Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Özet

Birçok terapötik uygulama vücutta hücresel engelleri arasında ilaç taşıyıcıları ve yük güvenli ve etkin taşıma gerektirir. Bu makalede, gastrointestinal (GI) epitel olarak hücresel engelleri genelinde uyuşturucu nanocarriers (NCS), taşıma hızını ve mekanizmasını değerlendirmek amacıyla kurulmuş yöntemlerden bir adaptasyon açıklar.

Özet

Alt-mikrometre taşıyıcılar (nanocarriers; NC'ler) çözünürlük, istikrar, dolaşım süresi, hedefleme ve salınımını artırarak ilaçların etkinliğini arttırmak. Buna ek olarak, vücuttaki hücre engelleri geçme müdahale gereklidir dokular içine kan dolaşımı ve taşıma içine terapötik NC'ler hem ağız yoluyla verilmesi için çok önemlidir. Komşu hücreler ya da (ii) hücre üzerinden hücre gövdesi üzerinde taşınan malzeme endositoz tarafından içselleştirilir yol, ve salgılanan içiçe birleşme geçici bozulma ile, (i) paraselüler rotası: hücresel engelleri arasında NC taşıma ile elde edilmektedir ters hücre yüzeyinde (transyctosis) at. Hücresel engelleri arasında Gönderme taşıma katılan hücre yüzeyi işaretleri için spesifik olarak bağlanan hedefleyen maddeler ile terapötik ya da taşıyıcıların birleştirilmesi suretiyle kolaylaştırılabilir. Burada, WHI bir model hücre bariyerinden ölçüde ve NC taşıma mekanizması, ölçmek için bir yöntem sağlarch bir Transwell uç bulunan bir gözenekli zar üzerinde yetiştirilen gastrointestinal bir tek tabaka (GI) epitel hücreleri oluşur. Bir geçirgenlik bariyeri oluşumu transepitelyal elektriksel direnci (TEER), bir kontrol maddenin transepitelyal taşıma ve sıkı birleşme bölgesinin immün ölçümü ile teyit edilir. Bir örnek olarak, ~ 200 nm polimer NC'ler terapötik bir yük taşıyan ve bir hücre yüzeyi hedef belirleyici bir antikor ile kaplanmış olan, kullanılmıştır. Antikor ya da terapötik yük radyoizotop izleme için ¹²⁵ I ile etiketlenir ve etiketlenmiş NC'ler değişen zaman dönemleri için hücre tek tabaka üzerinde, üst bölmeye eklenir. Temel bölmeye taşınan hücreler ve / veya ilişkili NC'ler tespit edilebilir. Ücretsiz ¹²⁵ I ölçümü bozulmuş fraksiyonu çıkarma sağlar. Paraselüler yol, yukarıda tarif edilen bariyer parametrelere NC taşıma ile neden olduğu potansiyel değişiklikleri saptanmasıyla değerlendirilir. Transsellüler taşıma iendositoz ve yolunu modüle transsitoz etkisini ele belirlenir s.

Giriş

Dış çevre ve iç bölmeleri arasında bir ağ geçidi olarak vücut eyleminde hücresel engelleri. Bu durum, gastrointestinal (GI) sistemi ve kan ^1-3 maruz kalan harici bir yüzey ayırma epitel astar için de geçerlidir. Hücresel bariyerleri de kan ve parankimi ve doku ve organların hücresel bileşenleri arasındaki arayüz temsil eder. Vücutta bu hücresel engelleri hareket yeteneği terapötik ve teşhis maddeleri etkili biçimde aktarılması için çok önemlidir ¹ Bu, vb kan-akciğer engeli, kan-beyin engeli, kan damarları, endotel iç astar için geçerlidir müdahale gerekli dolaşımı ve dokuların / organların içine.

