анализ Brain-секвестрированных лейкоцитов из<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-инфицированных мышей

Резюме

Метод выделения приверженцем воспалительных лейкоцитов из мозга кровеносных сосудов Plasmodium berghei ANKA-инфицированных мышей описано. Метод позволяет количественное, а также фенотипической характеристике изолированного лейкоцитов после окрашивания флуоресцирующих антител и последующий анализ с помощью проточной цитометрии.

Аннотация

Мы описываем метод выделения и характеристика приверженцем воспалительных клеток из мозга кровеносных сосудов P. berghei ANKA-инфицированных мышей. Заражение восприимчивых мыши штаммов с этим паразитом результаты напряжение в индукционной экспериментальной церебральной малярии, неврологического синдрома, который повторяет некоторые важные аспекты Plasmodium тропической опосредованной тяжелой малярии в ^1,2 человека. Зрелые формы крови стадии малярии выразить паразитарных белков на поверхности зараженных эритроцитов, что позволяет им связываться с сосудистых эндотелиальных клеток. Этот процесс вызывает препятствия в кровоток, что приводит к гипоксии и кровоизлияния ^3, а также стимулирует набора воспалительных лейкоцитов к месту паразита углерода.

В отличие от других инфекций, т.е. neutrotopic вирусы ^4-6, как малярия зараженных эритроцитов (PRBC), а также связанные InflammAtory лейкоцитов оставаться поглощенным в кровеносных сосудах, а не проникают в паренхиму мозга. Таким образом, чтобы избежать загрязнения поглощенных лейкоцитами с невоспалительные циркулирующих клеток, обширная внутрисердечной перфузии зараженных мышей до извлечения органов и тканей, обработка требуется в этой процедуре, чтобы удалить кровь отсека. После перфузии мозга собирают и расчлененные на мелкие кусочки. Структуры тканей в дальнейшем нарушается ферментативной обработки с коллагеназы D и ДНКазы I. В результате мозг гомогенат центрифугировали в градиенте Percoll, который позволяет разделение мозга секвестрированных лейкоцитов (BSL) из миелина и другим мусором ткани. Изолированные клетки затем промывают, рассчитывали с использованием гемоцитометр и окрашенных флуоресцирующих антител для последующего анализа методом проточной цитометрии.

Эта процедура позволяет комплексно фенотипическая характеристика воспалительных лейкоцитов мигрируют в мозг, в реответа на различные раздражители, в том числе инсульта, а также вирусных и паразитарных инфекций. Этот метод также является полезным инструментом для оценки романа противовоспалительное лечение в доклинических моделях животных.

протокол

1. Заражение мышей с P. berghei-ANKA

1. Размораживание аликвоты криоконсервированных P. berghei ANKA PRBC.
2. Сдерживать церебральной малярии, устойчивых BALB / с донорами мышь (8-12 недель от роду) с помощью двуручной сдержанность техники. Inject мыши с 100-200 мкл PRBC использованием 1 мл инсулиновый шприц (игла 28G). Регулярно, 1-2 мышей-доноров вводят.
3. На 4-5 дней после заражения (PI) удалить доноров мыши из клетки и поместить его на рабочую станцию ​​или одноразовой рабочей площадки.
4. Аккуратно сдерживать мыши к концу хвоста и с помощью небольших ножниц разрезать кончик хвоста (около 1 мм). Кроме того, небольшой прокол хвост использованием 25 G игла может быть выполнена.
5. Поместите каплю крови из хвостовой вены мыши ближе к концу матового конца микроскопа.
6. Поместите второй слайд (распределитель) на угол 45 ° и обратно его в каплю крови. Как только кровь распространяется по краю, нажмите на разбрасыватель-слайд наканунеолько через стекло микроскопа, чтобы сделать мазок крови. Разрешить мазка высохнуть на воздухе.
7. Исправить мазках крови в 100% метаноле в течение 30 секунд, после чего пятно слайды в свежеприготовленный Гимза в течение 10 мин.
8. Промыть мазок крови с проточной водой в течение 1 мин, позволяют воздушно-сухой и изучить слайд под микроскопом (100х, масло погружение). Перечислить PRBC в пределах 1000 эритроцитов и вычислить процент паразитемии. Донор мышей должна достичь уровня паразитемии между 2.5-5%, прежде чем они могут быть кровь для заражения экспериментальных животных.
9. Сбор крови от донора мышь ретроорбитального кровотечение использованием гепаринизированной микрогематокритовых капиллярной трубке. Все эксперименты проводятся в соответствии с Уолтером и Элизы зале института животных этики требования комитета. В зависимости от местных требований этики животных Комитета другие процедуры кровотечения могут быть использованы. Растворите необходимое количество крови в среде RPMI в конечной концентрации 1x10 ⁶ pRBC/0.2 мл. Считают, чтонормальный гематокрит мышь ~ 6x10 ⁹ красных кровяных клеток / 1 мл.
10. Infect экспериментальных мышей C57BL / 6 (8-12 недель) путем введения внутрибрюшинно (IP) 1x10 ⁶ pRBC/0.2 мл.
11. Для контроля уровня паразитемии зараженных мышей выполните шаги 1.3-1.8. Паразитемии должны определяться каждые 2-3 дней, начиная с дня 2 или 3 пи
12. Возникновение тяжелых форм малярии в C57BL / 6, может проявляться в виде сгорбленной внешний вид, гривистый меха и низкой активности. Некоторые мыши могут восстановиться на этой стадии, но прогресс в потере чувства собственного рефлекса указывает необратимые заболевания и животные должны быть умерщвлены.

