Prostaglandina estrazione e l&#39;analisi in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Riepilogo

In questo lavoro, si descrive una procedura ottimizzata per l'estrazione e l'analisi di prostaglandine e altri eicosanoidi da C. elegans Usando LC-MS/MS.

Abstract

Caenorhabditis elegans sta emergendo come un modello animale potente per studiare la biologia dei lipidi ^1-9. Prostaglandine sono una classe importante di eicosanoidi, che sono segnali lipidici derivati ​​da acidi grassi poliinsaturi (PUFA) ^10-14. Queste molecole di segnalazione sono difficili da studiare a causa della loro bassa abbondanza e natura reattiva. La caratteristica di prostaglandine è una struttura ad anello ciclopentano situato all'interno della spina dorsale acido grasso. Nei mammiferi, le prostaglandine possono essere formati attraverso enzima cicloossigenasi-dipendente percorsi e indipendenti ^10,15. C. elegans sintetizza una vasta gamma di prostaglandine indipendenti della ciclossigenasi ^6,16,17. Una vasta classe di prostaglandine della serie F è stato identificato, ma lo studio di eicosanoidi è in una fase iniziale con ampio spazio per nuove scoperte. Qui si descrive una procedura per estrarre e analizzare prostaglandine e altri eicosanoidi. Lipidico Chargeds sono estratti da colture verme massa utilizzando una tecnica di estrazione liquido-liquido e analizzati mediante cromatografia liquida accoppiata a ionizzazione elettrospray spettrometria di massa tandem (LC-ESI-MS/MS). L'inclusione degli analoghi deuterati di prostaglandine, come PGF _{2 α-d 4} come è raccomandato uno standard interno per l'analisi quantitativa. Monitoraggio reazione multipla o MRM può essere utilizzato per quantificare e confrontare i tipi di prostaglandine specifiche tra gli animali wild-type e mutanti. Decomposizione indotta da collisione o MS / MS possono essere utilizzati per ottenere informazioni su importanti caratteristiche strutturali. Cromatografia liquida e spettrometria di massa (LC-MS) scansioni di indagine di una gamma selezionata di massa, come la m / z 315-360 può essere utilizzato per valutare i cambiamenti globali nei livelli di prostaglandine. Forniamo alcuni esempi di tutte e tre le analisi. Questi metodi fornirà ai ricercatori un set di strumenti per la scoperta di nuovi eicosanoidi e delineando le loro vie metaboliche.

Introduzione

Le prostaglandine (PG) sono una classe importante di ormoni lipidici che sono stati ampiamente studiati e implicati nella regolazione riproduzione, immunità, e lo sviluppo in una vasta gamma di organismi ^12-14. PG sono ideali per i sistemi globali di analisi di biologia in quanto comprendono una serie di lipidi derivati ​​da un precursore comune (s). Il nematode C. elegans è uno degli organismi modello più utilizzati per affrontare le questioni fondamentali della genetica e della biologia dei sistemi.

Abbiamo dimostrato che C. elegans sintetizza PG della serie F che guida spermatozoi mobili di ovociti ^3,6,16. PG serie F derivati ​​da PUFA 20-carbonio a tre, quattro, cinque e doppi legami, comprendente la F1, F2, F3 e classi, rispettivamente, sono stati identificati ^3,16. Questi PG sono sintetizzati indipendente di enzimi cicloossigenasi, eppure stereoisomeri PGF _{2α 1α} e PGF sono ancora generated. Per le analisi qualitative e quantitative di C. elegans PG, LC-MS/MS è un potente e sensibile tecnica analitica. Prima di eseguire questa analisi, è importante sviluppare un metodo di estrazione ottimizzato per le prestazioni del processo analitico dipende fortemente dalla qualità dell'estratto. Cromatografia liquida e spettrometria di massa possono fornire solo la massa anticipato rapporto carica (m / z), così come la forma del picco desiderabile e tempo di ritenzione dello ione genitore PG. Profilo metabolico di PG in C. elegans è un compito impegnativo che richiede diverse strategie di acquisizione di MS.

