Трансплантация в переднюю камеру глаза для продольной, неинвазивные<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Формирование изображений с помощью одной ячейке Разрешение в режиме реального времени

Резюме

Новый подход, сочетающий внутриглазного трансплантации и конфокальной микроскопии позволяет продольные, неинвазивные изображений в реальном времени с одноклеточными резолюции в привиты тканей В естественных условиях. Мы показываем, как пересадить панкреатических островков в переднюю камеру глаза мышей.

Аннотация

Прижизненные изображения стала незаменимым инструментом в биологических исследованиях. В этом процессе много методов визуализации были разработаны для изучения различных биологических процессов у животных неинвазивно. Тем не менее, основные технические ограничения в существующих прижизненных методов визуализации является неспособность объединить неинвазивным, продольное изображение с одноклеточными возможности разрешения. Мы покажем здесь, как трансплантации в переднюю камеру глаза обходит такие значительные ограничения предлагая универсальные экспериментальной площадкой, которая позволяет неинвазивным, продольное изображение с сотового резолюцию в естественных условиях. Мы продемонстрируем процедуры трансплантации у мышей и предоставить представителю результатов, используя модель с клинической значимости, а именно поджелудочной железы трансплантации. Кроме того, включение прямой визуализации в различных тканях пересаживают в переднюю камеру глаза, этот подход обеспечивает платформу для осыпьп наркотиков, выполняя длительного наблюдения и мониторинга в тканях-мишенях. Благодаря своей универсальности, ткани / клеточной трансплантации в переднюю камеру глаза не только преимущества терапии трансплантации, он распространяется и на другие приложения в естественных условиях для изучения физиологических и патофизиологических процессов, таких как сигнальные и рак или аутоиммунные развития заболевания.

Введение

Достижения в области прижизненной микроскопии выявили физиологические явления не предсказывается в лабораторных исследованиях ^1. Это указывает на проблемы в переводе данные, полученные обычными методами в пробирке в живых животных. В последнее десятилетие, визуализации тканей в живых животных была значительно улучшена благодаря техническим достижениям в области обработки изображений условий ^{2, 3, 4, 5, 6.} Это стимулировало необходимость в естественных изображений подходов с возможным применение в экспериментальных моделях на животных для включения продольной визуализации тканей-мишеней неинвазивно.

Методы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография и позитронно-эмиссионной томографии или биолюминесценции позволили неинвазивной визуализации органов / тканей глубоко внутри тела ^{7-8, 9.} Но эти методы не могут достичь одной ячейки разрешение из-за высокой сигналов фона и низкого пространственного разрешения, несмотря на использование OF материалов высокого контраста или тканеспецифические ⁴ люминесценции. Это был адресован с появлением двух фотонов флуоресценции конфокальной микроскопии ^10. Двухфотонной микроскопии включен прижизненный исследования изображений для визуализации и количественной оценки клеточных событий, с беспрецедентной детали ^{11, 12.} Это привело к характеристике ключевых биологических процессов в норме и патологии ^{13, 14, 15, 16.} В то время как новаторские исследования прижизненного изображения были в первую очередь "имитировал" в естественных условиях в вырезают ткани (например, лимфатические узлы), другие исследования использовались инвазивные подходы к изображению подвергаются ткани-мишени на месте ^{17, 18, ​​19, 20, 21.} Другие исследования также использовали «окно камеры модели", чтобы обойти ограничения, связанные с инвазивными подходы и ограниченное разрешение изображения в ^{22 естественных, 23, 24, 25.} В модели окна камеры, камеры с прозрачным окном хирургически имплантированные под кожу на разАренда мест (со спины или уха кожи, молочной жировой ткани, печени и т.д.) на животных (например, мышей, крыс, кроликов). Хотя такой подход позволяет четко высокое разрешение изображения в естественных условиях, он требует инвазивного операцию по вживлению камеры и, возможно, не в состоянии вместить продольного исследования изображений в течение нескольких недель или месяцев, ^22.

Недавно было показано, что сочетание высокого разрешения конфокальной микроскопии с минимально инвазивная процедура, а именно трансплантации в переднюю камеру глаза (ACE) обеспечивает «естественный окном тела», как мощный и универсальный в естественных изображений платформе ^{26, 27.} Трансплантация в ACE была использована в последние несколько десятилетий для изучения биологических аспектов из различных тканей ^{28, 29, 30,} и его последние комбинации с высоким разрешением включено изучение физиологии панкреатических островков с одной ячейке разрешение не- Инвазивно и продольно ^{26, 27. Такой подход был использован для изучения аутоиммунных реакций при развитии сахарного диабета 1 типа на животных моделях (неопубликованные данные). Она также используется для изучения развития поджелудочной железы, а также в исследованиях функции почек путем пересадки поджелудочной железы в ACE почки или отдельных почечных клубочков, соответственно (неопубликованные данные). В недавнем докладе использовании этого подхода продемонстрировал дальнейшее его применение для изучения иммунного ответа после трансплантации островков поджелудочной железы 31. Важно отметить, что данное исследование показало, что трансплантация в переднюю камеру глаза обеспечивает естественный окно орган для выполнения: (1) продольный, неинвазивная визуализация пересаженных тканей в естественных условиях; (2) в естественных условиях cytolabeling оценить клеточный фенотип и жизнеспособность в месте; (3) реального времени отслеживать проникновение иммунных клеток в ткани-мишени, и (4) местное вмешательство местного применения или внутриглазных инъекций.}

Здесь мы Demonstrate, как выполнять трансплантации в переднюю камеру глаза с помощью панкреатических островков.

протокол

Следующая процедура проводится под стереоскоп в 2 этапа, первый этап предполагает загрузку островков в канюлю и вторым шагом является фактическим трансплантации в ACE. Все процедуры, проводимые на животных были утверждены институциональных и использования животных комитета (IACUC) из Университета Майами.

1. Загрузка островков в Канюля для трансплантации

1. Центр островков в культуре блюдо, крутя блюдо в сужении круга.
2. Отключите канюлю из «резервуара» и разместить канюли и соединительной трубки на чистую поверхность. Резервуар может быть изготовлена ​​из 300 мкл одноразовые пластиковые кончика пипетки без фильтра (рис. 1а).
3. Флеш пузырьков воздуха из резервуара для обеспечения непрерывного потока островками, когда аспирационных в резервуар. Промывка резервуара осуществляется путем движения вперед громкой моторизованных шприц-драйвер с помощью ножной педали(Рис. 1, b, с). Это также позволит освободить место в шприц, чтобы стремление островков в водохранилище (предварительно загружены стерильный раствор, такие как физиологический раствор, PBS или культуру средств массовой информации).
4. Аккуратно аспирации необходимое количество островков в водохранилище. Островки будет иметь тенденцию к вихрем, как они попадают в водохранилища и останется вместе ко дну. Стремление делается при движении назад моторизованных шприц-драйвер с помощью ножной педали.
5. Снова канюлю в резервуар через соединительный трубопровод.
6. Поместите кончик канюли обратно в культуре блюдо и промойте островки из резервуара в трубопровод, то в канюлю. Убедитесь, что островки остаются вместе, как Вам заполнить трубу / канюлю, аккуратно "стряхивая" (касание) трубки (рис. 1г). Остановить либо до, либо после все пузырьки воздуха перед островки вымываются канюли. Если вы не уверены, остановиться, как островки войти в задней части канюли, как остальные воздухапузырьки перед островков может помочь предотвратить рефлюкс (обратный) островки из ACE. Исчезнет в одночасье.
7. На данном этапе, вы готовы, чтобы ввести островков в ACE (пожалуйста, см. следующие шаги).

