Добыча простагландинов и анализа в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Резюме

В этой статье мы описываем оптимизированные процедуры для извлечения и анализа простагландинов и других эйкозаноидов из C. Элеганс Использование LC-MS/MS.

Аннотация

Caenorhabditis Элеганс становится мощной модели животных для изучения биологии липидов ^1-9. Простагландины представляют собой важный класс эйкозаноидов, которые липидов сигналов, полученных от полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), ^10-14. Эти сигнальные молекулы трудно изучать из-за их низкой численности и реактивной природы. Характерной особенностью является простагландинов циклопентановым кольцевой структуры расположены в жирные кислоты позвоночник. У млекопитающих, простагландины могут быть сформированы посредством фермента циклооксигеназы-зависимый и-независимых путей ^10,15. С. Элеганс синтезирует широкий спектр независимых простагландинов циклооксигеназы ^6,16,17. Большой класс F-серии простагландинов была определена, но изучение эйкозаноиды находится на ранней стадии с достаточно места для новых открытий. Здесь мы описываем процедуру для извлечения и анализа простагландинов и других эйкозаноидов. Заряженного липидас извлекаются из массы культур червь использовании жидкостно-жидкостной экстракции техники и анализируют жидкостной хроматографией, соединенный с ионизацией электрораспылением тандемной масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS). Включение в дейтерированном аналоги простагландинов, такие как PGF _{2 α-д 4} в качестве внутреннего стандарта рекомендуется для количественного анализа. Несколько мониторинга реакции или MRM может использоваться для количественного определения и сравнение определенного типа простагландина между дикого типа и мутантных животных. Столкновение индуцированного разложения или MS / MS может быть использована для получения информации о важных структурных особенностей. Жидкий хроматографии масс-спектрометрии (ЖХ-МС) обзор сканирования выбранного диапазона массы, например, м / з 315-360 могут быть использованы для оценки глобального изменения уровни простагландина. Мы приводим примеры всех трех анализов. Эти методы будут предоставить исследователям набор инструментов для обнаружения новых эйкозаноидов и разграничения их метаболических путей.

Введение

Простагландинов (ПГ) являются важным классом липидов гормоны, которые были тщательно исследованы и участвует в регуляции размножения, иммунитет, и развитие в широком спектре организмов ^12-14. PGs идеально подходят для всестороннего анализа системной биологии, потому что они представляют собой ряд липиды, полученные из общего предшественника (ы). Нематоды C. Элеганс является одним из наиболее широко используемых модельных организмов для решения основных вопросов в области генетики и системной биологии.

Мы показали, что С. Элеганс синтезирует F-серии ПГ, что руководство подвижных сперматозоидов в ооциты ^3,6,16. F-серии ПГ, полученные из 20-углерод ПНЖК с три, четыре, пять и двойными связями, содержащего F1, F2 и F3 классов, соответственно были идентифицированы ^3,16. Эти ПГ синтезируются независимо от ферментов циклооксигеназы, но PGF _1α и PGF _2α стереоизомеров еще GEnerated. Для качественного и количественного анализа С. Элеганс ПГ, LC-MS/MS является мощной и чувствительной аналитической техники. Перед выполнением этого анализа, важно разработать оптимизированный метод добычи поскольку производительность аналитического процесса во многом зависит от качества экстракта. Жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии может обеспечить только ожидаемый массы к заряду (м / з), а также желаемой формы пика и время удерживания PG ион родителя. Метаболический профилирование PGS На C. Элеганс является сложной задачей, требующей приобретения MS различных стратегий.

ЖХ-МС полное сканирование сканирования или обследования (Q1 сканирования), имеет преимущество, что наиболее ионизируемая ПГ будет генерировать масс-спектрометрического ответа. В то время как исследование сканирования предоставляет полезную информацию об общем объеме профилирование ПГ по отношению к дикого типа и мутантных C. Элеганс, обнаружение незначительных PGs находится под угрозой из-за низкой чувствительности. Тем неменьше, LC-MS обследования сканирование может дать общее представление о ПГ и особенно полезна для анализа мутантов прогнозам, влияют на обмен веществ большой популяции PG.