2. Внутрисердечной перфузии мозга мышей и добыча

1. Соберите эксплуатации системы перфузии тяжести, обеспечивая 500 мл резервуар колонки держатель крепится к верхней части 60 см колонки стенде. Подключите пластиковые трубы в нижней части водохранилища и обеспечить трубки зажим для управления буфером потока. Прикрепите трубки к 23-игла G. Фильл до резервуара с PBS (хранится при температуре 22 ° C), откройте зажим и позволяют буфера проходят через трубку, чтобы удалить все пузырьки воздуха.
2. Усыпить P. berghei ANKA-инфицированные мыши, CO ₂ ингаляции. Подтверждение смерти из-за отсутствия педали, орбитальных и дыхательных реакций.
3. Pin эвтаназии мыши, задние и передние лапы сверху на доску из пенопласта рассечение, содержащиеся в пластиковый лоток. В зависимости от местной анестезии животных этика комитет требования могут быть введены до начала внутрисердечной pefusion.
4. Протрите брюшной стороне с 70% этанола.
5. Используйте большие ножницы и щипцы, чтобы открыть кожу вдоль средней линии, чтобы разоблачить грудной полости. Fold и контактный кожи в стороны.
6. Держите грудины с тонким пинцетом и сократить диафрагму и по обе стороны от грудины, отделяя ребра. Будьте осторожны, чтобы не повредить крупные кровеносные сосуды.
7. Pin грудной клетки от грудины свободно рядом с головой.
8. Держите желудочков остроумиеч штраф пинцетом и аккуратно надрезать правого предсердия с мелкими ножницами.
9. Вставьте 23G иглой тяжести системы перфузии в левом желудочке к восходящей аорты в то время как PBS работает. Вставьте всего 0,5 см от кончика иглы.
10. Заливать мыши в течение 5 мин или пока стоков ясно.
11. Изъять мыши и положить его на свой живот. Протрите головой с 70% этанола.
12. Использование больших ножниц, сделать разрез чуть выше шейного отдела спинного области мозга.
13. Использование тонких ножниц, чтобы средний хвостовой-ростральной разрез, начиная с основания черепа и очистить кожу от разоблачить черепа.
14. Держа голову, поместить лопасти маленькие ножницы в каждой орбитальной полости и сделать разрез между орбитами.
15. Сделайте продольный разрез вдоль сагиттального шва и тщательно очистить череп на каждого полушария мозга наружу.
16. Используя лопаточку, осторожно поднимите мозга и поместить его в 10 мл центрифужную пробирку, содержащую RPMI среде.

3. Выделение Brain-секвестрированных Лейкоциты (BSL)

1. Работая в безопасности кабинета, место свежесобранных мозг на верхней части фильтра из нержавеющей стали клетки (40-60 размер ячейки) в чашку Петри, содержащую 3-5 мл RPMI среде тканевой культуры.
2. Отрежьте ткань мозга на мелкие кусочки.
3. Нажмите небольшие кусочки ткани мозга через ячейку фильтра использованием плунжера кристалла.
4. Передача гомогената мозга в 10 мл трубки и центрифуги при 250 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
5. Растворить осадок в 3 мл среды RPMI, содержащей 0,05% коллагеназы D и 2U/ml ДНКазы I.
6. Поверните смесь в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалите остатки клеток, нажав на смесь через 70 мкм нейлоновый фильтр клеток и / или путем инкубации на льду в течение 5 мин.
7. Положите гомогената мозга на 7 мл 30% подушке Percoll и центрифуге при 400 х г (без тормозов) в течение 20 мин при комнатной температуре.
8. Ресуспендируют осадок в 1 мл красного буфера для лизиса клеток крови и инкубируют на льду в течение 5 минлизировать приверженцем PRBC, которые не могут быть удалены из мозга внутрисердечной перфузии.
9. Добавить 9 мл среды RPMI, мыть клетки и центрифуги при 250 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
10. Ресуспендируют BSL-содержащих гранулы в 50-100 мкл RPMI среде и передачи клеткам трубки Эппендорф.
11. Развести 5-10 мкл аликвоты образец клеток 1:2 в трипанового синего для идентификации жизнеспособных клеток.
12. Граф жизнеспособных клеток под микроскопом, используя гемоцитометра. Из 6-й день пи года, когда П. berghei ANKA-инфицированные мыши обнаруживают неврологические симптомы, 20,000-100,000 BSLs могут быть восстановлены.

