Transplantation in die Vorderkammer des Auges für Längs-, Non-invasive<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging mit Single-cell Auflösung in Echtzeit

Zusammenfassung

Ein neuer Ansatz, der intraokularen Transplantation und konfokale Mikroskopie ermöglicht Längs-, non-invasive Bildgebung in Echtzeit mit Single-Cell Auflösung innerhalb gepfropft Geweben In vivo. Wir zeigen, wie Langerhans-Inseln in die vordere Kammer der Maus Auge zu transplantieren.

Zusammenfassung

Intravital Imaging hat ein unverzichtbares Werkzeug in der biologischen Forschung entstanden. Bei dem Verfahren wurden viele bildgebende Verfahren entwickelt worden, um verschiedene biologische Prozesse bei Tieren nicht-invasiv zu studieren. Allerdings ist eine große technische Einschränkung in bestehende intravital bildgebenden Verfahren die Unfähigkeit, nicht-invasive, Längs-Bildgebung mit Single-Cell Auflösungsvermögen kombinieren. Wir zeigen hier, wie die Transplantation in der Vorderkammer des Auges, erhebliche Einschränkung bietet eine vielseitige experimentelle Plattform, die nicht-invasive, Längs-Bildgebung mit zellulärer Auflösung in vivo ermöglicht umgeht. Wir zeigen die Transplantation Verfahren in der Maus und bieten repräsentative Ergebnisse mit Hilfe eines Modells mit klinischer Relevanz, nämlich Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Transplantation. Zusätzlich zur Aktivierung direkten Visualisierung in einer Vielzahl von Geweben in die vordere Kammer des Auges transplantiert, bietet dieser Ansatz eine Plattform, um Gerölln Medikamenten indem Langzeit-Follow up und Überwachung im Zielgewebe. Wegen ihrer Vielseitigkeit, Gewebe / Zell-Transplantation in die vordere Kammer des Auges nicht nur Vorteile Transplantationstherapien, erstreckt sie auf andere in vivo-Anwendungen der physiologischen und pathophysiologischen Prozessen wie Signaltransduktion und Krebs oder Autoimmunerkrankung Entwicklung zu studieren.

Einleitung

Advances in Intravitalmikroskopie haben physiologischen Erscheinungen nicht vorhergesagt durch in vitro Studien ¹ offenbart. Dies unterstreicht die Herausforderung bei der Umsetzung Erkenntnisse durch konventionelle In-vitro-Methoden erhalten in den lebenden Tier. In den letzten zehn Jahren wurde das Sichtbarmachen von Geweben in lebenden Tieren erheblich durch technologische Fortschritte in bildgebenden Verfahren ^{2, 3, 4, 5, 6} verbessert. Dies hat einen Bedarf für in vivo Bildgebung Ansätze mit mögliches Einsatzgebiet in experimentellen Tiermodellen zu longitudinalen Visualisierung von Zielgeweben nichtinvasiv ermöglichen vorangetrieben.

Bildgebende Verfahren wie Kernspintomographie und Positronen-Emissions-Tomographie oder Biolumineszenz haben nicht-invasive Bildgebung von Organen / Geweben tief innerhalb des Körpers ^{7-8, 9} aktiviert. Aber diese Techniken nicht erreichen können einzelne Zelle Auflösung aufgrund hoher Hintergrundsignale und niedriger räumlicher Auflösung, trotz der Verwendung of Hochkontrastmaterialien oder gewebespezifische Lumineszenz ^4. Dies wurde mit dem Aufkommen der Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Konfokalmikroskopie ¹⁰ gerichtet. Zwei-Photonen-Mikroskopie aktiviert intravital Bildgebung zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Ereignissen mit beispielloser Details ^{11, 12.} Dies hat zur Charakterisierung von wichtigen biologischen Prozessen in Gesundheit und Krankheit ^{13, 14, 15, 16} geführt. Während bahnbrechenden intravital bildgebenden Untersuchungen in erster Linie "nachgeahmt" in-vivo-Bedingungen in herausgeschnittene Gewebe (zB Lymphknoten), haben andere Studien invasive Ansätze zur Bild belichtet Zielgewebe verwendet in situ ^{17, 18, ​​19, 20, 21.} Andere Studien haben auch "Fenster Kammer Modelle" Einschränkungen bei invasiven Konzepten und begrenzte Bildauflösung in vivo ^{22, 23, 24, 25} zugeordnet zu umgehen verwendet. In dem Fenster Kammer Modell wird eine Kammer mit einem transparenten Fenster chirurgisch in die Haut an verschie implantiertMiete Standorten (dorsal oder Ohr haut, Brustfettpolster, Leber, etc.) auf das Tier (zB Maus, Ratte, Kaninchen). Während dieser Ansatz ermöglicht eindeutig hochauflösenden in vivo Bildgebung erfordert es eine invasive Chirurgie, um die Kammer zu implantieren und ist möglicherweise nicht in der Lage, longitudinalen Bildgebungsstudien über mehrere Wochen oder Monate ²² unterzubringen.