В метаболита идентификация, анализ LC-MS/MS химически синтезированных стандартам PG сначала выполняется, чтобы получить их продукт ионных спектров в качестве эталонных соединений. Эти спектры можно сравнить спектр неизвестного метаболита. Несколько реакции мониторинга (MRM) режим используется для повышения чувствительности и специфичности. Эксперимент MRM осуществляется путем указания родительского иона / продукта иона массовый переход соединения. Зная массу и структуру целевых аналитов, можно предсказать теоретическим переходы MRM для многих неизвестных метаболитов.

Оптимизированный метод LC-MS/MS для профилирования изомерных PGS На C. Элеганс не сообщалось. Здесь мы опишем добычи и комплексного подхода масс-спектрометрии, состоящий из LC-MS и LC-MS / MS методов выявления, количественной, и расследование C. Элеганс PG метаболитов. Этот подход может быть применен к другим эйкозаноидов.

протокол

Протоколу, как описано ниже разделена на три части: червь культуры, простагландин экстракции и простагландин анализа. Как отмечалось выше, существует несколько пунктов, когда образцы могут быть временно хранят при -80 ° С или -20 ° С.

1. Worm культуры

Мы рекомендуем приблизительно, 6 г смешанного черви почву для всеобъемлющего LC-MS/MS. Это должно обеспечить достаточно материала для обнаружения по крайней мере шесть отдельных инъекций. Для количественного определения известный ПГ по MRM в одной инъекции или два, 1-2 г являются достаточными. Анализ экстрактов из синхронизированной культуры, состоящий из определенной стадии также возможно. До 4 различных штаммы могут быть выращены одновременно. Так, например, дикого типа контроль и три различных мутантных штаммов.

1. Подготовьте 65 X-Large (16 см) NGM пластин и концентрированных бактерий для дополнительного питания. Используйте na22 бактерий для посева. Чтобы концентрированной бактерий для прикорма, GROW по крайней мере, четыре литра na22 в LB среде в течение 16-24 часов. Спином вниз, удалить супернатант, и ресуспендируют бактерий в 100 мл буфера M9. От 200 до 400 мл этого концентрированного бактериальный раствор может быть необходима для каждого червь штамма. Хранить при температуре 4 ° C.
2. Начать червь культур на 5 X-большие тарелки. Расти червей в течение примерно от 3 до 4 поколений, пока пластины не полны беременной взрослых. Концентрированные бактерий должно быть добавлено к пластинам, чтобы предотвратить голод, по мере необходимости (~ 1 мл / плиты и дайте высохнуть полностью перед заменой крышки).
3. Вымойте беременной гермафродиты от пластин с буфером M9 и собирать червей в 50 мл коническую трубку полипропилена.
4. Разрешить беременной гермафродиты оседают на дно (как правило, около 3-5 мин). Удалить супернатант, в том числе бактерий, яиц и личинок червей этапе. Ресуспендируйте в 15 мл буфера M9 и осторожно перемешать.
5. Передача 200 мкл червь суспензии в каждую из 60 посеянных NGM пластин. Дисперсные червей через пластины. Держите червь решения смешаннойхорошо, пока все пластины не были посеяны, чтобы убедиться, что они получают примерно равное число червей.
6. Дополнение концентрированной бактерий по мере необходимости (~ 1 ml/plate/12 в период с 24 часами), чтобы предотвратить голод. Разрешить пластин высохнуть на воздухе перед заменой крышки. Расти червей в течение 2-4 поколений, в зависимости от первоначального количества червей семенами, или пока пластины не полны беременной взрослых.
7. Урожай червь пластины один штамм одновременно. Вымойте червей с плит с буфером M9 и собирают в 50 мл полипропиленовые трубы (например, 6 трубок). Используйте M9 буфера мыть тарелки, а затем перенести червя заполненные буфера в следующую пластину. После мытья номер (например,. ^{10-е место)} пластин, передавать червя заполненные буфера в 50 мл трубки. Заполните трубку к вершине с буфером M9. Повторите стирки для остальной части пластин.
8. Как беременной взрослых оседают на дно в 5-6 минут, удалить супернатант (~ 35 мл) и объединить их в одну или две трубы. Заполните труб до 50 мл FRЭш M9 буфера, дать настояться в течение 3-5 мин, и удалить надосадочную жидкость, оставив беременную взрослых. Повторить 3 раза или до тех пор супернатанта не станет прозрачной.
9. Использование большого диаметра пипетки Пастера передачи столько червей, как можно две 15 мл полипропиленовые конические пробирки. Спин вниз при 1000 RCF (~ 3500 оборотов в минуту в CentraSL2) в течение 5 мин в клинической центрифуге. Удалить супернатант и повторять, пока все черви не передаются и осаждали в одной пробирке. Удалить столько супернатант насколько возможно, и магазин червей при -80 ° С. Повторите для всех штаммов.

