Модели и методы для оценки Перевозка системам по наркотикам Доставка по клеточные барьеры

Резюме

Многие терапевтические приложения требуют безопасной и эффективной транспортировки носителей лекарственных средств и их грузов по клеточные барьеры в организме. В этой статье описывается адаптацию установленных методов оценить скорость и механизм транспортировки наноносителей наркотиков (NCS) через клеточные барьеры, такие как желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) эпителия.

Аннотация

Суб-микрометр носители (наноносителей; НК) повышения эффективности лекарств путем улучшения растворимости, стабильности, время циркуляции, адресности, и отпустите. Кроме того, пересекая клеточные барьеры в организме имеет решающее значение как для перорального применения терапевтических НК в обращении и транспорта из крови в ткани, где вмешательство не требуется. NC транспорт через клеточные барьеры достигается: (I) парацеллюлярная маршруту, через переходного нарушения стыках, которые сцепляются соседние ячейки, или (II) трансцеллюлярного маршрут, где материалы усвоены эндоцитоза, перемещаемых через тела клетки и секретируется на противоположной поверхности клеток (transyctosis). Доставка по клеточные барьеры можно облегчить путем сочетания терапии или их носителей с таргетинга агентов, которые специфически связываются с клеточной поверхности маркеров, участвующих в транспорте. Здесь мы предоставляем методы для определения степени и механизм НК транспорта через модель клеточный барьер, бееCH состоит из монослоя желудочно-кишечного тракта (GI) эпителиальные клетки, выращенные на пористой мембраной, расположенной в Transwell вставки. Формирование барьера проницаемости подтверждается измерения трансэпителиальный электрическое сопротивление (Тир), трансэпителиальный транспорт контрольного вещества и Иммуноокрашивание плотных контактов. Например, ~ 200 нм полимерные НК используются, которые несут терапевтический груз и покрыты антителом, предназначенного для элемента клеточной поверхности определитель. Антитела или терапевтического грузов помечен ¹²⁵ I для радиоизотопной трассировки и меченые НК добавляются в верхнюю палату по клеточный монослой в течение различных периодов времени. НК, связанные с клетками и / или транспортируемых к основной камере может быть обнаружена. Измерение свободного ¹²⁵ I позволяет вычитание деградированных фракции. Маршрут парацеллюлярная оценивается путем определения потенциальных изменений, вызванных НК транспорта барьерных параметров, описанных выше. Трансцеллюлярного транспорта яы определяется решении эффект модуляции эндоцитоза и трансцитоз пути.

Введение

Сотовые барьеры в акте тела в качестве шлюза между внешней средой и внутренними отсеками. Это тот случай, для эпителиальной выстилки, отделяющей извне открытую поверхность желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и кровоток ^1-3. Сотовые барьеры также представляет собой интерфейс между кровоток и паренхимы и клеточных компонентов тканей и органов. Это тот случай, для внутренней эндотелиальной выстилки кровеносных сосудов, такие как гематоэнцефалический барьер легких, в гематоэнцефалический барьер и т.д. ¹ способность пересекать эти клеточные барьеры в организме имеет решающее значение для эффективной доставки терапевтических и диагностических средств в обращение и тканей / органов, где вмешательство необходимо.

Чтобы улучшить доставку терапевтических или диагностических агентов, эти соединения могут быть загружены в суб-микронных наноносителей (NCS). Эти транспортные средства доставки лекарственных средств могут быть приготовлены с различнымихимические и структуры для оптимизации растворимость наркотиков, защиту, фармакокинетики, выпуск и обмен веществ ^4,5. НК также можно функционализирован близости или целевые фрагменты (например, антитела, пептиды сахара, аптамеры и т.д.) для облегчения адгезии к областях тела, где терапевтическое действие требуется ^2,6. Ориентация из НК, чтобы детерминант, выраженных на поверхности клеточных барьеров может еще больше облегчить транспорт в и / или через эти накладок ^2,6.