2. Островок трансплантации в переднюю камеру глаза

1. Установите наркозом мыши на теплую подкладку под стереоскоп.
2. Поместите морду мыши в анестезии "маски", связанные с кислородом / изофлурана машина анестезии. Маска сделана из 1 мл одноразовые пластиковые пипетки (без фильтра) и подключен к анестезии трубы через узкий конец (рис. 2а, б).
3. Аккуратно уберите веки глазной для пересадки помощью указательный палец и большой палец свободной руки и "поп" глаз за лучшую экспозицию и легкого доступа (рис. 2). Это потребует некоторой практики, чтобы совершенствоваться, не препятствуя дыханию мыши чрезмерного давления нашее или блокирование притока крови к голове.
4. Использование одноразовых шприцев инсулина (29 - 31G) как скальпель, тщательно проникают лишь верхушка в роговице и сделать один боковой разрез. Сделайте надрез в середине между вершиной роговицы и лимба, чтобы минимизировать рефлюкс островков во время инъекции из ACE (Рис. 2d).
5. Осторожно вставьте канюлю (с предустановленными островков) через разрез.
6. Медленно извлечь островки из канюли и сдать их на верхнюю часть диафрагмы. Чтобы избежать островок рефлюкс из-за чрезмерного наращивания давления в ACE, извлечь островков в краткой направлений в качестве небольшого объема (ы) как можно в квадранте противоположным разрез. Это может быть обеспечено дальнейшее уплотнение островков в НКТ при загрузке канюли (пожалуйста, см. п. 1.6).
7. Медленно отвести канюлю из ACE. Это очень важный шаг, особенно, если большой объем островков был введен как островок рефлюкса из-за давленияУбедитесь скапливаться внутри ACE может быть неизбежным. Чтобы исключить / минимизировать островок рефлюкс, аккуратно поверните канюлю в то время как внутри ACE выпустить избыточное давление через разрез вокруг канюли. Убедитесь в отсутствии признаков рефлюкс, как вы пытаетесь втянуть канюли и, при необходимости, подождите, пока давление стихает до полного втягивания канюлю из ACE.
8. Промыть глаза с пересаженным стерильной PBS или физиологического раствора.
9. Inject бупренорфина для послеоперационного обезболивания (0.05-0.1 мг / кг, подкожно) в течение первых 48 часов.
10. Применяют эритромицин глазной мазь с антибиотиком, чтобы пересаженный глаз сразу после трансплантации.
11. Поместите животное обратно в клетку нагретой, чтобы восстановление после наркоза.

Результаты

Есть несколько параметров, которые определяют "хорошее" трансплантации. Хороший трансплантации является тот, который протекает без кровотечения при принятии разрез, как видно на видео. Кровотечение не имеет возможности / сведено к минимуму, проникая лишь верхушка скальпель (иглы)...

Обсуждение

Мышиные панкреатических островков были выделены с использованием коллагеназы пищеварения с последующей очисткой на градиентов плотности, как описано выше ^33. Изолированные островки культивировали в течение ночи перед трансплантацией. Хотя это может быть не обязательно, но реко...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Описание / Комментарии
IsoTHESIA (Isoflurane)	Бутлер Animal Health питания	11695-6775-2	99,9% Isoflurane / мл
Ketaset (кетамин HCL)	Fort Dodge Animal Health	0856-2013-01	Альтернативные инъекционный наркоз
Beprenex (бупренорфин HCL)	Reckitt Benckiser здравоохранения (UK) Ltd	12496-075-7-1	0,3 мг / мл
Эритромицин глазной мази USP, 0,5%	Akron	17478-070-35	Прикладная профилактически, чтобы пересаженный глаз
0,9% хлорида натрия (физиологический раствор)	Hospira Инк	0409-7983-03	Для внутривенной инъекции. Стерильный
PBS	Gibco	10010-023	1X. Стерильный
CMRL среднего 1066	Cellgro	98-304-CV	Дополнен, CIT модификации. Популярные средства массовой информации для островков