2. Добыча простагландин

Реагенты, необходимые для извлечения показаны ниже. Способ изменение от такового Golovko Мерфи и ¹⁷ и включает в себя ацетон экстракции с последующей жидкость-жидкость очистки, что повышает чувствительность LC-MS/MS. Пули Blender 5 гомогенизатор используется в порядке, хотя аналогичные результаты могут быть получены с помощью гомогенизатора Даунса. Бутилированного hydroxytolueпе (ВНТ) и испарением в атмосфере азота (N ₂₎ газ используют для предотвращения окисления. Всю стеклянную посуду следует силиконизированным (Sigmacote) для снижения липидов обязательными. Экстракция органических растворителей должны быть выполнены в химической капотом.

1. Взвесить 50 мл полипропиленовые коническую трубку. Передача примерно 6,0 г замороженной червей из 15 мл коническую пробирку хранили при -80 ° С, проходящем через трубки с горячим лезвием около 6,5 мл отметки. Очищена смесью метанол-шпатель может быть использован для удаления замороженного червь гранул из нижней части трубки. По проходящем через гранул для получения нижней части, менее плотной личинок червей и остаточных бактерий из верхней части гранул остаются позади.
2. Передача замороженные червей в предварительно взвешенный 50 мл коническую трубку. Если несколько образцы обрабатываются, используйте ту же сумму (6,0 г) ткани для сравнительных исследований. Как червей оттепели в пасту, добавить или удалить червей шпателем, чтобы получить желаемый массы. Дополнительно: объявлениеD 1,00 нг PGF _2α-d4 стандартных качестве внутреннего контроля для добычи эффективности.
3. Добавить 12 мл ледяной смеси 2:1 ацетон / физиологическом растворе, содержащем 0,005% BHT червю подвески и хорошо перемешать путем встряхивания. Распределить 1,5 мл червь суспензии к каждому из двенадцати 5 мл самостоятельного пластиковые трубы для использования в пуле Blender.
4. Добавить 0,7-0,8 мл диаметром 0,5 мм стабилизированный оксид церия шариков оксида циркони друг 5 мл трубки. Закрыть плотно крышкой и загрузить 12 пробирок в Blender Пуля 5 гомогенизатор. Запустите Blender течение 3 минут при скорости 8-9 и поместить пробирки на льду. Обязательно закройте крышкой очень плотно или содержимого может разлиться. Проверка 10 мкл гомогената от одной трубки на слайде использованием стереоскопе. Там должно быть очень мало нетронутыми червями осталось. Повторите с той же скоростью в течение другой минуты, если это необходимо.
5. Равномерно передать гомогенаты до четырех 10 мл конические пробирки стекла с использованием 9 "пипетки Пастера. Избежать переноса бисером. Вымойте бисером из трех труб sequentially 1 мл 1:2 ацетон / солевой раствор, содержащий ВНТ. Повторите для другой трубы, пока все шарики не будут прибиты. Передача оставшегося раствора (~ 4 мл) в 10 мл пробирок стекла и поместить их на льду.
6. Центрифуга 10 мл пробирок стекла при 4 ° С в клинической центрифуге при ~ 1000 х г в течение 10 мин. Передача супернатант из каждой пробирки на 10 мл чистого стекла коническую трубку.
7. В химической капот, добавляют равный объем гексана к 10 мл стеклянной трубки. Например, можно добавить 3,5 мл гексана, 3,5 мл ацетона / физиологический раствор. Вихревые при максимальной скорости в течение 30 секунд.
8. Центрифуга 10 мл пробирок стекла при 4 ° С в клинической центрифуге при ~ 1000 х г в течение 10 мин. Откажитесь от верхней фазы, содержащей гексана и нейтрально заряженные липиды.
9. Подкисляют нижней фазы до рН 3,5 с использованием 2 М муравьиной кислоты (примерно 100 - 150 мкл). Испытание рН с использованием рН-полоски.
10. Добавить равный объем хлороформа в каждую пробирку. Вихревые при максимальной скорости в течение 30 секунд и центрифуги трубы при 4 ° С яН.А. клинической центрифуге при ~ 1000 мкг в течение 10 мин.
11. Снимите и выбросьте верхнюю водную фазу. Вставьте пипетки вследствие наличия остатков молочно межфазных к нижней фазы хлороформа, избегая интерфазы. Сбор нижней фазы от каждого из 4 труб на чистую 15 мл коническую трубку стекла. Инкубируют при -20 ° C в течение 24 часов. В этот момент, экстракт можно хранить при -20 ° С в течение двух недель.
12. Возьмите выписку из морозильника и игнорировать оставшиеся молочно водных верхний слой, если он присутствует. Передача фазы хлороформа с меченым покрытая тефлоном ½-DRAM стеклянный флакон с использованием новой пипетки Пастера. В химической капот, испаряется хлороформа растворимой фракции досуха при нежный поток N ₂ газа. Высушенный экстракт можно хранить при -20 ° С в течение 2 недель. Общая схема используется для PG экстракции и анализа показан на рисунке 1.