Es wurde kürzlich gezeigt, dass die Kombination von hoher Auflösung konfokale Mikroskopie mit einem minimal-invasiven Eingriff, nämlich Transplantation in die vordere Kammer des Auges (ACE) eine "natürliche Körper Fenster" als eine leistungsfähige und vielseitige in vivo Bildgebung Plattform ^{26, 27.} Transplantation in das ACE hat sich in den letzten Jahrzehnten eingesetzt, um biologische Aspekte einer Vielzahl von Geweben ^{28, 29, 30} zu studieren, und seine jüngsten Kombination mit hochauflösenden bildgebenden aktiviert das Studium der Physiologie der Langerhans-Inseln mit Einzel-Zell-Auflösung nicht invasiv und längs ^{26, 27. Dieser Ansatz wurde verwendet, um Autoimmunreaktionen bei der Entwicklung von Typ 1 Diabetes im Tiermodell (unveröffentlichte Daten) zu studieren. Es wurde auch verwendet, um Bauchspeicheldrüsenkrebs Entwicklung zu studieren, sowie in Studien der Nierenfunktion durch Transplantation in die ACE Pankreas Knospen oder einzelne Nierenglomeruli bzw. (unveröffentlichte Daten). Ein kürzlich veröffentlichter Bericht über diesen Ansatz weiter demonstriert seine Anwendung auf Immunantwort nach Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Transplantation 31 studieren. Wichtig ist, dass diese Studie zeigte, dass die Transplantation in die vordere Kammer des Auges stellt eine natürliche Körper Fenster ausführen: (1) Längs-, nicht-invasiven Darstellung von transplantierten Geweben in vivo, (2) in vivo cytolabeling um zelluläre Phänotyp und Lebensfähigkeit in beurteilen situ, (3) Echtzeit-Tracking von infiltrierenden Immunzellen in das Zielgewebe, und (4) lokale Intervention durch topische Anwendung oder intraokularen Injektion.}

Hier D Wiremonstrate wie Transplantation in die vordere Kammer des Auges unter Verwendung Pankreasinseln durchzuführen.

Protokoll

Das folgende Verfahren unter dem Stereoskop wird in 2 Schritten durchgeführt wird, beinhaltet der erste Schritt das Laden der Inseln in die Kanüle und der zweite Schritt ist die tatsächliche Transplantation in das ACE. Alle Verfahren an Tieren durchgeführt wurden durch die institutionelle Pflege der Tiere und die Nutzung Ausschuss (IACUC) der University of Miami zugelassen.

Ein. Lädt Islets in Kanüle für Transplantation

1. Center die Inseln in Kulturschale durch Drehen der Schüssel in Verengung Kreisen.
2. Trennen Sie die Kanüle aus dem "Reservoir" und legen Sie die Kanüle und Verbindungsschlauch auf eine saubere Oberfläche. Der Behälter kann aus einem 300 ul Einweg-Kunststoff-Pipettenspitze werden ohne Filter (Abbildung 1a).
3. Bündig Luftblasen aus dem Reservoir zu kontinuierlichen Strom von Inseln sicherzustellen beim Ansaugen in das Reservoir. Spülen des Reservoirs durch Vorantreiben der Freisprech-motorisierten Spritze Treiber mit dem Fußpedal getan(Abbildung 1b, c). Damit wird auch Platz in der Spritze, um eine Aspiration der Inseln in den Vorratsbehälter (mit steriler Lösung wie Kochsalzlösung, PBS oder Kulturmedien vorbelastet) zu ermöglichen.
4. Vorsichtig absaugen gewünschten Menge von Inseln in das Reservoir. Inseln werden zu wirbeln neigen, da sie das Reservoir und geben bleiben gemeinsam auf dem Boden. Aspiration wird durch Rückwärtsfahrt den motorisierten Spritze Treiber mit dem Fußpedal getan.
5. Schließen Sie die Kanüle in den Behälter über den Verbindungsschlauch.
6. Platzieren Sie die Kanülenspitze wieder in der Kulturschale und bündig die Inseln aus dem Reservoir in den Schlauch dann in die Kanüle. Sicherstellen, dass die Inseln zusammen bleiben, wie Sie-back füllen den Schlauch / Kanüle sanft "schnippen" (Tapping) den Schlauch (Abbildung 1d). Stoppen entweder vor oder nach allen Luftblasen vor der Inseln sind die Kanüle gespült. Wenn nicht sicher, stoppen, wie Inseln auf der Rückseite des Kanüle eingeben, wie die restliche LuftBlasen vor der Inseln kann verhindern, Reflux (Rückfluss) von Inseln aus der ACE. Über Nacht zu zerstreuen.
7. In diesem Stadium sind Sie bereit, um die Inseln in der ACE (siehe nächste Schritte) zu injizieren.

