Prostaglandin Ekstraksiyon ve Analiz<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Özet

Bu yazıda, prostaglandin ve diğer eikozanoidler çıkarma ve analiz için optimize edilmiş bir prosedür tarif C. elegans LC-MS/MS kullanarak.

Özet

Caenorhabditis elegans lipidler ^1-9 biyolojisi okumak için güçlü bir hayvan modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Prostaglandinler, çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) ^10-14 türetilmiş lipit sinyallerdir eikosanoidlerin önemli bir sınıfı vardır. Bu sinyal molekülleri nedeniyle düşük bolluk ve reaktif doğanın çalışma zordur. Prostaglandin karakteristik özelliği, yağlı asit omurga içinde yer alan, bir siklopentan halka yapısıdır. Memelilerde, prostaglandinler siklooksigenaz-bağımlı ve bağımsız yol ^10,15 yoluyla oluşturulabilir. ° C. elegans siklooksijenazların ^6,16,17 bağımsız prostaglandin geniş bir dizi sentezler. F-serisi prostaglandinlerin büyük bir sınıfı tespit, ama eikozanoidler çalışma yeni keşifler için bol bol yer ile erken bir aşamada değil. Burada prostaglandin ve diğer eikozanoidler çıkarma ve analiz etmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Ücretli lipids, bir sıvı-sıvı ekstraksiyon tekniği ile kütle solucan kültürlerden gelen ekstre edilmiş ve bir elektrosprey iyonlaştırmalı tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) birleştirilmiş sıvı kromatografisi ile analiz edilir. Gibi _{α-D 4} PGF ₂ gibi prostaglandinlerin döteryumlu analogları dahil edilmesi, dahili bir standart kantitatif analiz için tavsiye edilir gibi. Çoklu reaksiyon takip işlemi veya MRM yabani tip ve mutant hayvanlar arasındaki spesifik prostaglandin tipi ölçmek ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Çarpışma bağlı ayrışma veya MS / MS önemli yapısal özellikler hakkında bilgi elde etmek için kullanılabilir. Sıvı kromatografi kütle spektrometrisi (LC-MS), m / z 315-360 olarak seçilen bir kütle aralığı diğer taramalar prostaglandin seviyeleri küresel değişiklikleri değerlendirmek için de kullanılabilir. Hepimiz üç analizlerin örnekler sağlar. Bu yöntemler yeni eikozanoidler keşfetmek ve metabolik yollar sınırlarını belirleyen bir araç ile araştırmacılar sağlayacaktır.

Giriş

Prostaglandinler (PG) yoğun bir şekilde araştırılmıştır ve organizmaların ^12-14 geniş bir dizi üreme, bağışıklık ve gelişim düzenlenmesinde suçlanmıştır lipid hormonların önemli bir sınıfıdır. Bunlar, ortak bir ön-madde (ler) den elde edilen lipidlerin bir dizi oluşturan nedeniyle PG ideal kapsamlı sistem biyoloji analizler için uygundur. Nematod ° C. elegans genetik ve sistem biyolojisi temel soruları için en yaygın olarak kullanılan model organizmalar biridir.

Bu çalışma sonucunda C. elegans F-serisi PG sentezler bu oosit ^3,6,16 için hareketli sperm kılavuzu. Sırasıyla, üç, dört ve beş çift bağ, F1 ihtiva eden, F2, F3 sınıflar, 20-karbon PUFA elde edilen F-serisi PG ^3,16 tespit edilmiştir. Bu PG siklooksijenaz enzimler bağımsız olarak sentezlenmiş ama PGF _1α ve PGF, _2α stereoizomerler de ge vardırnerated. C. kalitatif ve kantitatif analizleri için elegans PG, LC-MS/MS güçlü ve duyarlı bir analitik tekniktir. Bu analiz yapmadan önce, bu analitik sürecin performansı ağır özü kalitesine bağlıdır çünkü optimize edilmiş bir ekstraksiyon yöntemi geliştirmek önemlidir. Sıvı kromatografi ve kütle spektrometresi yalnızca oranı (m / z) şarj etmek için beklenen kitle, hem de PG ana iyonu arasında arzu edilen bir tepe şekli ve saklama süresi sağlayabilir. C. PG metabolik profil elegans çeşitli MS satın alma stratejileri gerektiren zor bir iştir.