3. Анализ простагландин

1. Подготовка акциирешения отдельных простагландинов ссылку, например, PGF _2α или PGF _{2 α-d4} (1 мкг / мл) в метаноле и разбавленной смесью метанол: вода (в соотношении 8:2 объем / объем), чтобы получить рабочий раствор. Приготовьте серию разбавлений (100, 10, 1, 0,1, 0,01 нг / мл) для получения стандартной кривой.
2. Добавить 200 мкл смеси метанол: вода (в соотношении 8:2 объем / объем) в высушенном С. Элеганс липидного экстракта (ы) и тщательно перемешать. Если менее 6 г червь ткани экстрагировали, высушенного экстракта должны быть повторно суспендируют в меньший объем метанол: водный раствор.
3. Подготовьте подвижной фазой, состоящей из 0,1% муравьиной кислоты в воде [A] и ацетонитрила, содержащего 0,1% муравьиной кислоты [B].
4. Настройка автоматического пробоотборника при 4 ° С и поместите образца флаконов в 70-количество 1,5 мл флаконе стойку.
5. Равновесие на пике гидро RP-C18 колонке с 0,1% муравьиной кислоты, при скорости потока 0,2 мл / мин в течение 5 мин.
6. Введите образца (20-50 мкл) в колонку. Выполнение СМР, ПНР градиент элюированияIng с 10% B и, подойдя к 80% В от 0-11 мин, 80-100% B 11-14 мин, и вернуться обратно в 10% В при 16 мин. Общее время работы составляет 20 минут. Время удерживания 13 подлинный стандарты приведены в таблице 1 в качестве примера ^3.
7. Введем колонки поток в масс-спектрометр с использованием рабочей ESI интерфейс в режиме отрицательной иона. Азот используется в качестве распылителя и занавес газа (CUR = 10). Столкновение газ, энергию удара, и температура устанавливается на 10, -35 эВ и 600 ° С соответственно. Декластеризация потенциал (ДП), энергия столкновения (CE), и клеточные выходе потенциал (СХР) устанавливаются при -90, -35 и -10 соответственно.
8. Для осмотра сканирования (Q1 сканирований), используйте отрицательные режиме иона в области масс м / з 315-360 для большинства ПГ (рис. 2). Диапазон может быть изменен в зависимости от массы соединения (соединений), представляющих интерес. Извлечение ионов из общего ионного тока (TIC) из LC-MS ионных хроматограмм и определить, является ли экстракцииТед ионов соответствуют депротонированную или аддукт ионов или ионов-фрагментов.
9. Для записи экспериментов, массовый переход м / з 355/311 используется для обнаружения F1 класс, м / е 353/193 используется для F2 класса и м / з 351/193 или 351/191 используется для F3 класс (рис. 3). MRM также использоваться для обнаружения внутреннего стандарта (например, м / е 357/197 для PGF _2α-d4) и генерировать стандартной кривой. См. Мерфи и др.. Для получения дополнительной информации на стр. масса переходов ^18.
10. Для MS / MS экспериментов, использование м / з 355 для F1 класс, м / е 353for F2 класса и м / з 351for F3 класс ПГ. С. Элеганс МС / МС данные для F-серии ПГ доступен на рисунке 4 и в таблице 2 ^3,16. МС / МС данные для млекопитающих эйкозаноидов доступна на www.lipidmaps.org .
11. Процесс аналитических данных с использованием AnalysT (версия 1.4.2, Applied Biosystems).

