JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Intraoküler nakli ve konfokal mikroskopi birleştirerek yeni bir yaklaşım aşılı dokuların içinde tek hücreli çözünürlüğe sahip uzunlamasına, non-invaziv, gerçek zamanlı görüntüleme sağlar In vivo. Biz fare gözün ön kamaraya pankreas adacık nakli nasıl gösterilmektedir.

Özet

Intravital görüntüleme biyolojik araştırma vazgeçilmez bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu süreç içinde bir çok görüntüleme teknikleri invaziv olmayan hayvanlarda çeşitli biyolojik süreçlerin çalışma geliştirilmiştir. Ancak, mevcut intravital görüntüleme yöntemlerinin önemli bir teknik sınırlama tek hücreli çözünürlük yetenekleri ile non-invaziv, boyuna görüntüleme birleştirmek için yetersizliğidir. Biz gözün ön kamara içine nakli in vivo hücresel çözünürlüğü ile non-invaziv, boyuna görüntüleme sağlayan çok yönlü bir deney platformu sunan böyle önemli sınırlama circumvents nasıl burada gösterir. Biz fare nakli prosedürü göstermek ve yani klinik önemi, pankreas adacık nakli ile bir model kullanarak temsilcisi sonuçlar sağlar. Gözün anteryor odacık içine transplante dokuların çeşitli direkt görüş sağlamak için ek olarak, bu yaklaşım kayşat için bir platform sağlargerçekleştirerek n ilaçların uzun süreli takip ve hedef dokularda izleme. Çünkü gözü faydaları transplantasyon tedavileri sadece ön odasına, çok yönlülüğü, doku / hücre nakli, sinyal iletimi ve kanser veya otoimmün hastalık gelişme olarak fizyolojik ve patofizyolojik süreçlerin çalışma vivo uygulamalarda diğer uzanır.

Giriş

Intravital mikroskopi Gelişmeler vitro çalışmalar 1 öngördüğü olmayan fizyolojik fenomenler ortaya koymuştur. Bu canlı hayvan içine in vitro yöntemler konvansiyonel ile elde edilen bulgular çevirisinde meydan vurgulamaktadır. Son on yıl içinde, canlı hayvanlarda dokuların görselleştirme ölçüde görüntüleme yöntemleri 2, 3, 4, 5, 6, teknolojik gelişmeler tarafından geliştirildi. Bu non-invaziv, hedef dokuların boyuna görselleştirme sağlamak için deneysel hayvan modellerinde uygulanabilir uygulama ile in vivo görüntüleme yaklaşımlar ihtiyaç mahmuzlu vardır.

Manyetik rezonans görüntüleme ve pozitron emisyon tomografisi veya biyolüminesans görüntüleme teknikleri vücut 7-8, 9 içinde derin organ / dokuların non-invaziv görüntüleme sağlamıştır. Ama bu tekniklerin kullanımı o rağmen, yüksek arka sinyaller ve düşük uzaysal çözünürlüğü nedeniyle hücre çözünürlüklü tek elde edemezf yüksek kontrast maddeler veya doku-spesifik lüminesans 4. Bu iki foton floresans konfokal mikroskopi 10 gelişiyle birlikte ele alındı. İki foton mikroskopi intravital görüntüleme çalışmaları görselleştirmek ve görülmemiş detayları 11, 12 ile hücresel olayları ölçmek için etkin. Bu sağlık ve hastalık 13, 14, 15, 16 kilit biyolojik süreçlerin karakterizasyonu yol açmıştır. Öncü intravital görüntüleme çalışmalarında öncelikle eksize edilen doku (örneğin lenf düğümleri) in vivo koşullarda "taklit" olmasına rağmen, diğer çalışmalar yerinde 17, 18, ​​19, 20, 21 görüntü maruz hedef doku invaziv yaklaşımlar kullanmışlardır. Diğer çalışmalar da invaziv yaklaşımlar ve in vivo 22, 23, 24, 25 sınırlı görüntüleme çözünürlüğü ile ilişkili sınırlamaları aşmak için "pencere odacık modeller" kullandık. Pencere oda modelinde, bir saydam bir pencere ile bir bölme cerrahi yönün azından deri içine implantehayvan kira konumları (dorsal veya kulak deri, meme yağ yastığı, karaciğer, vb) (örneğin fare, sıçan, tavşan). Bu yaklaşım açıkça in vivo görüntüleme yüksek çözünürlüklü sağlarken, bunu odasına implante bir invaziv cerrahi gerektirir ve birkaç hafta veya ay 22'nin üzerinde uzunlamasına görüntüleme çalışmalarında karşılamak mümkün olmayabilir.