Tedavi edici veya teşhis edici maddelerin geliştirilmesi için, bu bileşikler, alt mikrometre nanocarriers (NCS) yüklenebilir. Bu ilaç dağıtım araçları, çeşitli ile formüle edilebilirkimyaları ve ilacın çözünürlüğünü koruma, farmakokinetik, serbest ve metabolizma ^4,5 optimize yapıları. NC'ler, terapötik etki için gerekli ^{olan, 2,6} vücut bölgelerine yapışmasını kolaylaştırmak için afinite ya da (örn. antikorlar, peptidler, şekerler, aptamerler) hedefleme parçaları ile fonksiyonalize edilebilir. Hücresel engellerin yüzeyinde ifade belirleyicilere NC'ler hedeflenmesi daha fazla ^2,6 içine ve / veya bu astarları arasında taşınmasını kolaylaştırır.

Seçici iki ortam arasında madde taşınması rolü hücre katmanları arasında bazı benzersiz özellikleri gerektirir. Boşlukların lümeni bakan apikal zar zar morfoloji ve lipid, taşıyıcılar ve reseptörler ² bileşimi ile ilgili olarak, doku interstisyumunda yönelik bazolateral zardan değişir ve böylece Böyle bir özellik, hücre kutupludur. Diğer bir özelliği içerir arası junctiokomşu hücreyi birleştiren ns. Sıkı birleşim, özellikle kavşak yapışma molekülleri (Sıkışması), occludins ve klaudin oluşturan proteinlerin düzenlenmesi konusunda bu lumeninden maddelerin geçişine izin veren, seçici paraselüler taşıma olarak bilinen hücrelerin arasında maddelerin taşınmasına olanak veya olmasın bariyer fonksiyonunu modüle basolateral alan ^3. Vücutta hücresel bariyerleri için birçok doğal ve sentetik elemanları (lökositler, moleküller, parçacıklar ve ilaç verme sistemleri gibi) bağlanma, bu nedenle, bir erişim güvenli olmayan geçici ve nispeten zararsız ya da daha uzun olabilir ve bu, hücre-bağlantı açıklığı uyarabilir ^2,5,7-9 bariyer üzerinde arzu edilmeyen maddeler. Sonuç olarak, bu geçiş yolu, transepitelyal elektrik direnci (TEER) ve moleküllerin pasif difüzyon paraselüler (burada adı paraselüler kaçak) ölçülmesiyle değerlendirilebilir, bu sayede, bir elektrik akımı ya da bir ine artan paraselüler sızıntıya direnci azalmışbazolateral boşluğa rt bileşiği, hücre birleşme açılmasını gösterir sırasıyla ^5,10,11. Boyama tüm hücre kenarına ^5,10,12 çevresinde hücre-hücre sınırlarının altında konsantre gözükmelidir.Onu burada bu yöntemler tamamlamak üzere, yukarıda listelenen sıkı birleşme proteinlerinin herhangi bütünlüklerini değerlendirmek için boyanmış olabilir.

Alternatif olarak, klatrin kaplı çekirdeklerin veya caveolae olarak adlandırılan bir şişe-şekilli zar invajinasyonları, ilişkili olanlar gibi, spesifik hücre yüzeyi belirleyici, hedef ilaç dağıtım ^sistemleri, hücre içi bölmelerin ^5'e ilaç verilmesi için bir yol sağlayarak, endositoz ile hücre içine alınmasını veziküler tetikleyebilir ^13. Buna ek olarak, endositoz bazolateral tarafında serbest, transyctosis olarak bilinen bir olgu ya da hücre üzerinden taşıma için ¹⁴ hücre gövdesi boyunca veziküllerin ticareti yol açabilir. Bu nedenle, endositoz kinetiği ve mekanizmasının bilgisi hücre içi a yararlanmak için kullanılabilmektedirnd paraselüler rotaya göre teslimat nispeten güvenli ve kontrollü bir mod sunuyor transsellüler ilaç dağıtım,. Endositoz mekanizması, klasik yolları (klatrin ve caveolin aracılı endositoz ve makropinositoz) ya da klasik olmayan yollarının modülatörleri ile değerlendirilebilmektedir (örneğin, hücre yapışma molekülü durumunda olduğu gibi (CAM) aracılı endositoz) ^5,13,15 .

Hücre içi ticaretinin genellikle standart kuyulara veya lamelleri okudu Oysa, bir Bazolateral bölmesinin olmaması hücre kutuplaşmayı ve hücre katmanları arasında ulaşım çalışma yeteneğini engellemektedir. Bu engeli aşmak için, hücre tekli katmanları üzerinde taşıma uzun transwell bir üst (apikal) odası, hücreler takmak ve sıkı bir tek tabaka oluşturan bir gözenekli geçirgen zar oluşur ki, ^10,11,16,17 ekler, ve bir alt kullanılarak incelenmiştir (Bazolateral) odası (Şekil 1). Bu yapılandırmada, taşıma ölçülebilirapikal-to-bazolateral, üst bölmesine bir tedavi uygulanmasını hücre mono tabakasında ve altta yatan gözenekli zar içinden taşınmasını takiben, ve son olarak taşınan malzeme miktarının belirlenmesi için, alt bölmede ise orta toplayarak yönü. Bazolateral-apikal yönünde Transport aynı zamanda, üst bölme ^5,10,12,16 ikinci alt bölme ve daha sonra toplama ilk uygulanması ile ölçülebilir. Çeşitli teknikler yukarıda tarif edildiği gibi, TEER ve paraselüler taşıma deneyleri de dahil olmak üzere transwells ilgili geçirgenlik bariyeri oluşumunu doğrulamak için vardır. Buna ek olarak, hücreler kültürlenir üzerinde geçirgen filtre (floresan konfokal, elektron mikroskopi ile) görüntüleme analizi için kaldırılabilir ayrıca, hücre tek tabaka modeli doğrulama hem de taşıma mekanizması olarak. Farklı gözenek boyut, malzeme ve yüzey alanları mevcuttur membran türü, seçimi, çeşitli fiili bağlıdırBu tür maddelerin bir boyut veya taşınan nesneler, hücre tipi ve görüntüleme yöntemi ^16,18-20 olarak rs. Transwell uçlar da bölmeler ve hücre yüzey alanı hacim sabitleri bilinmektedir kompleks bir memeli sistemleri ile karşılaştırıldığında taşıma kontrollü ve hassas ölçümü kolaylaştırır. In vivo verilmesi dahil birçok faktör gibi bağırsak mukus varlığı, kesme stresi, sindirim enzimleri, bağışıklık hücreleri, aşağıdakileri içeren, elimine edilir olsa da, in vitro modelinde bu küçük çaplı taşıma ilgili yararlı ön bilgiler sağlar.

Hücresel engelleri ^10,11,16,17 genelinde NC taşıma çalışma bu yöntemlerin adaptasyonunu göstermek için bir örnek olarak, biz burada GI epitel üzerinden NC taşınması için potansiyel bir model ilaç dağıtım geçişini değerlendirerek modellenmiş bir olgu sunulmuştur insan epitel kolorektal adenokarsinom (Caco-2) hücreleri, bir tek tabaka ile sistemi. Bu amaçla, carşın saydamdır ve mikroskopi görüntüleme için kullanılabilecek bir 0.8 um gözenek polietilen tereftalat (PET) filtre (6.4 mm çap) üzerinde, transwell uçlar kültürlenmiştir. Geçirgenlik bariyeri durumu Teer, bir kontrol madde, albumin ve sıkı birleşme, occludin proteinin bir elemanın floresan mikroskobu görselleştirme apikal-to-bazolateral taşıma ölçülmesiyle doğrulanır. Polimer hedef NC bir model 100 nm, doğada çözülmeyen polistiren nano partiküller oluşan kullanılır. NC'ler yüzey tek bir hedef antikor ile adsorpsiyon ya da bir hedef antikorun bir kombinasyonu ve bileşen ya da radyoizotop izleme boyunca ¹²⁵ I ile etiketlenebilir terapötik bir kargo ile kaplanmıştır. Seçilen örnek, antikor, hücreler arası yapışma molekülü-1 (ICAM-1) gösterilmiştir, bir protein GI epitel yüzeyinde eksprese (ve diğer) hücre içi ve hücre üzerinden taşıma o kolaylaştırmak gösterilmiştir hücreleri, f ilaç taşıyıcıları ve bunların kargolar ^21. Yük alfa-galaktosidaz (α-Gal), Fabry hastalığı, genetik bir lizozomal depo ²² bozukluk tedavisi için kullanılan tedavi edici bir enzimdir.

Boyutu yaklaşık 200 nm kaplanmış NC'ler, değişen zaman dönemleri için hücre mono tabakasında üzerinde apikal bölmeye ilave edilmiş ve 37 ° C'de inkübe edilir ve bundan sonra ¹²⁵ NCS I hücre mono tabakasında ve / veya ilişkili tespit edilebilir Hücrelerin aşağıdaki bazolateral bölmeye taşınır. Ücretsiz ¹²⁵ I Ek belirlenmesi kaplanmış NC ulaşım bozulmuş fraksiyonu ve tahmini çıkarma sağlar. Taşıma mekanizması ayrıca hücre üzerinden taşıma endositoz ve transsitoz arasında yolunu modüle zaman taşıma değişiklikler incelenerek belirlenir ise, yukarıda tarif edilen parametreler aracılığıyla, paraselüler yönlendirmek için ilişkin geçirgenlik bariyeri değişiklikler incelenerek değerlendirilir.

"ontent> Bu yöntemler, tamamen hücresel engelleri arasında ilaç verilmesi için potansiyel olarak değerlendirilmesine imkan veren, değerli hücre bariyer modelleri ile ilgili bilgiler, bir ilaç verme sisteminin taşıma oranı ve derecesini, ve bu taşıma mekanizmasını sağlar.

Protokol

1.. Transwell Ek'ler hücre tek tabaka Kültürleme

1. Steril, biyogüvenlik düzeyi 2 hücre kültürü kaputu, 0.8 mm PET forseps ile (istatistiksel anlamlılık için, durum başına 4 kuyu) 24 plaka içine ekler Transwell gözenek yerleştirin. Kapağı giren bütün malzemeler, etanol ile sterilize edilmelidir.

Not: filtrenin gözenek boyutu NC kullanılan ortalama boyutuna uygun olarak seçilmesi gerekir, zar boyunca taşıma izin vermek. Ayrıca, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için, her deney durumu aynı deney içinde dört tekrarlar (oyuk) bir minimum ve 3 bağımsız deney en az gerektirir.

2. Bir su banyosu içinde 37 ° C hücre kültürü 4.5 g / L glukoz,% 15 fetal bovin serum ve% 1 Pen Strep ile takviye edilmiş DMEM ortamı ihtiva eden bir ortam, ve ısı hazırlayın.
3. Hücre ortamı ve yerinde (Caco-2) hücreleri insan epitel kolorektal adenokarsinom seyreltin/ Cm ² 1.5 x 10 ⁵ hücre yoğunluğunda transwell ucun üst (apikal) bölme içine, hücre çözeltisinin 200-400 ul. Hücre ortamında 900 ul - 700 ile alt (bazolateral) bölmesini doldurun.
4. Adım 1.3 'de gösterilen birimleri kullanılarak, her 3-4 günde, üst ve alt odası içindeki bir ortam değiştirme 37 ° C,% 5 _CO2 ve 16-21 gün için% 95 nem oranında kültür hücreleri. , Alt bölmeden orta aspire üst bölmeden orta aspire, taze ortam ile üst bölmeyi doldurmak ve alt bölmeyi doldurmak: Hücre mono tabakasının (yerine göre aşağıda) üzerindeki basıncın muhafaza edilmesi için aşağıdaki sırayla orta değiştirin taze ortam.

2. Sıkı EklemlerininTünelleme GI epitel geçirgenliği Transepitelyal Elektrik Direnci kullanma Bariyer (TEER) ve immünboyanmadan Doğrulama

1. Kısa süreli saklama (2 haftadan daha az) için, bir elektrolit sorunun çözümünden de STX100 elektrotlar batığıntion (0.1-0.15 M KCl veya NaCl). Sistem dahili kısa devre ve elektrot simetri korunur, böylece EVOM volt-ohm metre üzerinde elektrot noktasına elektrot kablosunu bağlayın. Uzun süreli depolama için, dH ₂ O ile yıkayın ve kuru, karanlık koşullarda saklayın.
2. , Elektrotlar sterilize 15 dakika boyunca etanol içinde batırmak ve 15 saniye boyunca havada kurumaya izin vermek için. Alternatif olarak, elektrotlar bir UV başlığı içinde saklanabilir. Her bir ölçümden önce direnç, steril bir elektrolit çözeltisi (fosfat tamponlu tuz çözeltisi, PBS) veya 0.1-0.15 M KCl veya NaCl çözeltisi içinde elektrotlar durulayın.
3. Volt-ohm metre direnç ayara sahip, dikey olarak üst odasında kısa elektrot ve kuyunun alt temas alt bölme içinde uzun elektrot ile, iyi transwell inserti ihtiva eden elektrotlar yerleştirin. Her bir kuyu için; EVOM okuma stabilize sonra, (Ω ohm verilen) direnç değerini kaydedin.
4. Özdirenç (DAYANIKLI hesaplayınce alana normalize; Ω × cm ²⁾ arka plan direncini hücreleri olmadan transwell uçlar (TEER) çıkarılarak ve membran yüzey alanı ile çarpılarak numunelerin. Direnç değerleri en sık literatürde bildirilmiştir. (Tartışma bak)
5. TEER tipik olarak hücre platting andan itibaren 2-3 hafta alır geçirgenlik bariyer oluşumunu gösteren bir maksimum ve plato sebebiyet değeri kadar her 1-2 gün ölçümleri tekrarlayın. Plato TEER değerleri ve bariyer bütünlüğünü sağlamak için gerekli zamanı hücre kanalı sayısına bağlı olarak değişebilir.
6. Yüksek TEER (engelleyici formasyonu için eşik değerine eşit veya üzerinde) ile hücre mono tabakaları sıkı birleşme varlığını doğrulamak için, 15 dakika boyunca soğuk% 2 paraformaldehid ile inkübasyon yoluyla Hücreleri sabitlemek. Daha sonra, 1 ug / ml anti-occludin ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS ile bunları hücreleri yıkayın ve inkübe edilir. PBS ile tekrar hücreleri yıkayın ve 7.5 ug / ml F, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübeluorescently-etiketli sekonder antikorları içerir. Bariyer oluşumu için bir negatif kontrol olarak, düşük TEER ile kuyu kullanın.

Not: Anti-occludin için bir ikame olarak, alternatif bir sıkı bağlantı proteinlerine antikorlar kullanılabilmektedir.

7. Dikkatlice sabit tek tabaka bağlı olduğu filtre zarı tüketim ve Epifloresans veya konfokal mikroskopi kullanılarak görüntüleme için slaytlar üzerine monte edilir.

3. Hedeflenen Taşıyıcılar Transepitelyal Transport Değerlendirilmesi

1. ^7, daha önce tarif edildiği gibi, ¹²⁵ I ile hedefleme antikoru (bu örnekte, ICAM-1'e karşı fare monoklonal antikoru, anti-ICAM) etiketleyin. Etiketli antikorun antikor üzerindeki ^125I içeriğini belirlemek için, protein konsantrasyonu ve bir gama sayacı tahmin etmek Bradford tahlili kullanarak, ardından dakika (CPM) sayım olarak spesifik aktivitesinin hesaplanması / mg.

Not: özgünlük için kontrol etmek için, yenidenUygun olmayan bir kaplanmış, NCS hazırlamak için kullanılacak etiketleme fare IgG ile prosedür turba. Terapötik bir kargo taşıma incelemek için, bu örnekte, yük etiketleme prosedürü, örneğin, alfa-galaktosidaz (α-Gal) tekrarlayın. Alternatifler hedefleme ajanı, spesifik olmayan bir kontrol ya da tedavi edici yükler için de kullanılabilir. Alternatif yöntemleri de bileşikler etiket ve etiketlenmiş meslektaşları konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılabilmektedir.

2. Çift NCS yüzeyine antikoru (örnekte anti-ICAM) hedefleme etiketli. Bu örnekte, ^7, tarif edildiği gibi, yüzey soğrulmasına olanak vermek için ¹²⁵ I-anti-ICAM ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca polistiren nanobeads (100-nm çapında) inkübe edilir.

Not: spesifik olmayan kontrol ^125I-IgG kullanın. Bir kargo taşıma izlemek için, antikor ve ^125-etiketli kargo (bizim örneğimizde α-Gal) hedefleyen bir arada kullanın.

3. 3 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüj ve aspirasyon ile üstte yüzen madde içindeki kaplı olmayan muadilleri çıkarın. Parçacıkların kümelenmesi potansiyel (20-30 kısa darbeler) bozmak için düşük güçte% 1 sığır serum pipetleme PBS albümini (BSA) ve sonikasyon kullanılarak kaplanmış NCS içeren pelet yeniden süspanse edin.
4. NC karakterizasyonu için, boyut, bir çoklu-dağınıklığa ve dinamik ışık saçılması (satıcı talimatlarına uygun) kullanılarak kaplanmış parçacıkların ζ-potansiyelini ölçmek ve sayısını ölçmek ¹²⁵ kullanarak bir parçacık yüzeyi üzerinde antikor moleküllerinin (örneğin, anti-ICAM) hedef-işaretli gama sayacı.

Not: Bu yöntem, spesifik olmayan ve terapötik karşıtları için tekrarlanabilir. Kaplanmış taneciklerin büyüklüğü 200 nm civarında değişmektedir.

5. TEER ile birleşen ve Caco-2 tek katmanlarının üzerindeki üst bölmeye, ¹²⁵ I-antikor NCS, (56 nCi / ml, örneğin ^{125I-anti-ICAM} NCS) ekleyin# 8805; arka plan üzerinde 350 Ω × cm ² (Tartışma) (16-21 gün sonrası-ekim). Bir veya daha fazla arzu edilen zaman aralıkları boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Geçirgenlik bariyer üzerinde NC'ler etkilerini değerlendirmek için inkübasyon öncesi ve sonrası Teer (Bölüm 2.3) ölçün.

Not: Bu işlem, özel olmayan ve terapötik karşıtları için tekrarlanabilir.

6. Üst ve alt odadan orta toplamak ve 37 ° C (oda üst) veya 1 ml dH ₂ O (alt odası) 0.5 ml DMEM ile bir kere yıkayın. Bir gama sayacı kullanılarak toplam radyoizotop içeriğinin ölçülmesi için yıkama toplayın.
7. Hücre fraksiyonu ölçümü için, kenarlarda kesme ve ölçme hücresi önce 10 dakika boyunca (hücre içeriği serbest bırakmak için),% 1 Triton X-100 ile bir gamma sayıcı tüp içinde inkübasyona bir ustura kullanılarak, örneğin, geçirgen filtre tüketim toplam radyoaktivite ilişkili.
8. Ben tekrar ¹²⁵ ölçmek için, olası bozulma, ilk karışımı, PBS içinde% 3 BSA içinde 700 ul ve 200 ul trikloroasetik asit (TCA) ile (üst, alt veya hücre fraksiyonlarından) numune 300 ul için nakil sırasında NC'ler veya kiralanan. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bununla birlikte, bu kez, bir gamma sayacında Bu örnek, toplam radyoaktivite ölçülür.
9. Bozulmuş protein veya ¹²⁵ I fraksiyon (yüzer) için sağlam protein (pelet) ayırmak üzere 5 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüjleyin TCA örnekleri. Serbest ^125I fraksiyonun radyoaktivitesi sayısal olarak ve daha önce santrifüj ölçülen toplam radyoaktivitenin bu değeri çıkarın. Bu bozulmuş değildir etiketli protein miktarını sağlayacaktır.

4. Hedeflenen Nanocarriers of Transepitelyal Ulaştırma Mekanizması

1. Etiket da Bölüm 3.1 'de tarif edildiği gibi ¹²⁵ ile bir albümin ⁷ bildirilmiştir.

Not: Albumin a 66.5 olduğunudolayısıyla kDa protein ve, nispeten büyük bir madde. Küçük ilaç taşıyıcılarının taşıma okuyan zaman büyük nesneler (örneğin 200 nm NC'ler Burada kullanılan) pasif taşıma için geçerli bir denetim, bu (Tartışma) küçük asal izleyici moleküller ile ikame edilmelidir rağmen.

2. Albumin paraselüler sızıntı, yukarıda tarif edildiği gibi Transwell kültür ekleri üzerine Caco-2 tek tabakaları kullanılarak paraselüler taşıma değerlendirmek.
3. Hücre mono tabakasının üzerindeki üst odası ortamı için, (Bölüm 3.5 'de tarif edildiği gibi) ¹²⁵ I-albümin, tek başına (sızıntısının bazal seviyesini gösteren negatif kontrol) ya da ¹²⁵ I-albümin ve non-radyo-etiketli antikor ya da hedefli bir NCS ekleyin. NC taşıma test ederken muayene uymalıdır seçilen zaman aralığı (s), 37 ° C'de inkübe edin. Öncesinde, sırasında Teer (Bölüm 2.3) ölçün ve belirtildiği gibi inkübasyondan sonra, bundan sonra, toplam ¹²⁵ I ve serbest ^125I ölçümleri seyahati fraksiyonlarım toplamak. Bölüm 3 Not: ^{125I-albümin} ve radyo-etiketlenmemiş kontrol IgG NC'ler eş zamanlı ek bir kontrol olarak kullanılabilir.
4. Arası bağlantı yerlerine açılması için bir pozitif kontrol olarak, hücre ortamı transwell ucun üst ve alt bölmelere 5 mM H ₂ O ₂ içeren ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Daha sonra, Teer (Bölüm 2.3) ölçmek ve seçilen zaman aralıkları için üst bölmeye ¹²⁵ I-albümin ekleyin. H ₂ hücre birleşme kısımlarının O ₂ kaynaklı açma neden olduğu çürüme TEER değeri tespit etmek kuluçkalama boyunca çeşitli zaman noktalarında Teer ölçün.
5. Paralel deneylerde, 50 uM ya da monodansylcadaverine ile birleşen Caco-2 tek-tabakalar inkübe edilerek ¹²⁵ I-hedefli NCS, aynı zamanda transsitoz adlandırılan hücre üzerinden taşıma değerlendirmek (MDC, klatrin dolayımlı endositoz inhibitörü), 1 ug / ml filipin (caveolar inhibitörü aracılı endositoz), 0.5 uM Wortmannin ya da 20 uM [5 - (N-etil-N-izopropil) amilorit] (fosfatidilinositol 3 makropinositoz dahil kinaz [PI3K] inhibitörü) (makropinositoz ve CAM dolayımlı endositoz ¹⁵ inhibitörü EIPA).

Not: ^125I-IgG NC'ler ve ¹²⁵ I-albumin, bu inhibitörlerin etkisi için negatif kontrol olarak kullanılabilir, ve diğer yöntemler (örneğin, siRNA teknikleri) daha seçici inhibisyonu sağlayabilir.

6. Tek tabaka geçirgenliği üzerindeki inhibitörlerinin etkisi için ilave bir kontrol olarak, Teer sırasında önce (Bölüm 2.3) ve inhibitörleri ve radyo-etiketli malzeme ile hücrelerin inkübasyonu sonrasında ölçün.

Sonuçlar

Hedeflenen NCS transepitelyal taşıma çalışma için hücre modelinin doğrulama olarak, Şekil 2, Caco-2 hücre mono tabakaları izdiham ~ 12 gün ulaşmıştır 1.5 x 10 ⁵ hücre / cm ² arasında bir yoğunlukta kaplanmıştır ve 18 gün kadar tek tabaka bütünlüğünü muhafaza olduğunu göstermektedir TEER (Şekil 2A) ile. Bu düşük TEER kötü sıkı kavşak etiketleme (17 Ω × cm ^2, 5 günde kıyasla, yüksek TEER (390 Ω × cm ^2,

Tartışmalar

Yukarıda tartışılan yöntemler kullanılarak, hücresel engelleri arasında hedef NCS taşıma çalışmak için bir hücre modeli bu durumda kana GI lümeninden taşıma değerlendirilmesi için uygun olan Caco-2 epitel hücreleri için, verilen örnekte olduğu gibi, kurulabilir ağızdan ilaç verme sistemleri. Transwell ekler GI epitel hücre mono tabakaları kültürleme bir hücre geçirgenliği bariyer oluşumu teyit TEER ölçümü ve sıkı kavşaklar floresan bağışıklık boyamasım sağladı. Daha sonr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90