LC-MS tam tarama veya anket tarama (Q1 tarama) çoğu iyonize PG bir kitle spektrometrik yanıt üretecektir sağlanması avantajına sahiptir. Araştırma tarama yabani tip ve mutant C ile ilgili PG toplam profil hakkında bilgi sağlar iken elegans, küçük PG algılama düşük hassasiyeti nedeniyle tehlikeye düşer. Buna rağmendaha az, LC-MS anket tarama PG küresel bir görünüm vermek ve büyük bir PG nüfusun metabolizmasını etkileyen tahmin mutantlar analiz için yararlıdır olabilir.

Metabolizma tanımlama olarak, kimyasal olarak sentezlenmiş bir PG standartların LC-MS/MS analizine göre, referans bileşikleri gibi, ürün iyon spektrumları elde etmek için gerçekleştirilir. Bu spektrum, bilinmeyen bir metaboliti spektrumuna karşılaştırılabilir. Çoklu reaksiyon takip işlemi (MRM) modu daha iyi bir hassasiyet ve özgüllük için kullanılır. MRM bir deney, bir bileşiğin, ana iyonu / ürün iyon kütle geçişi belirleyerek gerçekleştirilir. Hedef analitlerin kütle ve yapısı bilerek, çok bilinmeyen metabolitleri için teorik MRM geçişleri tahmin etmek mümkündür.

C. izomerik PG profil için optimize edilmiş bir LC-MS/MS yöntemi elegans bildirilmemiştir. Burada, LC-MS ve oluşan bir ekstraksiyon ve entegre bir kütle spektrometresi yaklaşım tarif LC-, Tespit miktarının, ve C araştırmak için MS / MS yöntemleri elegans PG metabolitleri. Bu yaklaşım, başka bir eikosanoidlerin uygulanabilir.

Protokol

Solucanı kültürü, prostaglandin ekstraksiyon ve prostaglandin analizi: Aşağıda tarif edilen protokole üç bölüme ayrılmıştır. Belirtildiği gibi örnekleri geçici olarak -80 ° C veya -20 ° C'de saklanabilir zaman, birden fazla nokta vardır

1. Worm Kültür

Biz kapsamlı LC-MS/MS karışık aşamada solucanlar yaklaşık 6 gr tavsiye ederiz. Bu saptama, en az altı ayrı enjeksiyon için yeterli malzeme sağlamalıdır. Tek bir enjeksiyon ya da iki MRM tarafından bilinen PG ölçümü için, 1-2 gram yeterli olacaktır. Belli bir aşamada oluşan senkronize kültürleri özler analizi, aynı zamanda mümkündür. Kadar 4 farklı suşları aynı anda yetiştirilebilir. Örneğin, bir vahşi tipli kontrol ve üç farklı mutant.