Scansione o indagine scansione completa LC-MS (Q1 scansione) ha il vantaggio di garantire che la maggior PG ionizzabili genereranno una risposta di spettrometria di massa. Mentre la scansione indagine fornisce utili informazioni sul profilo complessivo di PG rispetto al wild-type e mutante C. elegans, rilevamento di PG minori è compromessa a causa della bassa sensibilità. Neverthemeno, la scansione LC-MS indagine può dare una visione globale di PG ed è particolarmente utile per analizzare i mutanti previsti per influenzare il metabolismo di una vasta popolazione PG.

Nella identificazione metabolita, l'analisi LC-MS/MS di standard PG sintesi chimica viene eseguita prima di ottenere i loro spettri di ioni prodotto come composti di riferimento. Questi spettri può essere paragonato allo spettro di un metabolita sconosciuto. Multimodo reazione di monitoraggio (MRM) è utilizzato per una maggiore sensibilità e specificità. Un esperimento MRM avviene specificando il genitore ioni / ioni prodotto massa transizione di un composto. Conoscendo la massa e la struttura degli analiti bersaglio, è possibile prevedere teorici transizioni MRM per molti metaboliti sconosciuti.

Un metodo LC-MS/MS ottimizzato per la profilatura PG isomeri in C. elegans non è stata riportata. Qui si descrive un approccio integrato di estrazione e di spettrometria di massa consistente di LC-MS e LC-Metodi di MS / MS per la rilevazione, quantificazione, e indagando C. elegans PG metaboliti. Questo approccio può essere applicato ad altri eicosanoidi.

Protocollo

Il protocollo, come descritto di seguito è suddiviso in tre sezioni: cultura verme, l'estrazione delle prostaglandine, e l'analisi delle prostaglandine. Come già detto, ci sono più punti in cui i campioni possono essere conservati temporaneamente a -80 ° C o -20 ° C.

1. Worm Cultura

Si consiglia di circa 6 g di vermi stadio misti per LC-MS/MS completi. Ciò dovrebbe fornire sufficiente materiale per il rilevamento di almeno sei iniezioni separate. Per la quantificazione di PG conosciuti da MRM in una singola iniezione o due, 1-2 g sono sufficienti. Analisi di estratti di colture sincronizzate costituiti da una determinata fase è anche possibile. Fino a 4 diversi ceppi possono essere coltivate simultaneamente. Ad esempio, un controllo di tipo selvatico e tre diversi ceppi mutanti.