Son zamanlarda gözün ön odasına yani minimal invaziv bir prosedür nakli ile yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi birleştirerek (ACE) gibi bir "doğal vücut penceresi" sağladığı gösterilmiştir güçlü ve in vivo görüntüleme platformu 26, 27 çok yönlü. ACE içine Transplantasyon dokular 28, 29, 30, çeşitli biyolojik yönlerini incelemek için son birkaç yıldır kullanılmakta olan ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile yeni kombinasyonu tek hücre-çözünürlük ile pankreas adacıklarının fizyolojisi okuyan etkin olmayan invazif ve uzunlamasına <> 26, 27 sup. Bu yaklaşım, hayvan modellerinde tip 1 diyabet (yayınlanmamış veri) geliştirilmesi sırasında otoimmün yanıtları incelemek için kullanılmıştır. Aynı zamanda, sırasıyla, ACE pankreas tomurcuklar ya da kişisel böbrek glomerülleri, (yayınlanmamış veriler) içine taşımak tarafından böbrek fonksiyonunu çalışmalarda, pankreas gelişme çalışma, hem de kullanılmıştır. Bu yaklaşımı kullanarak yeni bir rapor daha pankreas adacık nakli 31 sonrası bağışıklık yanıtlarını okumak uygulaması gösterilmiştir. Önemlisi, bu çalışma gerçekleştirmek için doğal bir vücut pencere sağlar gözün ön kamara içine nakli gösterdi: in vivo nakledilen dokuların (1) boyuna, non-invaziv görüntüleme, (2), in vivo hücresel fenotip ve uygulanabilirliğini değerlendirmek için cytolabeling in situ; hedef dokuda immün hücrelerinin infiltre (3) gerçek zamanlı izleme ve topikal uygulama veya göziçi enjeksiyon (4) yerel müdahale.

Burada, dpankreas adacıkları kullanılarak gözün ön kamara içine nakli gerçekleştirmek için nasıl emonstrate.

Protokol

Aşağıdaki yordam 2 adım stereoskop altında yapılır, ilk adım kanül içine adacıklar yükleme içerir ve ikinci adım ACE fiili naklidir. Hayvanlar üzerinde yapılan tüm işlemler Miami Üniversitesinin kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Transplantasyon için Kanül Yükleme adacıkları

  1. Daralma çevrelerinde çanak iplik Merkezi kültürü çanak adacıklar.
  2. "Rezervuar" dan kanül ayırın ve temiz bir yüzey üzerinde kanül ve bağlantı hortumu yerleştirin. Rezervuar filtresi (Şekil 1a) olmadan 300 ul tek kullanımlık plastik pipet üzerinden yapılabilir.
  3. Rezervuar içine aspirasyon olduğunda adacık sürekli akış sağlamak için rezervuarın hava kabarcıklarının dışarı yıkayın. Rezervuar Flushing ayak pedalı kullanarak eller serbest motorlu şırınga sürücüsü ileri sürerek yapılır(Şekil 1B, C). Bu da rezervuar (örneğin tuz, PBS veya kültür ortamı gibi steril solüsyonu ile önceden yüklenmiş olarak) içine adacık aspirasyon izin şırınga boşluk yapacaktır.
  4. Yavaşça rezervuar içine adacık istenilen miktarda aspire. Onlar rezervuar girin ve dibe doğru birlikte olarak kalacaktır adacıkları girdap eğiliminde olacaktır. Aspirasyon ayak pedalı kullanarak geriye motorlu şırınga sürücü sürüş yapılır.
  5. Bağlayan tüp yoluyla rezervuar kanül takın.
  6. Kültür çanak geri kanül ucu yerleştirin ve kanül içine daha sonra boru içine rezervuarın adacıkları dışarı floş. Eğer hafifçe (çekme) boru (Şekil 1d) "Flicking" ile tüp / kanül geri dolgu olarak adacık birlikte kalmasını sağlayın. Kanül dışarı atılır öncesinde adacıklar tüm hava kabarcıkları önce veya sonra durdurun. Emin değilseniz, adacıklar kalan hava gibi kanül geri girmek olarak durdurmaköncesinde adacıklar baloncuklar ACE adacık reflü (geri akış) üzerinden önlemeye yardımcı olabilir. Gecede dağılacaktır.
  7. Bu aşamada, ACE (sonraki adımlara bakın lütfen) içine adacıklar enjekte hazırız.