1. Tamamlayıcı beslenme için 65 (16 cm) X-büyük NGM plakalar ve konsantre bakteri hazırlayın. Tohumlama için NA22 bakteri kullanın. Tamamlayıcı beslenme, Gro için konsantre bakteri yapmak için16-24 saat boyunca LB ortamı içerisinde NA22 w en az dört litre. Aşağı doğru döndürün, M9 tampon 100 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon bakterileri yok. Bu konsantre bakteri çözeltisi 200-400 ml her biri sonsuz bir suş için gerekli olabilir. 4 ° C'de saklayın
2. 5 X-büyük plakaları üzerinde solucan kültür başlayın. Plakaları gebe yetişkinlerin tam kadar yaklaşık 3 ila 4 kuşaktır solucanlar büyütün. Konsantre bakteri açlık önlemek için plakaları eklenir, gerektiğinde (~ 1 ml / plakası ve kapak takmadan önce cihazın tamamen kurumasını bekleyin). Olmalıdır
3. M9 tamponu ile plakalar gebe çift cinsiyetli yıkayın ve bir 50 ml konik polipropilen tüp solucanları toplamak.
4. Gebe çift cinsiyetli alt (genellikle 3-5 dk) yerleşmek için izin verin. Bakteriler, yumurta ve larva aşamasında solucanlar dahil olmak üzere, süpernatantı. 15 ml M9 tampon tekrar süspansiyon ve hafifçe karıştırın.
5. 60 tohumlu NGM plakalar her birine solucan süspansiyonu 200 ul aktarın. Plakalar arasındaki solucanlar dağıtılır. Solucan çözüm karışık tutunde tüm plakaları kadar onlar solucanlar kabaca eşit sayıda aldığınızdan emin olmak için numaralı seribaşı edilmiştir.
6. Açlık önlemek için gerekli (~ 1 ml/plate/12 için 24 saat süre) olarak konsantre bakteri ile Ek. Tabak kapakları değiştirmeden önce kurumaya bırakın. Plakaları gebe yetişkin dolu numaralı seribaşı solucanlar orijinal sayısına bağlı olarak, 2-4 nesiller için solucanlar büyümek, ya da kadar.
7. Hasat solucan plakaları her seferinde bir suşu. M9 tamponu ile plakalar solucanlar yıkayın ve 50 ml polipropilen tüpleri (örneğin 6 tüpler) toplamak. Bir tabak yıkamak için M9 tampon kullanın, sonra bir sonraki plakasına solucan dolu tampon aktarın. Plaka bir dizi (örneğin,. ^10.) yıkandıktan sonra, 50 ml tüp solucan dolu tampon aktarın. M9 tampon ile üst tüpün doldurun. Plakaların geri kalanı için yıkama tekrarlayın.
8. Gravid yetişkin 5-6 dakika içinde dibe olarak, sıvı (~ 35 mi) kaldırmak ve bir ya da iki tüp içine birleştirmek. Fr ile 50 ml tüplere doldurunESH M9 tampon, 3-5 dakika bekletin, ve süpernatant bırakarak gebe yetişkin kaldırın. 3 kez tekrarlayın veya süpernatant saydam oluncaya kadar.
9. Büyük bir delik Pasteur pipeti, iki 15 ml polipropilen konik tüpler için mümkün olduğunca çok sayıda solucan gibi havalesi ile. Bir klinik santrifüj 5 dakika boyunca 1000 RCF (CentraSL2 içinde ~ 3500 rpm) aşağı doğru döndürün. Süpernatantı ve solucanlar aynı tüpte aktarılır ve pelet kadar tekrarlayın. -80 Mümkün ve mağaza solucanlar kadar süpernatant olarak kaldırmak ° C Tüm suşlar için tekrarlayın.

2. Prostaglandin Ekstraksiyon

Çıkarılması için gerekli ayıraçlar aşağıda gösterilmiştir. Bu yöntem Golovko Murphy ¹⁷ değiştirilmiş bir ve LC-MS/MS hassasiyeti artırır sıvı-sıvı temizleme, ardından aseton ekstraksiyonu içerir. Benzer sonuçlar, bir Dounce homojenizatör ile elde edilebilir, ancak bir mermi blender 5 homojenleştirici prosedür kullanılır. Bütillenmiş hydroxytolueNE (BHT) ve azot altında buharlaştırma _(N2) gaz, oksidasyon önlemek için kullanılır. Tüm cam lipid bağlayıcı azaltmak için (Sigmacote) silikonlu olmalıdır. Organik çözücü ile özünün çıkarılması kimyasal bir kaput yapılmalıdır.