4. Иммунофенотипирование из BSL по многоцветной проточной цитометрии

1. Центрифуга клетки при 250 х г в течение 10 мин при 4 ° C, аспирации супернатант и ресуспендируют осадок в 50 мкл окрашивания буфера (PBS, 1% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 2 мм EDTA).
2. Добавить 1 мкл очищенного anti-CD16/32 антител (Fcblock).
3. Инкубировать клетки в течение 10 мин на льду.
4. Вымойте клеток в 1 мл буфера окрашивания. Центрифуга клетки при 250 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и аспирации супернатант.
5. Ресуспендируют клеток в 50 мкл буфера, содержащего Окрашивание заранее определенного оптимального разведения необходимые флуоресцирующих антител, т. е. анти-CD4, анти-CD8, анти-TCR и анти-NK1.1.
6. Выдержите в течение 1 часа на льду.
7. Вымойте клеток в 1 мл буфера окрашивания. Центрифуга клетки при 250 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и аспирации супернатант.
8. Ресуспендируют клеток в 100 мкл PBS.
9. Передача клетки пластиковой трубки проточной цитометрии.
10. С помощью проточной цитометрии, приобретают по крайней мере 5,000-10,000 событий. Соответствующие неокрашенных контроль клетку и флуорохромом образцов компенсации должны быть включены по мере необходимости.
11. Анализ результатов с помощью соответствующего программного обеспечения проточной цитометрии.

Результаты

Результаты на рис. 2 показывают проценты и абсолютные числа различных BSL населения оправился от мозгов перфузии или unperfused-инфицированных малярией и наивно контрольных мышей. Изолированные BSL окрашивали PE-анти-NK1.1 и APC-анти-TCR-β антитела, как указано в тексте Протокола. В соответствии с пр?...

Обсуждение

Выделения и анализа BSL это метод, который позволяет характеристика и количественная воспалительных клеток мигрируют в мозг в ответ на повреждение ткани или инфекции в экспериментальной модели мышей. Введение внутрисердечной шаг перфузии для удаления крови отсека до извлечения орган?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
			Решения и буферы
Берег Гимза в эозином метиленовым синим решения	Merck Millipore	1.09204.0500	Разведении 1:10 в дистиллированной воде
RPMI среде			Мышь тонуса
Мышь тонус PBS			20 мМ фосфат натрия, 0,149 NaCl, рН 7,3
0,4% трипанового синего	Sigma Aldrich	T-8154	1:02 разбавление
Коллагеназа D	Уортингтон Биохимические
Deoxyribonuclease (ДНКазы) я	Sigma Aldrich	D4263-5VL	Из бычьей поджелудочной железы
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	30% раствор в PBS
Ultrapure Tris	Invitrogen	15505-020
Хлорида аммония (NH 4 Cl)	AnalaR	10017
Красный буфера лизиса клеток			17 мМ Tris, 14nM NH 4 Cl, рН 7,2
FCS	Gibco	1009
ЭДТА динатриевая соль	Merck	10093.5V	0,1 М, рН 7,2
			Антитела и конъюгаты
Anti-мышь CD16/CD32 (Fc Block), клон 2.4G2	BD Pharmingen	553142	1 мкл в 50 мкл буфера окрашивания (0.5mg/50 мл)
FITC анти-CD4 мыши, клон H129.19	BD Pharmingen	553651
PE-анти-мышиных NK1.1, клон PK136	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5-анти-CD8 мыши, клон 53-6-7	BD Pharmingen	551162
APC-анти-мышь TCR-β, клон H57-597	BD Pharmingen	553174
PE-анти-мышиных CXCR3, клон 220803	R & D Systems	FAB1685P
Биотинилированных анти-мышь CCR5, клон C34-3448	BD Pharmingen	559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
			Оборудование и материалы
SuperFrost стекло микроскопа	Lomb Менцель-Gläser
Препарирование щипцы, ножницы	REDA Instrumente
500 мл PBS водохранилище	Nalgene
Резиновые трубки
23G иглу	BD PrecisionGlide	302008
Клеточная диссоциация набор, содержащий металлическое сито	Sigma Aldrich	CD-1
70 мкм фильтр клетки нейлон	BD Falcon	352350
Гемоцитометр	GmbH Neubauer	717810
Трубы проточной цитометрии	СиD Сокол	352008