1. Preparare 65 X-grandi dimensioni (16 cm) piastre NGM e batteri concentrati per l'alimentazione supplementare. Utilizzare NA22 batteri per la semina. Per rendere i batteri concentrati per l'alimentazione supplementare, grow almeno quattro litri di NA22 in terreno LB per 16-24 ore. Spin down, rimuovere il surnatante e risospendere i batteri in 100 ml di tampone M9. 200 a 400 ml di questa soluzione batterica concentrata può essere richiesto per ogni ceppo verme. Conservare a 4 ° C.
2. Avviare culture verme su 5 X-grandi tavole. Crescere vermi per circa 3 o 4 generazioni fino a quando le piastre sono pieni di adulti gravide. Batteri concentrati devono essere aggiunti alle piastre per evitare la fame, se necessario (~ 1 ml / piastra e lasciare asciugare completamente il coperchio).
3. Lavare ermafroditi gravide in piatti con tampone M9 e raccogliere i vermi in un tubo di polipropilene 50 ml conica.
4. Consentire ermafroditi gravide di depositarsi sul fondo (di solito circa 3-5 minuti). Rimuovere il surnatante, compresi batteri, uova, e vermi stadio larvale. Risospendere in 15 ml di tampone M9 e mescolare delicatamente.
5. Trasferire 200 microlitri di sospensione verme a ciascuna delle 60 teste di serie piastre NGM. Disperdere i vermi attraverso le piastre. Tenere soluzione verme mescolatobene fino a quando tutti i piatti sono stati seminati per garantire che essi ricevano un numero all'incirca uguale di vermi.
6. Supplemento con batteri concentrati, se necessario (~ 1 ml/plate/12 a 24 periodo hr) per evitare la fame. Lasciare le piastre ad asciugare all'aria prima di sostituire i coperchi. Crescere vermi per 2-4 generazioni, a seconda del numero originale di teste di serie vermi, o fino a quando le piastre sono pieni di adulti gravide.
7. Harvest piastre verme un ceppo alla volta. Lavare i vermi fuori le piastre con tampone M9 e raccogliere in provette da 50 ml in polipropilene (per esempio 6 tubi). Utilizzare tampone M9 per lavare un piatto, poi trasferire il buffer verme pieno al piatto successivo. Dopo aver lavato un numero (ad es. 10 ^°) di piastre, trasferire il buffer verme pieno al tubo da 50 ml. Riempire il tubo verso l'alto con il tampone M9. Ripetere il lavaggio per il resto delle tavole.
8. Come gli adulti gravide si depositano sul fondo in 5-6 minuti, rimuovere il surnatante (~ 35 ml) e consolidare in uno o due tubi. Riempire i tubi a 50 ml con fresh M9 tampone, lasciare riposare per 3-5 minuti e rimuovere il surnatante lasciando adulti gravide. Ripetere 3 volte o fino a quando il surnatante è trasparente.
9. Utilizzo di un grande foro pipetta Pasteur, trasferire il maggior numero possibile di vermi due ml provette coniche 15 polipropilene. Centrifugare a 1000 rcf (~ 3.500 giri in CentraSL2) per 5 minuti in una centrifuga clinica. Rimuovere il surnatante e ripetere fino a quando tutti i vermi vengono trasferiti e pellet nello stesso tubo. Rimuovere il più possibile e surnatante vermi conservare a -80 ° C. Ripetere l'operazione per tutti i ceppi.

2. Prostaglandina Estrazione

I reagenti necessari per l'estrazione sono riportati di seguito. Il metodo viene modificato da quello del Golovko e Murphy ¹⁷ e comprende l'estrazione di acetone mediante purificazione liquido-liquido, che migliora la sensibilità LC-MS/MS. Un proiettile Blender 5 omogeneizzatore viene utilizzato nella procedura, anche se risultati simili possono essere ottenuti con un omogeneizzatore Dounce. Hydroxytolue Butylatedne (BHT) ed evaporazione sotto azoto (N ₂₎ gas sono utilizzati per prevenire l'ossidazione. Tutta la vetreria deve essere siliconato (Sigmacote) per ridurre il legame lipidi. Estrazione con solventi organici deve essere eseguita in una cappa chimica.

1. Pesare una provetta da 50 ml in polipropilene. Trasferire circa 6,0 g di vermi congelati dal tubo da 15 ml conservato a -80 ° C, tagliando attraverso il tubo con una lama di rasoio caldo vicino al marchio da 6,5 ​​ml. Una spatola metanolo-pulita può essere usato per rimuovere il verme pellet congelato dal fondo della provetta. Tagliando il pellet per recuperare la porzione inferiore, meno dense vermi larve e batteri residui dalla parte superiore del pellet vengono abbandonati.
2. Trasferire i vermi congelati per la pre-pesato 50 ml tubo conico. Se più campioni vengono elaborati, utilizzare la stessa quantità (6,0 g) di tessuto per gli studi comparativi. Come il worm disgelo in una pasta, aggiungere o rimuovere i vermi con la spatola per ottenere la massa desiderata. Optional: annunciod 1,00 ng di standard di PGF _2α-d4 come controllo interno per l'efficienza di estrazione.
3. Aggiungere 12 ml di ghiacciata 02:01 acetone / salina con 0,005% BHT per la sospensione di vite senza fine e mescolare bene nel vortex. Dispensare 1.5 ml di liquame worm per ciascuno dei dodici 5 ml tubi di plastica autoportanti per impiego in Blender proiettile.
4. Aggiungere 0,7-0,8 ml di 0,5 mm di diametro Ceria stabilizzata perle di ossido di zirconio per ciascuna provetta da 5 ml. Chiudere ermeticamente tappi e caricare i 12 tubi in the Bullet Blender 5 omogeneizzatore. Esegui il frullatore per 3 minuti a velocità 8-9 e posizionare i tubi in ghiaccio. Assicurarsi di chiudere i tappi molto stretto o il contenuto potrebbe fuoriuscire. Controllare 10 ml di omogeneizzato da un tubo su un vetrino utilizzando uno stereoscopio. Non ci dovrebbero essere molto pochi vermi intatti rimanenti. Ripetere alla stessa velocità per un altro minuto, se necessario.
5. Uniformemente trasferire i omogenati di quattro tubi di vetro da 10 ml coniche con una "pipetta Pasteur 9. Evitare di trasferire perline. Lavare le perline da tre tubi sequentially con 1 ml di 1:2 acetone / salina contenente BHT. Ripetere l'operazione per altri tubi fino a tutte le perline vengono lavati. Trasferire la soluzione rimanente (~ 4 ml) per i tubi di vetro da 10 ml e disporli sul ghiaccio.
6. Centrifugare le provette di vetro da 10 ml a 4 ° C in una centrifuga clinica a ~ 1.000 xg per 10 min. Trasferire il surnatante da ogni provetta da 10 ml tubo conico di vetro pulito.
7. In una cappa chimica, aggiungere un uguale volume di esano a ciascun tubo di vetro 10 ml. Ad esempio, aggiungere 3,5 ml di esano a 3,5 ml di acetone / soluzione salina. Vortex alla massima velocità per 30 sec.
8. Centrifugare le provette di vetro da 10 ml a 4 ° C in una centrifuga clinica a ~ 1.000 xg per 10 min. Eliminare la fase superiore contenente esano e lipidi neutrale cariche.
9. Acidificare la fase inferiore a pH 3,5 con acido formico 2 M (circa 100 - 150 ml). PH test con le strisce di pH.
10. Aggiungere un uguale volume di cloroformio in ogni provetta. Vortex alla massima velocità per 30 sec e centrifugare le provette a 4 ° C ina centrifuga clinica a ~ 1.000 xg per 10 min.
11. Rimuovere ed eliminare la fase acquosa superiore. Inserire la punta della pipetta attraverso qualsiasi interphase lattiginoso residua alla fase di cloroformio, evitando l'interfase. Raccogliere la fase inferiore di ciascuno dei 4 tubi ad una pulita 15 ml tubo di vetro conico. Incubare a -20 ° C per almeno 24 ore. A questo punto, l'estratto può essere conservato a -20 ° C per due settimane.
12. Prendere l'estratto dal freezer e scartare il restante latte strato superiore acquoso, se presente. Trasferire la fase cloroformio in una fiala di vetro ½-Dram etichettato rivestita di teflon con una nuova pipetta Pasteur. In una cappa chimica, si evapora il cloroformio frazione solubile a secco sotto leggero flusso di N ₂ gas. L'estratto secco può essere conservato a -20 ° C fino a 2 settimane. Uno schema generale utilizzato per l'estrazione e l'analisi PG è mostrato in Figura 1.

3. Analisi delle prostaglandine

1. Preparare il brodosoluzioni di singoli prostaglandine riferimento, come PGF _2α o PGF _{2 α-d4} (1 pg / ml) in metanolo e diluire con metanolo: acqua (08:02 v / v) per ottenere una soluzione di lavoro. Preparare una serie di diluizioni (100, 10, 1, 0,1, 0,01 ng / ml) per generare una curva standard.
2. Aggiungere 200 microlitri metanolo: acqua (08:02 v / v) alla C. essiccato estratto lipidico elegans (s) e mescolare accuratamente. Se meno di 6 g di tessuto verme è stato estratto, estratto secco deve essere risospeso in meno volume di metanolo: soluzione acquosa.
3. Preparare la fase mobile costituita da 0,1% di acido formico in acqua [A] e acetonitrile contenente 0,1% di acido formico [B].
4. Impostare il campionatore automatico a 4 ° C e posizionare le fiale di esempio in un 70-count 1,5 ml cremagliera fiala.
5. Equilibrare l'idro colonna RP-C18 Synergy con 0,1% di acido formico ad un flusso di 0,2 ml / min per circa 5 min.
6. Iniettare il campione (20-50 ml) nel pozzetto della colonna. Eseguire la pendenza inizia l'eluizionezione con il 10% B e salendo al 80% B 0-11 min, 80-100% B 11-14 min, e tornando indietro al 10% B a 16 min. Il tempo totale di esecuzione è di 20 min. I tempi di ritenzione dei 13 standard autentici sono mostrate in Tabella 1 per riferimento ^3.
7. Introdurre la colonna effluente nello spettrometro di massa utilizzando una interfaccia ESI operante in modalità ioni negativi. L'azoto viene utilizzato come un nebulizzatore e gas tenda (CUR = 10). Il gas di collisione, l'energia di collisione, e la temperatura sono fissati a 10, -35 eV e 600 ° C rispettivamente. Potenziale Declustering (DP), l'energia di collisione (CE), e il potenziale di uscita cella (CXP) sono fissati a -90, -35 e -10, rispettivamente.
8. Per le scansioni di indagine (scansioni Q1), utilizzare la modalità di ioni negativi nel range di massa m / z 315-360 per la maggior parte dei PG (Figura 2). L'intervallo può essere modificato, in funzione della massa del composto (s) di interesse. Estrarre gli ioni dalla corrente ionica totale (TIC) di LC-MS ioni cromatogrammi e determinare se l'estrazioneioni ted corrispondono a ioni deprotonate o addotto, oppure per ioni frammento.
9. Per gli esperimenti MRM, transizione massa m / z 355/311 è usato per rilevare la classe F1, m / z 353/193 è utilizzato per la classe F2, e m / z 351/193 o 351/191 è utilizzato per la classe F3 (Figura 3). MRM è anche usato per rilevare lo standard interno (ad esempio, m / z 357/197 per PGF _2α-d4) e per generare la curva standard. Per ulteriori informazioni sui PG transizioni di massa ¹⁸ Vedi Murphy et al..
10. Per gli esperimenti di MS / MS, usa m / z 355 per la classe F1, m / z 353for classe F2, e m / z 351for F3 classe PG. C. elegans dati MS / MS per PG F-Series è disponibile in Figura 4 e Tabella 2 ^3,16. Dati MS / MS per eicosanoidi mammiferi è disponibile a www.lipidmaps.org .
11. Elaborare i dati analitici che utilizzano Analyst software (versione 1.4.2, Applied Biosystems).

Risultati

Preparazione del campione è stata effettuata mediante estrazione liquido-liquido adattato da Golovko e Murphy ^17. Ha fornito eccellenti recupero dello standard interno (PGF _2α-d4). Lo schema generale per l'estrazione di PG da C. elegans è mostrato in Figura 1. Condizioni cromatografiche sono stati ottimizzati per fornire la separazione al basale> 30 norme eicosanoidi (tabella 1 mostra 13 standard). Una colonna Hydro-Rp (250 x 2,0 mm di) con acqua e acetonitrile contenente 0,1% di acido formico fornito la migliore separazione e sensibilità. Scansioni sondaggio di estratti mutanti wild-type e grasso-3 mostrato in figura 2 del documento livelli globali di ioni all'interno della gamma di massa di 315-360 unità di massa atomica. Grasso-3 (WA22) mutanti mancano PUFA 20-carbonio più. Una classe F3 PG è evidenziato. Nella Figura 3, le analisi MRM di un estratto di tipo selvatico mostrano multipli isomeri PG della F1 (figura 3A ng>), F2 (Figura 3B) e F3 (figure 3C e 3D) classi. La classe F3 può essere rilevato con uno di due transizioni di massa, m / z 351/193 o di m / z 351/191. CePGF2 è prevalentemente costituito dal PGF _2α enantiomero. CePGF1 è probabile che sia PGF _1α o suo enantiomero. Figura 4 mostra la decomposizione indotta da collisione di CePGF2 (RT = 11,8) rispetto allo standard PGF2 _α (RT = 11,8). Piccole differenze di ioni prodotto sono probabilmente dovuti alla scarsa abbondanza CePGF2 e composti co-eluizione nell'estratto.

Figura 1. Schema di C. elegans PG estrazione e analisi LC-MS. Notare che l'acetone / cloroformio e soluzione salina entrambi hanno 0,005% BHT per minimizzare l'ossidazione dei lipidi. Fare riferimento al testo per ulteriori dettagli.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.

Figura 2. Scansioni sondaggio di m / z 315-360 di estratti mutanti wild-type e grasso-3 (WA22). Tempo di ritenzione mediante cromatografia liquida (RT) è mostrato in pannello [A]. Ioni estratti a RT = 11.3 sono mostrati per wild-type [B] e grasso-3 (WA22) [C] estratti. Una classe F3 PG di massa m / z 351 è evidenziato. Cps, conteggi / sec; amu, unità di massa atomica.

Figure 3. Analisi MRM di estratti wild-type. PG classe F1 vengono rilevati con transizione di massa m / z 355/311 [A]. Si noti che diversi composti idrofobici (RT> 14 min), che sono difficilmente essere PG, vengono rilevate anche con questa transizione. F2 PG classe vengono rilevati con transizione di massa m / z 353/193 [B]. F3 PG classe vengono rilevati sia con transizione di massa m / z 351/193 [C] o m / z 351/191 [D]. Si noti che gli estratti contengono più isomeri pg di ogni classe. Numeri corrispondono a PG mostrate in Tabella 2. La concentrazione di CePGF2 è 1,8 ng / ml. RT, tempo di ritenzione; cps, conteggi / sec.

Figura 4. Collisione indotta decomposizione di synth chimicamenteesized PGF _2α e CePGF2. Frecce in pannello [A] indica ioni prodotto o frammentazione condivisi tra PGF _2α e CePGF2 (RT = 11,8). Gli ioni prodotti a m / z 309 e m / z 193 sono generati da siti di rottura indicati (evidenziata a e b), corrispondono alle strutture, e sono caratteristici di PG della serie F [B]. Cps, conteggi / sec. Clicca qui per ingrandire la figura .

Standard	RT (min)	[MH] - m / z	Ioni prodotti principali di MS / MS
20-idrossi PGE 2	9.43	367	349, 331, 287, 234, 189, 129, 109
PGF 3 -	11.26	351	333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111
Trombossano B 2	11.66	369	289, 191, 177, 169, 151
PGF 2 -	11.80	353	335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111
PGF 1 -	11.79	355	337, 319.311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195
Lipoxin B 4	12.38	351	201, 191.189, 165, 155, 115, 107, 71, 59
PGD ​​2	12.56	351	315, 271.203, 189
5 (S), 6 (R) - Lipoxin A 4	12.83	351	235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59
PGA 2	14.02	333	315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109
Δ12-PGJ 2	14.20	333	271, 189, 123
Leucotriene B 4	14.73	335	181, 109, 93, 71, 69, 59, 57
15d-Δ 12,14-PGJ 2	16.80	315	297, 271, 217, 203, 158
5 (S)-HPETE	17.88	335	97, 83, 81, 57

Tabella 1. I tempi di ritenzione e ioni prodotto chiave del 13 norme eicosanoidi dal metodo LC-MS/MS ^3. Oltre 30 gli standard sono stati usati per sviluppare il programma LC-MS/MS. I tempi di ritenzione cromatografici (RTS) sono diversi, anche tra PG molto simili. Un'eccezione è PGF _{2α 1α} e PGF. Tuttavia, questi PG sono distinguished dalle loro masse di ioni controllanti ([MH] - m / z) e collisione indotta spettri decomposizione (MS / MS).

Classe delle prostaglandine	N ° in figura 3	[MH] - m / z	Ioni prodotti principali di MS / MS
F1 (CePGF1)	1	355	319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157
F1	2	355	311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157
F2 (CePGF2)	3	353	309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127
F2	4	353	309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113
F3	5	351	315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139
F3	6	351	333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163

Tabella 2. Collisione indotte decomposizione ioni prodotti per diversi importanti C. elegans F1, F2, F3 e PG mostrati nella Figura 3. MS / MS di altri isomeri meno abbondanti non sono mostrate. Questi dati provengono da molteplici analisi e non tutti gli ioni prodotto possono essere visibili in un dato periodo. Data la complessità degli estratti, alcuni ioni prodotto meno abbondanti possono derivare da un altro ione genitore con tempo di ritenzione simile o risultare da interferenze. Peak 2 è probabilmente uno stereoisomero di CePGF1 e di picco 4 è probabilmente uno stereoisomero di CePGF2. Vedi Edmonds, et al. (2010) per i dati di altri ^3.

Discussione

Descriviamo una procedura per l'estrazione degli eicosanoidi e analisi, concentrandosi su PG F-series. Ci sono diverse parti della procedura che può essere problematico. In primo luogo, è fondamentale che le colture a vite senza fine non morire di fame, come la fame può alterare il metabolismo PG. Per l'alimentazione supplementare, NA22 batteri sono raccomandati al posto dei più comunemente usati OP50 batteri perché NA22 raggiunge una maggiore densità. Tuttavia, il ceppo NA22 manca di resistenza agli antibiotici ed è più suscettibile alla contaminazione. In secondo luogo, i vermi sintetizzano i singoli isomeri PG in basso relativa abbondanza di tessuti dei mammiferi. Ciò può essere dovuto in parte alla ridondanza tra i numerosi isomeri. Si consiglia di circa 6 g di tessuto per l'analisi completa e segnali più forti. Meno tessuto (1-2 g) può essere utilizzata se l'estratto secco è risospeso in meno metanolo: soluzione acquosa per aumentare la concentrazione PG. Tuttavia, solo uno o due iniezioni possono essere eseguite. Il limite di rivelazione del nostro sistema LC-MS/MS è circa 10 pgPGF _2α / ml. Un ml di densamente vermi stadio miste (circa 1 g) produce circa 25-50 pg di CePGF2. Sistemi di spettrometria di massa più sensibili possono ridurre la quantità di tessuto senza fine per l'analisi. In terzo luogo, le differenze in termini di efficienza di estrazione PG tra i campioni possono causare risultati variabili. Abbiamo trovato che l'efficienza di estrazione è molto simile quando i tessuti vengono estratti in parallelo. Per determinare l'efficienza, aggiungere 1,0 ng di PGF _{2α-d 4} alla fase di omogeneizzazione come controllo interno. MRM utilizzando transizione massa m / z 357/197 viene usato per misurare PGF _2α concentrazione-d4 rispetto ad un 1 ng / ml di soluzione standard. La quantità di PGF _{2α-d 4} persi durante l'estrazione viene quindi calcolata.

I parametri cromatografici e transizioni di massa che abbiamo inserito può essere modificato per rilevare altri PG ed eicosanoidi. Nonostante i notevoli sforzi, non siamo stati in grado di identificare serie D o E-serIES PGS negli estratti ^17. Inoltre, non abbiamo rilevato 8-iso PGF _2α e 8-iso _PGE2 che sono caratteristici del libero perossidazione radicale-iniziato, che genera una miscela non selettivo di PG stereoisomeri ^19. Sia i worm sintetizzano altri tipi PG non è noto. Gli endocannabinoidi e vari metaboliti epossidiche e idrossi di arachidonico e acido eicosapentaenoico sono stati trovati in C. elegans estrae ^5,7,20,21. Si consiglia l'uso di entrambi MRM e MS / MS rispetto agli standard autentici per la quantificazione e l'identificazione, rispettivamente. Per nuove eicosanoidi, queste analisi dovrebbero essere combinati con uno studio comparativo di mutanti grassi, che sono carenti in PUFA sintetizzare enzimi ^22, così come un saggio funzionale, se possibile. Un avvertimento per analizzare i mutanti di grasso è che piccole quantità di acidi grassi polinsaturi presenti nel vermi sono sufficienti per la sintesi di PG. Per esempio, i grassi-2 (wa17) mutantiavere una piccola quantità di D12 dell'attività desaturasi (~ 5% di tipo selvaggio ²²⁾ e questi mutanti producono ancora PG ^6. grasso-3 (WA22) e grasso-4 (WA14) mutanti non riescono a sintetizzare derivati ​​da PG arachidonico e acidi eicosapentaenoico ¹⁶ . Abbiamo anche trovato che i mutanti grasso compensare la perdita di classi PUFA fino regolando-sintesi di PG dalle classi rimanenti. Per esempio, grasso-3 (WA22) mutanti non riescono a sintetizzare maggior PG derivati ​​da PUFA 20-carbonio. Al contrario, essi sembrano up-regolare romanzo PG derivati ​​dal 18-carbonio PUFA ^16. Ad oggi, non abbiamo individuato una C. elegans ceppo che è completamente carenti di sintesi di PG. E 'possibile che i PG sono essenziali per la crescita o di sviluppo.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
X-large (16 cm) plates	Fisher Scientific	0875714
E. coli strain NA22	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	NA22	http://www.cgc.cbs.umn.edu
Acetone, 399.5%	Fisher Scientific	A928-4
Butylated Hydroxytoluene	MP Biomedicals	101162
Hexane, HPLC grade	Fisher Scientific	H302-1
Formic acid, 399%	Acros	AC27048-0010	Available through Fisher Scientific
Chloroform, HPLC grade	Acros	AC26832-0010	Available through Fisher Scientific
PGF2α-d4	Cayman Chemicals	316010	Cayman has a wide array of standards available for purchase
Sterile screw cap self-standing 5 ml tube	Fisher Scientific	14-222-651	For use with Bullet Blender
0.5 mm zirconium oxide beads	Next >>> Advance	ZrOB05
10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes	Kimble Kimax	45200-10	Available through Fisher Scientific
15 ml glass conical tubes	Corning Pyrex	8082-15	Available through Fisher Scientific
Sigmacote (Siliconizing reagent)	Sigma-Aldrich	SL2-100ML
Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial	Fisher Scientific	V1235C-TFE
			EQUIPMENT
CentraSL2 Clinical Centrifuge	Thomas Scientific	2517N92-TS
Bullet Blender 5 blue homogenizer	Next >>> Advance	BBY5MB	A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative
Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm	Phenomenenex	00G-4375-B0	HPLC Column
SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm	Phenomenenex	AJ0-7510
SecurityGuard Guard Cartridges Kit	Phenomenenex	KJ0-4282
Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler	Shimadzu Scientific Instruments, Inc.		Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient
API 4000 triple quadrupole mass spectrometer	Applied Biosystems/MDS SCIEX
			M9 buffer recipe (4 liter) 12 g KH2PO4 24 g Na2HPO4 20 g NaCl Up to 4 liter Deionized water Aliquot to eight 1 liter bottles. Autoclave and cool. 0.5 ml/bottle 1 M MgSO4