2. Göz Ön Kamara içine Islet Nakli

  1. Stereoskop altında sıcak bir pad üzerinde anestezi fare yerleştirin.
  2. Oksijen / izofluran anestezisi makineye bağlı anestezi "maske" içine fare burun yerleştirin. Maske bir 1 ml tek kullanımlık plastik pipet ucu (filtre) olmadan yapılmış ve dar uç (Şekil 2a, b) ile anestezi tüpe bağlanır.
  3. Yavaşça parmağı ve başparmak serbest elin ve "pop" iyi pozlama ve kolay erişim (Şekil 2c) için dışarı göz kullanılarak nakledilmesi zorunluluğu göz göz kapakları çekin. Bu aşırı basınç tarafından fare nefes engel olmadan mükemmelleştirmek için biraz pratik gerektirirBoyun veya kafa kan akışını engelliyor.
  4. Bir tek insülin şırınga (29 - 31G) kullanarak neşter gibi, dikkatli korneada sadece ucu nüfuz ve tek lateral insizyon yapın. ACE (Şekil 2d) dışına enjeksiyonu sırasında adacık reflü aza indirmek için kornea ve limbusun apeks arasındaki orta noktada kesi olun.
  5. Dikkatle kesiden kanül (adacıkları ile önceden yüklenmiş) takın.
  6. Yavaşça kanül adacıkları dışarı çıkarmak ve iris üstüne onları yatırmak. ACE aşırı basınç birikmesi nedeniyle adacık reflü önlemek için, kesi kadranda tersi mümkün olduğunca az ses (ler) olarak kısa bindirmeler içinde adacıklar çıkarın. Bu da kanül (adım 1.6 bakınız) yüklenirken tüp adacıkları sıkıştırma tarafından sağlanabilir.
  7. Yavaşça ACE kanül dışarı çekin. Adacık büyük hacimli bir pres nedeniyle adacık reflüsü olarak enjekte edildi Bu, özellikle, önemli bir adımdırEmin ACE içinde biriken kaçınılmaz olabilir. Kanül etrafında kesiden fazla basıncı tahliye etmek ACE içinde iken adacık reflü aza indirmek / ortadan kaldırmak için, yavaşça kanül döndürün. Eğer kanül geri ve gerekirse, ACE tamamen geri çekilmeden önce basınç azalana kadar kanül beklemek için bir girişim olarak reflü belirtileri kontrol edin.
  8. Steril PBS veya serum fizyolojik ile nakledilen gözü yıkayınız.
  9. Ilk 48 saat boyunca post-operatif analjezi (subkutan 0.05-0.1 mg / kg) için buprenorfin enjekte edilir.
  10. Hemen nakli sonrası nakledilen gözle eritromisin oftalmik antibiyotik merhem uygulayın.
  11. Derlenme izin ısıtılmış bir kafesine geri hayvan yerleştirin.

Sonuçlar

"Iyi" bir transplantasyon tanımlayan birkaç parametre vardır. İyi bir transplantasyon video görülebileceği gibi kesi zaman kanama olmadan ilerler bir yoldur. Kanama ACE (Şekil 3a) içine neşter (iğne) sadece ucu nüfuz ederek önlenebilir / minimize edilmiştir. Bu da iris temas ve ponksiyon önlemeye yardımcı olacaktır. Ayrıca zaman (Şekil 3c, d) üzerinde kornea bulanıklıkları neden olmadan çok iyi iyileşir küçük bir kesi sağlayacaktır. Başarılı b...