2. Inseltransplantation in die Vorderkammer des Auges

1. Positionieren Sie den narkotisierten Maus an einem warmen Pad unter Stereoskop.
2. Legen Sie die Schnauze der Maus in Narkose "Maske" mit Sauerstoff / Isofluran-Narkose Maschine. Die Maske ist aus einer 1 ml Einweg-Kunststoff-Pipettenspitze (ohne Filter) und mit der Narkose Schlauch durch das schmale Ende (Abbildung 2a, b).
3. Vorsichtig einfahren Augenlider des Auges transplantiert mit dem Zeigefinger und Daumen der freien Hand und "Pop" das Auge für eine bessere Belichtung und einfachen Zugang (Abbildung 2c) werden. Dies erfordert einige Übung, um ohne Behinderung Atmung der Maus durch übermäßigen Druck auf die perfekteHalses oder Blockierung des Blutflusses zum Kopf.
4. Verwendung eines wegwerfbaren Insulinspritze (29 - 31G) als Skalpell sorgfältig dringen nur die Spitze in der Hornhaut und einen einzigen seitlichen Schnitt. Machen den Einschnitt in der Mitte zwischen dem Scheitelpunkt der Hornhaut und Limbus zum Rückfluss der Inselchen während der Injektion aus der ACE (Abbildung 2 d) zu minimieren.
5. Schieben Sie die Kanüle (vorinstalliert mit Inseln) durch den Einschnitt.
6. Langsam auszuwerfen Inselchen aus der Kanüle und hinterlegen sie auf der Iris. Um islet Reflux aufgrund übermäßigen Druckaufbau in der ACE zu vermeiden, werfen Sie die Inseln in kurzen Schüben in möglichst wenig Volumen (s) wie möglich in den Quadranten gegenüber dem Einschnitt. Dies kann weiter durch Verdichten Inselchen im Schlauch beim Laden der Kanüle (siehe Schritt 1,6) sichergestellt werden.
7. Langsam einfahren Kanüle aus der ACE. Dies ist ein kritischer Schritt, vor allem, wenn ein großes Volumen von Inseln als Insel Rückfluß durch Druck injiziert wurdedass sich im Inneren des ACE unvermeidlich sein. Zu beseitigen / minimieren Insel Reflux, drehen Sie ihn die Kanüle während im Inneren des ACE Überdruck durch den Einschnitt um die Kanüle freizugeben. Auf Anzeichen von Reflux, wie Sie die Kanüle zurückziehen und, falls erforderlich, bis der Druck nachlässt warten, bevor vollständig Zurückziehen der Kanüle aus dem ACE versuchen.
8. Spülen Sie den transplantierten Auge mit sterilem PBS oder Kochsalzlösung.
9. Injizieren Buprenorphin zur postoperativen Analgesie (0,05 bis 0,1 mg / kg, subkutan) für die ersten 48 Stunden.
10. Bewerben Erythromycin Augenheilkunde antibiotische Salbe auf die transplantierten Auge sofort nach der Transplantation.
11. Legen Sie das Tier wieder in einer vorgewärmten Käfig aus der Narkose ermöglichen.

Ergebnisse

Es gibt ein paar Parameter, die eine "gute" Transplantation zu definieren. Eine gute Transplantation ist eine, die läuft ohne Blutungen bei dem Schnitt wie in dem Video zu sehen. Blutungen verhindert / durch Eindringen nur die Spitze des Skalpells (Nadel) in die ACE (Abb. 3a) minimiert. Dies wird auch dazu beitragen, Kontakt und Punktion der Iris. Es wird auch dafür sorgen, einen kleinen Einschnitt, die sehr gut heilen, ohne dass Trübungen der Hornhaut im Laufe der Zeit (Abbildung 3...

Diskussion

Murine Pankreasinseln wurden isoliert unter Verwendung Kollagenaseverdau durch Reinigung auf Dichtegradienten gefolgt, wie zuvor beschrieben ^33. Isolierten Inseln wurden über Nacht vor der Transplantation gezüchtet. Obwohl dies nicht erforderlich sein kann, wird empfohlen, damit die Inseln aus dem Isolierungsverfahren erholen. Dies ist entscheidend, wenn die Transplantation in diabetischen Empfängern durchgeführt wird, wie es der Transplantation zu überleben / robust Inseln gewährleistet.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Namen Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Beschreibung / Kommentare
IsoTHESIA (Isofluran)	Buttler Animal Health Versorgung	11695-6775-2	99,9% Isofluran / ml
Ketaset (Ketamin HCL)	Fort Dodge Animal Health	0856-2013-01	Alternative injizierbaren Anästhesie
Beprenex (Buprenorphin HCL)	Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd	12496-075-7-1	0,3 mg / ml
Erythromycin Augensalbe USP, 0,5%	Akron	17478-070-35	Prophylaktisch an transplantierten Auge angewendet
0,9% Natriumchlorid (Saline)	Hospira Inc.	0409-7983-03	Für iv Injektion. Steril
PBS	Gibco	10010-023	1X. Steril
CMRL Medium 1066	Cellgro	98-304-CV	Ergänzt, CIT Modifikation. Bevorzugte Medien für Inselchen