Результаты

Подготовка образцов проводили жидкостно-жидкостной экстракции адаптировано из Golovko и Мерфи ^17. Это обеспечило отличную восстановление внутреннего стандарта (PGF _2α-d4). Общая схема PG извлечение из C. Элеганс показано на рисунке 1. Хроматографические условия были оптимизированы для обеспечения базового разделения> 30 стандартов эйкозаноидов (Таблица 1 показывает 13 стандартов). Гидро-Rp колонка (250 х 2,0 мм внутренний диаметр) с водой и ацетонитрилом, содержащим 0,1% муравьиной кислоты, при условии лучшего разделения и чувствительности. Обзор сканирования дикого типа и жира-3 мутант экстракты показано на рисунке 2 документ глобального уровней ионов в диапазоне масс от 315-360 атомных единиц массы. Жира-3 (WA22) мутанты лишены наиболее 20-углерод ПНЖК. PG F3 класс будет выделен. На рисунке 3 MRM анализы дикого типа экстракта показать несколько изомеров ПГ F1 (рис. 3А нг>), F2 (рис. 3В) и F3 (рис. 3C и 3D) классов. F3 класса могут быть выявлены с любой из двух переходов массы, м / Z 351/193 или м / Z 351/191. CePGF2, в основном, состоит из энантиомера PGF _2α. CePGF1, вероятно, будет PGF _1α или его энантиомер. 4 показаны индуцированных столкновениями разложение CePGF2 (RT = 11,8) по сравнению с _α PGF2 стандарт (RT = 11,8). Незначительные различия в продукте ионов, вероятно, из-за низкой CePGF2 изобилия и сотрудничества элюирующие соединений в экстракте.

Рисунок 1. Принципиальная схема C. Элеганс PGs добычи и ЖХ-МС анализа. Обратите внимание, что ацетон / солевые и хлороформ оба имеют 0,005% BHT, чтобы минимизировать окисление липидов. См. текст для более подробной информации.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 2. Обзор сканирований м / з 315-360 дикого типа и жира-3 (WA22) мутант экстрактов. Жидкие время удержания хроматографии (RT), показано на графике [A]. Извлеченные ионов при RT = 11,3 показаны для дикого типа [B] и жира-3 (WA22) [C] экстрактов. PG F3 класса с массой т / Z 351 выделяется. К.п.н., имп / сек; Аму, атомная единица массы.

ФигаЮр 3. MRM анализы дикого типа экстрактов. F1 ПГ класс обнаруживаются с массовым переходом м / з 355/311 [A]. Обратите внимание, что несколько гидрофобных соединений (RT> 14 мин), которые вряд ли будут протеогликанов, также обнаружены с этим переходом. ПГ F2 класса выявляются с массовым переходом м / з 353/193 [B]. PGs F3 класса выявляются либо массовый переход м / Z 351/193 [C] или м / Z 351/191 [D]. Обратите внимание, что экстракты содержат несколько PG изомеров каждого класса. Числа соответствуют ПГ представлены в Таблице 2. Концентрация CePGF2 составляет 1,8 нг / мл. RT, время удерживания; CPS, импульсов / с.

Рисунок 4. Индуцированные столкновениями разложения химически синтезаторesized PGF _2α и CePGF2. Стрелки на панели [A] указывают продукт или фрагментации ионов разделены между PGF _2α и CePGF2 (RT = 11,8). Продукт ионов при м / з 309 и м / з 193 генерируются из указанных сайтов расщепления (выделено и б) соответствуют структуры, показанные и характерные для F-серии ПГ [B]. К.п.н., импульсов / с. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Стандартный	RT (мин)	[Н] - м / Z	Основные ионы продукт в MS / MS
20-гидрокси PGE 2	9,43	367	349, 331, 287, 234, 189, 129, 109
PGF 3 -	11.26	351	333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111
Тромбоксана В2	11.66	369	289, 191, 177, 169, 151
PGF 2 -	11.80	353	335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111
PGF 1 -	11.79	355	337, 319 311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195
Lipoxin B 4	12.38	351	201, 191 189, 165, 155, 115, 107, 71, 59
PGD ​​2	12.56	351	315, 271 203, 189
5 (S), 6 (R) - Lipoxin четыре	12.83	351	235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59
PGA 2	14.02	333	315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109
Δ12-PGJ 2	14.20	333	271, 189, 123
Лейкотриен B 4	14.73	335	181, 109, 93, 71, 69, 59, 57
15D-Δ 12,14 PGJ-2	16.80	315	297, 271, 217, 203, 158
5 (S)-HPETE	17.88	335	97, 83, 81, 57

Таблица 1. Время удерживания и ключ ионов продукт 13 эйкозаноидов стандартам от метода LC-MS/MS ^3. Более 30 стандартов были использованы для разработки LC-MS/MS программы. Хроматографических времен удерживания (РТС) отличаются, даже среди очень похожи ПГ. Исключением является PGF _1α и PGF _2α. Тем не менее, эти ПГ являются Distinguished их родителей масс ионов ([Н] - м / г) и индуцированных столкновениями спектров разложение (MS / MS).

Простагландинов класса	Номер на рисунке 3	[Н] - м / Z	Основные ионы продукт в MS / MS
F1 (CePGF1)	1	355	319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157
F1	2	355	311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157
F2 (CePGF2)	3	353	309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127
F2	4	353	309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113
F3	5	351	315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139
F3	6	351	333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163

Таблица 2. Индуцированные столкновениями ионов продукт разложения для нескольких крупных C. Элеганс F1, F2, F3 и PGs показано на рисунке 3. МС / МС других меньших количествах изомеров не показаны. Эти данные из нескольких анализов, и не все ионы продукт может быть видимым в данном периоде. С учетом сложности экстракты, некоторые меньшем количестве ионов продукт может происходить от другого родительского иона с аналогичными времени удерживания или в результате вмешательства. Пик 2, вероятно, стереоизомер CePGF1 и пик 4, вероятно, стереоизомер CePGF2. См. Эдмондс, и соавт. (2010) для дополнительных данных ^3.

Обсуждение

Мы описываем процедуру эйкозаноида извлечения и анализа, уделяя особое внимание F-серии ПГ. Есть несколько частей процедура, которая может быть проблематичным. Во-первых, очень важно, что червь культур не голодают, как голод может изменить метаболизм PG. Для дополнительного питания, бактерии na22 рекомендуется вместо более часто используемых OP50 бактерий, потому что na22 достигает более высокой плотности. Тем не менее, Na22 штамм не хватает устойчивости к антибиотикам и более подвержен загрязнению. Во-вторых, черви синтезировать отдельные изомеры PG в низкой численности относительно тканях млекопитающих. Это может быть отчасти из-за избыточности Среди многочисленных изомеров. Мы рекомендуем около 6 грамм ткани всестороннего анализа и более сильным сигналом. Менее ткани (1-2 г), может быть использован, если Высушенный экстракт ресуспендировали в менее метанол: водный раствор для увеличения концентрации ПГ. Тем не менее, от одного до двух инъекций могут быть выполнены. Предел обнаружения нашей системе ЖХ-МС/МС составляет около 10 пгPGF _2α / мл. Один мл плотно упакованных червей смешанной этап (около 1 г) дает примерно 25-50 мкг CePGF2. Более чувствительный системы масс-спектрометрии можно уменьшить количество червей ткани требуется для анализа. В-третьих, различия в эффективности добычи PG среди образцов может вызвать различные результаты. Мы обнаружили, что эффективность экстракции очень похож когда ткани извлекаются параллельно. Для определения эффективности, добавить 1,0 нг PGF _{2α-D 4} на стадии гомогенизации в качестве внутреннего контроля. MRM использованием массовый переход м / Z 357/197 используется для измерения PGF _2α-d4 концентрации по отношению к 1 нг / мл стандартного раствора. Количество PGF _{2α-D 4} потеряли при добыче затем рассчитывается.