Tartışmalar

Murin pankreas adacıklarının daha önce anlatıldığı gibi 33, yoğunluk gradient üzerinde saflaştırma, ardından kollajenaz sindirimi ile izole edilmiştir. İzole adacık nakli öncesi gecede kültüre edildi. Bu gerekli olmasa da, bu adacıkları izolasyon prosedürü kurtarmak için izin tavsiye edilir. O / sağlam adacık hayatta nakli sağlayacak gibi bu nakli diyabetik alıcılarında yapıldığında önemlidir.

Transplantasyon oksijen / izofluran karışımı (% 1...

Açıklamalar

PO.B. ticari bir hizmet platformu olarak gözün ön kamara kullanmak için gidiyor biyoteknoloji şirketi Biocrine, kurucularından biridir. AC Bu teknoloji koruma patent üzerinde.

Teşekkürler

Biz Drs kabul ediyorsunuz. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, Stephan Speier ve verimli tartışmalara Daniel Nyqvist. Ayrıca video kayıt ile yardım Eleut Hernandez ve Diego Espinosa-Heidmann teknik yardım için, ve Mike Valdes ve Margaret Formoso ederim. Byron Maldonado, düzenlenebilir kaydedilir ve son video üretti. Araştırma destek Diyabet Araştırma Enstitüsü Vakfı (tarafından sağlanmıştır www.DiabetesResearch.org ), NIH / NIDDK / NIAID (MHA için F32DK083226; AC NIH RO3DK075487; PO.B. için U01DK089538). PO.B Ek araştırma desteği Karolinska Enstitüsünde, İsveç Araştırma Konseyi, İsveç Diyabet Vakfı, Aile Erling-Persson Vakfı, Aile Knut ve Alice Wallenberg Vakfı, VIBRANT Skandia Sigorta Şirketi Ltd, fonlar aracılığıyla sağlanan ( Karolinska Enstitüsü de Diyabet FP7-228933-2), Stratejik Araştırma Programıitutet, Novo Nordisk Vakfı ve Çekek von Kantzow Vakfı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Açıklama / Yorumlar
IsoTHESIA (İzofluran) Buttler Hayvan Sağlığı Kaynağı 11695-6775-2 % 99.9 İzofluran / ml
Ketaset (Ketamin HCL) Fort Dodge Hayvan Sağlığı 0856-2013-01 Alternatif enjektabl anestezi
Beprenex (Buprenorfin HCL) Reckitt Benckiser, Sağlık (UK) Ltd 12496-075-7-1 0.3 mg / ml '
Eritromisin oftalmik merhem, USP,% 0.5 Akron 17478-070-35 Nakledilen göze profilaktik Uygulamalı
% 0.9 Sodyum Klorür (Tuz) Hospira Inc 0409-7983-03 Iv enjeksiyon için. Steril
PBS Gibco 10010-023 1X. Steril
CMRL orta 1066 Cellgro 98-304-CV Desteklenmiş, CIT modifikasyonu. Adacıklar için tercih edilen medya

Referanslar

  1. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
  2. Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival - a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
  3. Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
  4. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
  5. Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
  6. Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
  7. Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
  8. Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
  9. Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
  10. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  11. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
  12. Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  13. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
  14. Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
  15. Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99 (2011).
  16. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
  17. Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of 'color-coded' effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
  18. Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
  19. Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732 (2010).
  20. Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
  21. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678 (2008).
  22. Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
  23. Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
  24. Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit's ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
  25. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
  26. Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  27. Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
  28. Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, 1082 (1959).
  29. Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
  30. Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
  31. Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
  32. Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
  33. Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 73Molek ler BiyolojiBiyomedikal M hendisli immunolojiG z Hastal klarCerrahiKalsiyum Metabolizmas BozukluklarGlukoz Metabolizmas Bozukluklar Diabetes Mellitushiperglisemihiperins linizmHipoglisemiTransplantasyonpankreatik adac klaradac kg z i in kamarag zkorneapenceresi ya ayanIn vivo G r nt lemeba kl k yan tkan lg r nt lemehayvan modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır