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요약

안구 이식 및 공 촛점 현미경을 결합 새로운 접근 방식은 이식 조직 내에서 단일 셀 해상도 세로, 비 침습적 실시간 이미징을 가능하게 생체 내. 우리는 마우스 눈의 앞쪽 챔버에 췌장 섬을 이식하는 방법을 보여줍니다.

초록

Intravital 영상은 생물학적 연구에 필수적인 도구로 떠오르고있다. 이 과정에서 많은 이미징 기술이 아닌 invasively 동물에서 다른 생물학적 과정을 연구하기 위해 개발되었습니다. 그러나, 기존의 intravital 이미징 modalities의 주요 기술적 인 제한은 단일 셀 해상도 기능으로 비 침습적, 길이 방향의 영상을 결합 할 수 없다는 것입니다. 우리는 눈 앞 챔버 내로 이식은 생체 내 세포 해상도 비 침습적, 세로 이미지 수있는 다양한 실험 플랫폼을 제공하는 등 상당한 제한을 circumvents 방법을 여기에 표시됩니다. 우리는 마우스에 이식 절차를 설명하고, 즉 임상 관련성, 췌장 췌장 이식과 모델을 사용 대표적인 결과를 제공합니다. 눈의 앞쪽 챔버 내로 이식 조직의 다양한 직접 시각화를 지원하는 것 외에도,이 방법은 애추 할 수있는 플랫폼을 제공합니다수행하여 N 약물의 장기 후속 및 대상 조직의 모니터링. 때문에 눈 혜택 이식 요법뿐만 아니라 앞쪽에 챔버로의 다양성, 조직 / 세포 이식의, 이건 정말 신호 전달과 암이나 면역 질환 개발과 같은 생리와 pathophysiological 과정을 공부하고 생체 응용 프로그램에서 다른 확장합니다.

서문

intravital 현미경의 발전은 체외 연구 1에 의해 예측하지 생리 현상을 보여 왔습니다. 이것은 살아있는 동물로 체외 방법에 기존하여 얻은 결과를 번역에 도전을 강조 표시합니다. 지난 10 년 간, 생활 동물 조직의 시각화는 상당히 이미징 modalities 2, 3, 4, 5, 6에 기술 진보에 의해 개선되었다. 이 비 invasively 대상 조직의 길이 방향 시각화를 사용하는 실험 동물 모델에서 가능한 응용 프로그램과 생체 이미징 접근에 대한 필요성을 가했다 있습니다.

이러한 자기 공명 영상 및 양전자 방출 단층 촬영이나 bioluminescence와 같은 이미징 기술은 신체 7-8, 9에서 깊은 장기 / 조직의 비 침습적 영상을 사용했습니다. 그러나 이러한 기술을 사용 O에도 불구하고, 높은 배경 신호와 낮은 공간 해상도로 인해 휴대 해상도 하나를 달성 할 수 없습니다F 고 대비 자료 나 조직 별 발광을 4. 이것은 두 광자 형광 공 촛점 현미경 (10)의 도래와 함께 해결되었습니다. 두 광자 현미경은 intravital 이미징 연구 시각화하고 전례가없는 세부 사항 11, 12로 휴대 이벤트를 정할 수있었습니다. 이 건강과 질병 13, 14, 15, 16의 주요 생물학적 과정의 특성을 이끌었습니다. 선구 intravital 이미징 연구가 주로 excised 조직 (예 : 림프절)의 생체 조건에서 "없잖아?"동안, 다른 연구는 시츄 17, 18, ​​19, 20, 21 이미지 노출 대상 조직에 침투 방법을 사용했습니다. 다른 연구는 또한 침습적 방법과 생체 22, 23, 24, 25 제한된 영상 해상도와 관련된 제한을 회피하기 위해 '창 챔버 모델 "을 사용했습니다. 창 챔버 모델에서 투명 창 챔버는 수술 diffe의 피부에 이식되어동물의 임대 위치 (등쪽이나 귀 피부, 유방 지방 패드, 간, 등) (예 : 마우스, 쥐, 토끼). 이 방법이 명확하게 생체 이미징에 높은 해상도를 수 있지만, 챔버 이식 해 침습적 수술을 필요하며 몇 주 또는 몇 달 22여 종 방향 이미징 연구를 수용 할 수없는 경우가 있습니다.

그것은 최근 눈의 앞쪽 챔버에, 즉 최소한 침략 절차, 이식과 고해상도 공 촛점 현미경을 결합하는 (ACE)로 "자연 몸 창"을 제공하는 입증 된 강력하고 생체 이미징 플랫폼 26, 27의 다양한. ACE에 이식이 조직 28, 29, 30의 다양한 생물학적 측면을 연구하기 위해 지난 몇 수십 년 동안 사용되었습니다, 그리고 고해상도 영상과의 최근 조합은 단일 셀 해상도로 췌장 섬의 생리를 공부 활성화 비 invasively 및 길이 방향 <> 26, 27 논의하게 될 것입니다. 이 방법은 동물 모델에서 제 1 형 당뇨병 (게시되지 않은 데이터)의 개발 기간 동안 면역 반응을 연구하는 데 사용되었습니다. 또한 각각 ACE의 췌장 꽃 봉오리 또는 개별 신장 glomeruli, (게시되지 않은 데이터)에 이식하여 신장 기능의 연구에서, 췌장 개발을 공부뿐만 아니라하는 데 사용되었습니다. 이 방법을 사용하는 최근의 보고서는 더 췌장 췌장 이식 31 일 이후 면역 반응을 연구하기위한 응용 프로그램을 보여 주었다. 중요한 것은,이 연구는 수행 할 천연 바디 창 제공하는 눈의 앞쪽 챔버에 그 이식을 보여 주었다 : 생체에 이식 된 조직 (1) 길이, 비 침습적 영상을, (2) 생체에서의 세포 표현형 및 생존 능력을 평가하기 위해 cytolabeling 현장, 대상 조직에 면역 세포에 침투 (3) 실시간으로 추적하고, 국소 응용 프로그램 또는 안구 내 주사로 (4) 지역 개입했습니다.

여기, 우리는 D췌장 섬을 사용하여 눈의 앞쪽 챔버 내로 이식을 수행하는 방법을 emonstrate.

프로토콜

다음 절차는 2 단계로 입체경에서 수행되며, 첫 번째 단계는 캐뉼라로 섬을로드 포함하고 두 번째 단계는 ACE에 실제 이식입니다. 동물에서 수행 모든 절차는 마이애미 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 이식을위한 정맥의로드 섬

  1. 축소 서클 요리를 회전하여 센터 배양 접시에있는 섬입니다.
  2. "저수지"에서 캐뉼라를 분리하고 깨끗한 표면에 캐뉼라와 연결 튜브를 놓습니다. 저장소는 필터 (그림 1a)없이 300 μl 일회용 플라스틱 피펫 팁으로 만든 할 수 있습니다.
  3. 저수지에 aspirating 때 섬의 지속적인 흐름을 보장하기 위해 저수지에서 기포를 제거. 저수지를 플러싱하는 것은 발 페달을 사용하여 핸즈프리 동력 주사기 - 드라이버를 앞으로 운전하면됩니다(그림 1b, C). 이것은 또한 저수지 (예 : 생리, PBS 또는 문화 미디어로 살균 솔루션으로 사전로드)로 섬의 열망을 허용하도록 주사기에 공간을 할 것입니다.
  4. 부드럽게 저수지에 섬의 원하는 금액을 대기음. 사람들이 저수지를 입력하고 하단을 향해 함께 남아있게됩니다 섬은 소용돌이 경향이 있습니다. 흡인이 발 페달을 사용하여 이전 버전과 동력 주사기 - 드라이버를 구동하여 이루어집니다.
  5. 연결 튜브를 통해 저수지에 캐뉼라를 다시 연결하십시오.
  6. 배양 접시에 다시 캐뉼라 팁을 놓고 캐뉼라로 다음 튜브에 저수지의 섬을 플러시. 당신은 부드럽게 (도청) 튜브 (그림 1D) "을 flicking"에 의해 튜브 / 캐뉼라를 백업 채울 때 섬이 함께 남아 있는지 확인합니다. 캐뉼라를 밖으로 내보냈 아르 앞서 섬의 모든 기포 전이나 후에 중지합니다. 확실하지 않은 경우, 섬이 남아 공기로 캐뉼라의 뒷면을 입력으로 중지앞서 섬의 거품은 ACE의 섬의 역류 (역류)을 방지 할 수 있습니다. 밤새 분산됩니다.
  7. 이 단계에서, 당신은 ACE (다음 단계 참조)에 섬을 삽입 할 수 있습니다.

2. 눈의 앞쪽 상공 회의소에 작은 섬 이식

  1. 입체경 아래 따뜻한 패드에 anesthetized 마우스를 배치합니다.
  2. 산소 / isoflurane 마취 기계에 연결 마취 "마스크"에 마우스의 코를 놓습니다. 마스크 1 ML 일회용 플라스틱 피펫 팁 (필터없이)으로 만든과 좁은 끝 (그림 2A, B)를 통해 마취 튜브에 연결되어 있습니다.
  3. 부드럽게 손가락과 엄지 손가락 무료 손과 "팝업"더 나은 노출과 접근이 용이합니다 (그림 2C)를 밖으로 눈을 사용하여 이식 할 눈의 눈 뚜껑을 철회. 이에 과도한 압력에 의해 마우스의 호흡을 방해하지 않고 완벽하게 연습을 필요로합니다목이나 머리에 혈액 흐름을 차단.
  4. 일회용 인슐린 주사기 (29 - 31G)를 사용 메스로 신중하게 각막 만 끝을 관통하고 하나의 측면 절개를합니다. ACE (그림 2D)의 아웃 분사 동안 섬의 환류을 최소화하기 위해 각막과 limbus의 꼭대기 사이의 중간 지점에 절개를합니다.
  5. 조심스럽게 절개를 통해 캐뉼라 (섬과 미리로드) 삽입합니다.
  6. 천천히 캐뉼라의 섬을 추출하고 홍채의 상단에이를 입금. ACE에 과도한 압력 축적으로 인해 작은 섬 역류를 방지하려면 절개로 사분면의 맞은 편에 가능한 한 작은 볼륨 (들)로 한때 thrusts에있는 섬을 꺼냅니다. 이것은 더 캐뉼라 (단계 1.6 참조)로드하는 동안 튜브에 섬을 압축하여 보장 할 수 있습니다.
  7. 천천히 ACE의 캐뉼라를 철회. 섬의 큰 볼륨 시장을 대표로 인해 작은 섬 환류로 주입 된 경우, 특히 중요한 단계입니다확인 ACE 내부에 구축 피할 수 있습니다. 캐뉼라 주위의 절개를 통해 과도한 압력을 출시 할 ACE 내부하면서 작은 섬 역류를 최소화 / 제거하려면 부드럽게 캐뉼라를 회전 할 수 있습니다. 당신이 캐뉼라를 철회하고, 필요한 경우, ACE의 완전히 retracting하기 전에 압력이 가라까지 캐뉼라를 기다려야 시도로 환류의 흔적이 있는지 확인합니다.
  8. 멸균 PBS 또는 식염수에 이식 눈을 씻어.
  9. 처음 48 시간에 대한 수술 진통제 (피하 0.05-0.1 밀리그램 / kg)에 buprenorphine를 삽입.
  10. 바로 이식 후 이식 눈에 에리스로 마이신의 안과 항생제 연고를 적용 할 수 있습니다.
  11. 마취에서 회복을 허용 할 수있는 가온 케이지에 다시 동물을 놓으십시오.

결과

"좋은"이식을 정의하는 몇 가지 매개 변수가 있습니다. 좋은 이식은 비디오에서 볼 수 있듯이 절개 할 때 출혈이없이 진행이 하나입니다. 출혈은 ACE (그림 3A)에 메스 (바늘) 만 팁을 관통하여 예방 / 최소화합니다. 이 또한 홍채의 접촉과 주사를 방지하는 데 도움이됩니다. 또한 시간 (그림 3C, D)을 통해 각막의 변화를 유발하지 않고 잘 치유 될 소형 절개를 보장합니...

토론

손쥐 췌장 섬은 이전에 33 설명한 바와 같이, 밀도 기울기에 정화에 이어 collagenase의 소화를 사용하여 분리 하였다. 절연 섬은 이식 전에 하룻밤 배양 하였다. 이것이 필요하지 않을 수도 있지만,이 섬은 격리 절차에서 복구 할 수 있도록하는 것이 좋습니다. 가 / 강력한 섬을 생존의 이식을 보장하므로이 이식이 당뇨병 수신자에 수행 할 때 중요합니다.

이식은 산소 / i...

공개

PO.B. 상용 서비스 플랫폼으로 눈의 앞쪽 챔버를 사용하는 것이다 생명 공학 회사 Biocrine의 창립자 중 하나입니다. AC는이 기술을 보호 특허에 있습니다.

감사의 말

우리는 Drs을 인정합니다. Camillo Ricordi, Antonello Pileggi, R. Damaris Molano, 스테판 Speier 유익한 토론 다니엘 Nyqvist. 우리는 또한 비디오 녹화와 관련하여 도움이 Eleut 헤르 난 데스와 디에고 에스피노사 - Heidmann 기술 지원 및 마이크 발데스와 마가렛 Formoso 감사드립니다. 바이런 말도 나도는 편집 기록, 최종 비디오를 제작했다. 연구 지원은 당뇨병 연구소 재단 (에서 제공 한 www.DiabetesResearch.org ), NIH / NIDDK / NIAID (MHA에 F32DK083226, AC에 대한 NIH RO3DK075487, PO.B.에 U01DK089538). PO.B에 대한 추가 연구 지원은 Karolinska Institutet, 스웨덴 연구위원회, 스웨덴 당뇨병 재단, 가족 Erling - 페르손 재단, 가족 Knut와 앨리스 발렌 버그 재단, 활기찬 Skandia 보험 회사 (주)에서 자금을 통해 제공되었다 ( Karolinska Inst에서 당뇨병의 FP7 - 228933-2), 전략적 연구 프로그램itutet, 노보 Nordisk 재단, 그리고 부두 폰 Kantzow의 재단.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 설명 / 의견
IsoTHESIA (Isoflurane) Buttler 동물 건강 공급 11695-6775-2 99.9 % Isoflurane / ML
Ketaset (케타민 HCL) 요새 닷지 동물 건강 0856-2013-01 대체 injectable 마취
Beprenex (Buprenorphine HCL) Reckitt Benckiser 건강 (UK) (주) 12496-075-7-1 0.3 MG / ML
에리스로 마이신의 안과 연고의 USP, 0.5 % 애 크런 17478-070-35 이식 눈에 prophylactically 적용
0.9 %의 나트륨 염화물 (식염) Hospira 주식회사 0409-7983-03 IV 주입하십시오. 불모의
PBS Gibco 10010-023 1X. 불모의
CMRL 중간 1066 Cellgro 98-304 - CV 보충, CIT의 수정. 섬에 대한 선호하는 미디어

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