Хроматографии и масс параметры переходами учесть может быть изменена, чтобы обнаружить другие ПГ и эйкозаноидов. Несмотря на значительные усилия, мы не смогли определить D-серии и E-SerPGS х годов в экстрактах ^17. Кроме того, мы не обнаружили 8-ISO PGF _2α и 8-ISO PGE _2, которые характерны для инициированной свободными радикалами перекисного окисления, которое генерирует неселективных смесь стереоизомеров PG ^19. Независимо от червей синтезировать другие типы PG не известно. Эндоканнабиноиды и различных метаболитов эпоксидной смолы и гидрокси арахидоновой и эйкозапентаеновой кислоты были найдены в C. Элеганс извлекает ^5,7,20,21. Мы рекомендуем использовать как MRM и МС / МС по сравнению с подлинными стандартами для определения количества и идентификации, соответственно. Для новых эйкозаноидов, эти анализы должны быть объединены с сравнительное исследование жир мутанты, которые лишены ПНЖК синтеза ферментов ^22, а также функциональный анализ, если это возможно. Предостережение к анализу жира мутантов, что незначительное количество ПНЖК в настоящее червей достаточно для синтеза ПГ. Например, жиры-2 (wa17) мутантыимеют небольшое количество активность D12 десатуразы (~ 5% дикого типа ^22), и эти мутанты все еще ​​производят ПГ ^6. жира-3 (WA22) и жира-4 (WA14) мутанты не способны синтезировать протеогликанов, полученных из арахидоновой и эйкозапентаеновой кислоты ¹⁶ . Мы также обнаружили, что жир мутантов компенсировать потерю классов ПНЖК на повышающей регуляции синтеза ПГ от остальных классов. Например, жир-3 (WA22) мутанты не способны синтезировать наиболее ПГ, полученные из 20-углеродные ПНЖК. Вместо этого, они, кажется, активируют новые ПГ, полученные из 18-ПНЖК углерода ^16. На сегодняшний день мы не выявили C. Элеганс штамм, который полностью дефицитный в синтез ПГ. Вполне возможно, что ПГС являются существенными для роста и развития.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
X-large (16 cm) plates	Fisher Scientific	0875714
E. coli strain NA22	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	NA22	http://www.cgc.cbs.umn.edu
Acetone, 399.5%	Fisher Scientific	A928-4
Butylated Hydroxytoluene	MP Biomedicals	101162
Hexane, HPLC grade	Fisher Scientific	H302-1
Formic acid, 399%	Acros	AC27048-0010	Available through Fisher Scientific
Chloroform, HPLC grade	Acros	AC26832-0010	Available through Fisher Scientific
PGF2α-d4	Cayman Chemicals	316010	Cayman has a wide array of standards available for purchase
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube	Fisher Scientific	14-222-651	For use with Bullet Blender
0.5 mm zirconium oxide beads	Next >>> Advance	ZrOB05
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes	Kimble Kimax	45200-10	Available through Fisher Scientific
15 ml glass conical tubes	Corning Pyrex	8082-15	Available through Fisher Scientific
Sigmacote (Siliconizing reagent)	Sigma-Aldrich	SL2-100ML
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial	Fisher Scientific	V1235C-TFE
			EQUIPMENT
CentraSL2 Clinical Centrifuge	Thomas Scientific	2517N92-TS
Bullet Blender 5 blue homogenizer	Next >>> Advance	BBY5MB	A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm	Phenomenenex	00G-4375-B0	HPLC Column
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm	Phenomenenex	AJ0-7510
SecurityGuard Guard Cartridges Kit	Phenomenenex	KJ0-4282
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler	Shimadzu Scientific Instruments, Inc.		Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer	Applied Biosystems/MDS SCIEX
			M9 buffer recipe (4 liter) 12 g KH2PO4 24 g Na2HPO4 20 g NaCl Up to 4 liter Deionized water Aliquot to eight 1 liter bottles. Autoclave and cool. 0.5 ml/bottle 1 M MgSO4