1. , 50 ml polipropilen konik tüpe tartılır. 6.5 ml işareti yakın sıcak bir jilet ile tüp aracılığıyla keserek -80 ° C'de saklanan 15 ml konik tüp dondurulmuş solucanlar yaklaşık 6.0 g aktarın. Bir metanol-temizlenmiş spatula tüpün altındaki dondurulmuş pelet solucanı kaldırmak için kullanılabilir. Pelet üst alt kısmının, daha az yoğun larva solucanlar ve kalan bakteriler almak için pelet keserek geride bırakılır.
2. Önceden tartılmış 50 ml konik tüp, donmuş solucanlar aktarın. Birden fazla numune işleme edilmektedir, karşılaştırmalı çalışmalar için doku aynı miktarda (6.0 g) kullanın. Bir hamur içine solucanlar çözülme gibi, istenen kitle elde etmek için spatula ile solucanlar eklemek veya kaldırmak. İsteğe bağlı: Reklamekstraksiyon verimlilik için bir iç kontrol olarak PGF _2α-d4 standart d 1.00 ng.
3. Solucan süspansiyon 0.005% BHT ile buz gibi soğuk 02:01 aseton / serum fizyolojik 12 ml ekleyin ve karıştırın iyice karıştırın. Mermi blender içinde kullanım için oniki 5 mi kendine ayakta plastik tüplerin her solucan bulamacın 1.5 ml dağıtın.
4. 0.5 mm 0,7-0,8 ml çapında Ceria her 5 ml tüp zirkonyum oksit boncuk stabilize. Sıkıca kapakları kapatın ve Bullet Blender 5 homojenizatör içine 12 tüpler yükleyin. Hızlı 8-9 az 3 dakika için blender çalıştırın ve Tüpler buz üzerine yerleştirin. Çok sıkı kapakları kapatmak için ya da içeriği dökülebilir emin olun. Bir Stereoskop kullanarak bir slayt üzerinde bir tüpten homojenatında 10 ul kontrol edin. Kalan çok az sağlam solucan olmalıdır. Gerekirse, bir dakika için aynı hızda tekrarlayın.
5. Eşit bir 9 "Pasteur pipeti kullanarak dört adet 10 ml konik cam tüpler için homojenatlarında aktarmak. Transfer boncuk kaçının. Üç tüp seque gelen boncuk yıkayınntially 01:02 aseton / tuzlu su içeren BHT 1 ml. Tüm boncuk yıkanır kadar diğer tüpler için tekrarlayın. 10 ml cam tüplere kalan çözelti (~ 4 mL) aktarın ve buz üzerine yerleştirin.
6. 4, 10 ml cam tüpler Santrifüj ° C de 10 dakika boyunca ~ 1000 xg'de bir klinik santrifüj. Her bir tüp, temiz bir 10 ml'lik bir cam konik tüp süpernatant aktarın.
7. Kimyasal bir başlık olarak, her bir 10 ml bir cam tüpe heksan eşit hacimde ekleyin. Örneğin, 3.5 ml aseton / tuzlu su çözeltisi için 3.5 mL heksan ilave edin. 30 saniye için maksimum hızda Vortex.
8. 4, 10 ml cam tüpler Santrifüj ° C de 10 dakika boyunca ~ 1000 xg'de bir klinik santrifüj. Hekzan içeren üst faz ve nötr ücret lipidler atın.
9. 2 M formik asit (- 150 ul, yaklaşık 100) kullanılarak pH 3.5 'e asitlendirilir alt faz. PH şeritleri kullanarak test pH.
10. Her tüpe kloroform eşit hacimde ekleyin. 30 saniye için maksimum hızda Vortex ve 4 tüpler santrifüj ° C i10 dakika boyunca ~ 1000 xg'de na klinik santrifüj.
11. Çıkarın ve üst sulu faz atın. Interfaz kaçınarak, alt kloroform fazına kalan sütlü interfaz ile bir pipet takın. Temiz bir 15 ml konik cam tüpe 4 tüplerin her biri ikinci alt aşama toplayın. En az 24 saat boyunca -20 ° C'de inkübe edin. Bu noktada, özü iki haftaya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
12. Dondurucu özü çıkarın ve varsa, kalan sütlü sulu üst tabaka atın. Yeni bir Pasteur pipet kullanarak Teflon kaplı etiketli ½-Dram cam şişe için kloroform faz aktarın. Kimyasal bir kaput, _N2 gazı hafif bir akımı altında kuruyana kadar kloroform çözünebilir fraksiyon buharlaşır. Kuru ekstresi, 2 haftaya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir. PG çıkarma ve analiz için kullanılan genel bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir.

3. Prostaglandin Analizi

1. Stok hazırlayınçalışan bir çözelti elde etmek için su (8:2 h / h): bu _2α PGF ya da PGF ₂ metanol içinde _α-D4 (1 ug / ml) olarak ve metanol ile seyreltilir özel referans prostaglandinlerin çözümler. Bir standart eğri oluşturmak için bir seri seyreltilmesi (100, 10, 1, 0.1, 0.01 ng / ml) hazırlayın.
2. Kurutuldu C. su (8:2 h / h): 200 ul metanol ekleme elegans lipid özü (ler) ve iyice karıştırın. Su solüsyonu: sonsuz doku az 6 g ekstre edildi durumunda, kuru ekstresi metanol daha az bir hacimde yeniden asıldı edilmelidir.
3. Su içinde% 0.1 formik asit içeren, mobil faz hazırlanır [A] ve% 0.1 formik asit ihtiva eden asetonitril [A].
4. 4 ° C de otomatik örnekleyici kurmak ve bir 70-sayısı 1.5 ml şişe rafa örnek şişeleri yerleştirin.
5. Yaklaşık 5 dakika boyunca, 0.2 ml / dk 'lık bir akış oranında% 0.1 formik asit ile Sinerji hidro RP-C18 kolon dengelenmesi.
6. Sütuna örnek (20-50 ul) enjekte edilir. Gradyan elüsyon başlangıç ​​yapmaking% 10 B ve 0-11 dakika, 11-14 dk% 80-100 B, 80% B kadar gidiyor ve 16 dk% 10 B geri dönen. Toplam çalışma süresi 20 dk. 13 özgün standartları tutma süreleri referansı ³ için Tablo 1 'de gösterilmektedir.
7. Negatif iyon modunda ise, bir ESI arabirim işletim kullanarak, kütle spektrometresi içine atık sütun tanıtılması. Azot nebulizer ve perde gazı (KKO = 10) olarak kullanılır. Çarpışma gaz, çarpışma enerji ve sıcaklık sırasıyla 10, -35 eV ve 600 ° C de ayarlanır. Declustering potansiyeli (DP), çarpışma enerjisi (CE), ve hücre çıkış potansiyeli (CXP) sırasıyla -90, -35 ve -10 ayarlanır.
8. Anket taramaları (Q1 taramaları) için, en PG (Şekil 2) için m / z 315-360 kütlesi aralığında negatif iyon modunu kullanın. Aralık ilgi bileşik (ler) kütlesine bağlı olarak değiştirilebilir. LC-MS iyon kromatogramların toplam iyon akımı (TIC) den iyonları ve belirleyen extrac olsunted iyonları ya da deprotone yaklaşımlı iyonları uygun ya da fragmanı iyonları.
9. MRM deneyler için, geçiş kütle m / z 355/311 F1 sınıfı tespit etmek için kullanılan, m / z 353/193, F2 sınıf için kullanılır ve m / z 351/193 ya da 351/191 F3 sınıfı için kullanılan (Şekil 3). MRM ayrıca, iç standart (örneğin, m / z 357/197 PGF _2α-D4) tespit etmek için ve standart eğri oluşturmak için kullanılmıştır. PG kitle geçişler ¹⁸ hakkında daha fazla bilgi için Murphy ve ark. Bakın.
10. MS / MS deneyler için, F1 sınıfı, m / z 353for F2 sınıfı, ve m / z 351for F3 sınıfı PG için m / z 355 kullanın. C. F-serisi PG için elegans, MS / MS verileri, Şekil 4 ve Tablo 2, ^3,16 mevcuttur. Memeli eikozanoidler için MS / MS veri mevcuttur www.lipidmaps.org .
11. Analys kullanarak analitik veri işlemet yazılım (Sürüm 1.4.2, Applied Biosystems).

Sonuçlar

Numune hazırlama Golovko Murphy ¹⁷ uyarlanmış sıvı-sıvı ekstraksiyon gerçekleştirilmiştir. Bu, dahili bir standart (PGF _2α-d4) arasında mükemmel bir iyileşme sağlanmaktadır. C. PG çıkarılması için genel şeması elegans, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Kromatografik koşullar> 30 eicosanoid standartları (Tablo 1 13 standartları gösterir) bir temel ayrımı sağlamak için optimize edilmiştir. % 0.1 formik asit ihtiva eden su ve asetonitril ile bir hidro-RP kolon (250 x 2.0 mm İD), en iyi ayırma ve hassasiyeti sağlanır. Yabani tip ve yağ-3 mutant özler diğer taramalar 315-360 atomik kütle birimi kütle aralığı içindeki iyonların Şekil 2, belge küresel düzeyde gösterilmiştir. Yağ-3 (wa22) mutantlar çok 20 karbon PUFA yoksundur. Bir F3 sınıf PG vurgulanır. Şekil 3'te, bir vahşi-tip özü MRM analiz F1 birden fazla PG izomerleri (Şekil 3A göster ng>), F2 (Şekil 3B) ve F3 (Şekil 3C ve 3D) sınıfları. F3 sınıfı iki kitle geçişler biri ile tespit edilebilir, m / z 351/193 veya m / z 351/191. CePGF2 ağırlıklı PGF _2α enantiomerin oluşur. CePGF1 PGF _1α veya enantiyomeri olması muhtemeldir. Şekil 4 CePGF2 en çarpışma kaynaklı ayrışma (RT = 11.8) PGF2 _α standardına göre (RT = 11.8) gösterir. Ürün iyonları küçük farklar büyük olasılıkla özü düşük CePGF2 bolluğu ve ortak salınımlı bileşikleri ile kaynaklanmaktadır.

Şekil 1. C. şematik diyagramı elegans PG çıkarma ve LC-MS analizleri. Her iki yağ oksidasyonunu en aza indirgemek için% 0.005 'lik BHT sahip aseton / tuzlu su ve kloroform unutmayın. Daha fazla bilgi için metne bakın.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg "target =" _blank "> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2. Yabani tip ve yağ-3 (wa22) mutant özler m / z 315-360. Sıvı kromatografi tutma süresi (RT) arasında diğer taramalar paneli [A] 'de gösterilmektedir. Oda sıcaklığında Çıkarılan iyonları = 11.3 yabani tip [B] ve yağ-3 (wa22) [C] özleri için gösterilmiştir. Kütle m / z 351 ile F3 sınıf PG vurgulanır. Cps, sayım / sn; amu, atomik kütle birimi.

Incirure 3. Vahşi tip özler MRM analizleri. F1 sınıfı PG kütle geçiş m / z 355/311 [A] ile tespit edilir. PG olması olası birkaç hidrofobik bileşikler (RT> 14 dk), bu geçiş ile tespit dikkat edin. F2 sınıfı PG kitle geçiş ile tespit edilir m / z 353/193 [B]. F3 sınıf PG ya kitle geçiş ile tespit edilir m / z 351/193 [C] veya m / z 351/191 [D]. Özler her sınıfın birden çok PG izomerleri içeren dikkat edin. Sayılar Tablo 2'de gösterilmiştir PG karşılık gelmektedir. CePGF2 konsantrasyonu 1.8 ng / ml 'dir. RT, tutma süresi; cps, sayım / saniye.

Şekil 4. Kimyasal synth çarpışma kaynaklı ayrışmaPGF _2α ve CePGF2 esized. panelindeki Oklar [A] PGF _2α ve CePGF2 (RT = 11.8) arasında paylaşılan ürün veya parçalanma iyonları gösterir. M / z 309 ve m / z 193'de ürün iyonları gösterilen yapılara karşılık belirtilen yarılma bölgeleri (a ve b gösterilmiştir) tarafından üretilen, ve F-serisi PG karakteristik [A]. Edilir Cps, sayım / sn. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Standart	RT (dk)	[MH] - m / z	MS / MS anahtar ürün iyonları
20-hidroksi PGE2	9.43	367	349, 331, 287, 234, 189, 129, 109
PGF 3 -	11.26	351	333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111
B 2 tromboksan	11.66	369	289, 191, 177, 169, 151
PGF 2 -	11.80	353	335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111
PGF 1 -	11.79	355	337, 319.311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195
Lipoksin B 4	12.38	351	201, 191.189, 165, 155, 115, 107, 71, 59.
PGT 2	12.56	351	315, 271203, 189
5 (S), 6 (R) - A 4 Lipoksin	12.83	351	235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59.
PGA 2	14.02	333	315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109
Δ12-PGJ 2	14.20	333	271, 189, 123
Lökotrien B 4	14.73	335	181, 109, 93, 71, 69, 59, 57
15d-Δ 12,14-PGJ 2	16.80	315	297, 271, 217, 203, 158
5 (S)-HpETE	17.88	335	97, 83, 81, 57.

Tablo 1. Saklama süreleri ve LC-MS/MS yöntemi ³ 13 eicosanoid standartlarının önemli ürün iyonları. 30 standartları LC-MS/MS programı geliştirmek için kullanılmıştır. Kromatografik tutma kez (RTS) bile çok benzer PG arasında, farklılık. Bir istisna PGF _1α ve PGF _2α olduğunu. Bununla birlikte, bu PG d vardır(- m / z [MH]) ve çarpışma kaynaklı ayrışma spektrumları (MS / MS), üst iyon kitleler tarafından istinguished.

Prostaglandin sınıf	Şekil 3, No	[MH] - m / z	MS / MS anahtar ürün iyonları
F1 (CePGF1)	1	355	319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157
F1	2	355	311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157
F2 (CePGF2)	3	353	309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127
F2	4	353	309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113
F3	5	351	315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139
F3	6	351	333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163

Tablo 2'de. Birçok önemli C. için Çarpışma kaynaklı ayrışma ürünü iyonları elegans F1, F2, F3 ve PG, Şekil 3'te gösterilmiştir. Diğer daha az oranda izomerler MS / MS gösterilmemiştir. Bu veriler birden analizler ve tüm ürün iyonları belirli bir vadede görülebilir. Özleri karmaşıklığı göz önüne alındığında, biraz daha az bol ürün iyonları müdahalesinden benzer tutma süresi ya da sonuç ile başka bir ana iyon köken alabilir. Pik 2 olasılıkla CePGF1 bir stereoizomer ve pik 4 olasılıkla CePGF2 bir stereoizomer. Ek veri ³ Edmonds, ve ark. (2010) bakın.

Tartışmalar

Biz F-serisi PG odaklanarak, eicosanoid çıkarma ve analiz için bir prosedür açıklanmaktadır. Sorunlu olabilir prosedürün çeşitli yerlerinde bulunmaktadır. Birincisi, açlık PG metabolizmasını değiştirebilir gibi solucan kültür, açlıktan yok önemlidir. NA22 yüksek yoğunluklu ulaştığı için, tamamlayıcı besleme için, NA22 bakteri yerine daha yaygın olarak kullanılan OP50 bakteri tavsiye edilir. Ancak, NA22 gerginlik antibiyotik direnci yoksun ve kirlenmeye daha hassastır. İkinci olarak, solucanlar memeli dokularında göre düşük bolca bireysel PG izomerleri sentez. Bunun nedeni, kısmen çok sayıda izomerler arasında fazlalık bağlı olabilir. Biz kapsamlı bir analiz ve güçlü sinyaller için doku yaklaşık 6 gr tavsiye ederiz. Kuru ekstresi az metanol içinde süspansiyon haline getirildi, daha az doku (1-2 g) kullanılabilir: su çözeltisi PG konsantrasyonunu artırmak için. Bununla birlikte, sadece 1-2 enjeksiyon yapılabilir. Bizim LC-MS/MS sisteminin saptama limiti 10 pg hakkındaPGF _2α / ml arasındadır. Yoğun dolu karışık aşamada solucanlar biri ml (yaklaşık 1 gr) CePGF2 yaklaşık 25-50 pg verir. Daha hassas kütle spektrometresi sistem analizi için gerekli solucan doku miktarını azaltabilirsiniz. Üçüncü olarak, örnekleri arasında PG ekstraksiyon verimi farklılıklar değişken sonuçlara neden olabilir. Bu ekstraksiyon verimi dokularda paralel ekstre zaman çok benzer olduğunu bulduk. Etkinliğini belirlemek için, bir iç kontrol olarak, homojenleştirme adımı da PGF _{2α-D 4,} 1.0 ng ekleyin. MRM m / z 357/197, 1 ng / ml standart çözeltiye göre PGF _2α-d4 konsantrasyonunu ölçmek için kullanılan kütle geçişi kullanılarak. Çıkarma sırasında kaybolan PGF _{2α-d 4} miktarı daha sonra hesaplanır.

Biz dahil kromatografi parametreleri ve kitle geçişler diğer PG ve eikozanoidler tespit etmek için değiştirilebilir. Önemli çaba rağmen, D-serisi veya e-ser tespit etmek mümkün olmamıştırler ekstreler ¹⁷ syf. Ayrıca, 8-iso PGF _2α ve PG stereoizomerler ¹⁹ seçici olmayan bir karışım oluşturur serbest radikal tarafından başlatılan peroksidasyonu, karakteristik 8-iso PGE ₂ tespit değil. Solucanlar diğer PG tür sentez olmadığı bilinmemektedir. Endokannabinoidlerin ve araşidonik ve eikosapentaenoik asit çeşitli epoksi ve hidroksi metabolitleri C bulunmuştur elegans ^5,7,20,21 ayıklar. Biz sırasıyla, ölçme ve tanımlama için otantik standartlarına göre MRM ve MS / MS hem de kullanmanızı tavsiye ederiz. Yeni eikosanoidlerin için, bu analizler, mümkünse, enzimler ^22, hem de bir işlevsel analiz sentez PUFA eksik olan yağ mutantlar, karşılaştırmalı bir çalışma ile kombine edilmelidir. Yağ mutantlar analiz için bir uyarı solucanlar bulunan PUFA bir dakika miktarda PG sentezi için yeterli olmasıdır. Örneğin, yağ-2 (wa17) mutantlarD12 desatüraz aktivitesinin küçük bir miktarda (~ 5 vahşi tip ^22%), ve bu mutantların hala PG ⁶ üretir. yağ-3 (wa22) ve yağ-4 (WA14) mutantlar arakidonik asit, eikosapentaenoik ¹⁶ türetilmiş PG sentezi için başarısız olması . Ayrıca yağ mutantlar kalan sınıflardan düzenleyen PG sentezini PUFA'nın sınıfların kaybını telafi bulduk. Örneğin, yağ-3 (wa22) mutantlar 20-karbon ÇDYA elde edilen en PG sentez için başarısız. Bunun yerine, 18-karbon PUFA ¹⁶ türetilmiş yeni PG up-regüle görünmektedir. Bugüne kadar, bir C belirlenememiştir PG sentezini tamamen eksik olan elegans suşu. Bu PG büyüme ve gelişme için gerekli olan mümkündür.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
X-large (16 cm) plates	Fisher Scientific	0875714
E. coli strain NA22	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	NA22	http://www.cgc.cbs.umn.edu
Acetone, 399.5%	Fisher Scientific	A928-4
Butylated Hydroxytoluene	MP Biomedicals	101162
Hexane, HPLC grade	Fisher Scientific	H302-1
Formic acid, 399%	Acros	AC27048-0010	Available through Fisher Scientific
Chloroform, HPLC grade	Acros	AC26832-0010	Available through Fisher Scientific
PGF2α-d4	Cayman Chemicals	316010	Cayman has a wide array of standards available for purchase
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube	Fisher Scientific	14-222-651	For use with Bullet Blender
0.5 mm zirconium oxide beads	Next >>> Advance	ZrOB05
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes	Kimble Kimax	45200-10	Available through Fisher Scientific
15 ml glass conical tubes	Corning Pyrex	8082-15	Available through Fisher Scientific
Sigmacote (Siliconizing reagent)	Sigma-Aldrich	SL2-100ML
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial	Fisher Scientific	V1235C-TFE
			EQUIPMENT
CentraSL2 Clinical Centrifuge	Thomas Scientific	2517N92-TS
Bullet Blender 5 blue homogenizer	Next >>> Advance	BBY5MB	A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm	Phenomenenex	00G-4375-B0	HPLC Column
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm	Phenomenenex	AJ0-7510
SecurityGuard Guard Cartridges Kit	Phenomenenex	KJ0-4282
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler	Shimadzu Scientific Instruments, Inc.		Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer	Applied Biosystems/MDS SCIEX
			M9 buffer recipe (4 liter) 12 g KH2PO4 24 g Na2HPO4 20 g NaCl Up to 4 liter Deionized water Aliquot to eight 1 liter bottles. Autoclave and cool. 0.5 ml/bottle 1 M MgSO4