Роль выборочно транспортировки веществ между двумя средами требует определенных уникальных особенностей среди слоев клеток. Одна из таких особенностей является клеточной полярности, причем апикальной мембраны, обращенной в просвет полости варьируется от базолатеральной мембране, ориентированного на ткани интерстиции, по отношению к мембранной морфологии и состава липидов, транспортеры, и рецепторов ^2. Еще одна особенность предполагает межклеточное junctioнс, соединяющие соседние клетки. Регулирование белков, которые формируют плотные соединения, в частности Junctional молекул адгезии (джемы), occludins и клаудины, модулировать барьерную функцию, чтобы выборочно разрешить или не транспорт веществ между клетками, известными как парацеллюлярной транспорта, обеспечивая прохождение материалов из просвета в базолатеральный пространство ^3. Связывание многих природных и синтетических элементов (лейкоцитов, молекул, частиц и систем доставки лекарств) до клеточные барьеры в организме может вызвать открытие клеточного перехода, который может быть временной и относительно безвредны или более продолжительным, а следовательно, небезопасным с доступом нежелательных веществ через барьер ^2,5,7-9. Следовательно, этот путь может быть оценена посредством измерения электрического сопротивления трансэпителиальный (Тир) и пассивный парацеллюлярного диффузию молекул (называемого здесь утечки парацеллюлярная), в результате чего уменьшилось сопротивление электрического тока утечки или повышенного парацеллюлярной из INERT соединение в базолатеральную пространства указывают открытие соединений элементов, соответственно ^5,10,11. В дополнение к этим методам, любой из узких соединительных белков, перечисленных выше, могут быть окрашены, чтобы оценить их целостность, где окрашивание должны отображаться сосредоточена в межклеточных границ все вокруг периферии клетки ^5,10,12.

Кроме того, системы доставки лекарств, которые нацелены на конкретные клеточной поверхности детерминанты, такие как те, что связаны с клатриновых ямы или колбовидные мембранных инвагинаций называемых кавеолы, может вызвать везикулярного поступлению в клетки путем эндоцитоза, обеспечивая путь для доставки лекарств к внутриклеточным ^{5, 13.} Кроме того, эндоцитоз может привести к торговле людьми пузырьков по всему телу клетки для выпуска на базолатеральной стороны, явление, известное как transyctosis или трансцеллюлярного транспорта ^14. Поэтому знание кинетики и механизма эндоцитоза может использоваться, чтобы эксплуатировать внутриклеточный Aй трансцеллюлярного доставки лекарств, которые предлагает относительно безопасный и контролируемый способ доставки по сравнению с парацеллюлярной маршрута. Механизм эндоцитоза может быть оценена с модуляторами классических путей (клатрин и кавеолин-опосредованного эндоцитоза и макропиноцитозом) или неклассических маршрутов (например, в случае молекулы клеточной адгезии (CAM)-опосредованного эндоцитоза) ^5,13,15 .

В то время как внутриклеточный торговля часто учился в стандартных скважин или покровные, отсутствие базолатеральную отсека исключает клеток поляризацию и способность к обучению транспорт через клеточные слои. Чтобы преодолеть это препятствие, транспорт через клеточные монослоев уже давно изучены с помощью Transwell вставляет ^10,11,16,17, которые состоят из верхней (апикальной) камеры, пористой мембраны, где клетки придают и образуют плотный монослой, и ниже (базолатеральная) камера (рис. 1). В этой конфигурации транспортного могут быть измерены вапикальный к базолатеральной направлении путем введения лечение в верхнюю камеру, после транспорта через клеточный монослой и основной пористой мембраны, и, наконец сбора среды в нижней камере для количественного определения транспортируемого материала. Транспорт в базолатеральной к апикальной-направлении также может быть измерена путем первоначального введения в нижнюю камеру и последующего сбора из верхней камеры ^5,10,12,16. Существуют различные способы, чтобы проверить формирование проницаемости барьера на transwells, в том числе и TEER парацеллюлярного транспорта анализов, как описано выше. Кроме того, проницаемый фильтр, на котором клетки культивируют могут быть удалены для анализа изображений (например, путем флуоресценции, конфокальной, электронной микроскопии), а дальнейшей проверки модели монослой клеток, а также механизма транспортировки. Выбор типа мембраны, которая доступна в различных размерах пор, материалов и поверхностных областях, зависит от различных фактоRS, такие как размер веществ или предметов, перевозимых, типа клеток, и метода визуализации ^16,18-20. Transwell вставки также способствовать контролируемое и точный количественный анализ транспорта по сравнению с сложных систем млекопитающих, а объемы камер и площади поверхности клетки, как известно константы. Хотя многие факторы, влияющие на в естественных условиях поставки будут устранены, в том числе наличие кишечной слизи, напряжение сдвига, пищеварительных ферментов, иммунных клеток и т.д. Этот небольшой масштаб в пробирке модель обеспечивает полезную предварительную информацию о транспорте.

В качестве примера, иллюстрирующего адаптации этих методов для изучения NC транспорт через клеточные барьеры ^10,11,16,17, мы описываем здесь случай, когда был смоделирован потенциал для НК транспорта через желудочно эпителия путем оценки прохождение модели доставки лекарств Система через монослой человеческих эпителиальных колоректальной аденокарциномы (Сасо-2) клеток. Для этого, слоктей культивировали в Transwell вставками, на мкм пор полиэтилентерефталата 0,8 (ПЭТ) фильтра (диаметр 6,4 мм), который является прозрачным и может быть использован для визуализации микроскопии. Статус барьер проницаемости проверяется путем измерения TEER, верхушечный к базолатеральная транспорт контрольного вещества, альбумина, и флуоресцентной микроскопии визуализации элемента плотных контактов, occludin белка. Модель целевой полимерной NC используется, состоящий из 100 нм, небиодеградируемых наночастиц полистирола. НК покрыты путем поверхностной адсорбции с использованием только адресным антитела или комбинации антител и ориентации терапевтического грузов, где либо компонент может быть, меченного ¹²⁵ I для радиоизотопного трассировки. В выбранном Например, антитело распознает молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), белок экспрессируется на поверхности из желудочно-кишечного эпителия (и другие) клетки, которые, как было показано способствовать внутриклеточным и трансцеллюлярного транспортного O е носители лекарственных средств и их грузов ^21. Груз альфа-галактозидазы (α-Gal), терапевтический фермент, используемый для лечения болезни Фабри, расстройства ²² генетический хранения лизосомальных.

Покрытые НК, около 200 нм в размере, добавляются в апикальную камеру через клеточный монослой и инкубировали при 37 ° С в течение различных периодов времени, после чего ¹²⁵ I на НК могут быть обнаружены, ассоциированный с монослое клеток и / или транспортируется к базолатеральной камере ниже клеток. Дополнительная определение свободного ¹²⁵ I позволяет вычитание деградированных фракции и оценки покрытием НК транспорта. Механизм транспорта дополнительно оценивали путем анализа изменений в проницаемости барьера, относящейся к парацеллюлярной маршрута, через параметрами, описанными выше, а трансцеллюлярного транспорт определяется путем анализа изменений на транспорте при модуляции путей эндоцитоза и трансцитоза.

ontent "> Эти методы обеспечивают ценную информацию относительно моделей сотовых барьерных, степень и скорость перевозки системы доставки лекарственного, и механизм такого транспорта, в целом позволяет оценить потенциал для доставки лекарств через клеточные барьеры.

протокол

1. Культивирование монослой клеток в Transwell вставками

1. В стерильной, уровень биологической безопасности 2 клеток капотом культуры, поместите 0,8 мм пор ПЭТ Transwell вставки в 24-луночный планшет (4 скважин в состоянии, на статистическую значимость) щипцами. Все материалы, входящие в капот должны быть стерилизованы с этанолом.

Примечание: размер пор фильтра должен быть выбран в соответствии со средним размером ЧПУ, используемого, чтобы позволить транспортировку через мембрану. Кроме того, для статистически значимых результатов, каждый экспериментальная условие требует как минимум четырех повторов (скважины) в рамках того же эксперимента, и как минимум 3 независимых экспериментов.

2. Подготовка среды клеточной культуры, содержащей DMEM среду, дополненную 4,5 г / л глюкозы, 15% фетальной бычьей сыворотки и 1% Pen Strep, и тепло до 37 ° С на водяной бане.
3. Развести человека эпителиальных колоректального аденокарциномы (ЦАС-2) клеток в среде клеток и место200-400 мкл клеточной раствора в верхней (апикальной) камеры Transwell вставки, при плотности 1,5 × 10 ⁵ клеток / см ^2. Заполните нижнюю (базолатеральных) камеру с 700 - 900 мкл клеточной среде.
4. Культуры клеток при 37 ° C, 5% СО _2, и 95% влажности в течение 16-21 дней, заменяя среду в верхней и нижней палаты каждые 3-4 дня, используя объемы, указанные в пункте 1.3. Замена среды в следующем порядке, чтобы поддерживать давление выше (а не ниже) клеточный монослой: аспирации среды из нижней камеры, аспирации среды из верхней камеры, заполнить верхнюю камеру свежей средой, и заполнить нижнюю камеру с свежую среду.

2. Подтверждение Г.И. эпителиальной проницаемости барьера Использование трансэпителиального электрического сопротивления (Тир) и Иммуноокрашивание плотных контактов

1. Для кратковременного хранения (менее 2 недель), погрузить STX100 электроды в реше электролитауравнение (0,1-0,15 М KCl или NaCl). Подключение кабеля электрода к электроду порта на метр EVOM вольт-ом так, что система внутренне короткого замыкания и электрод симметрия сохраняется. Для долговременного хранения, промыть дН ₂ O и хранить в сухом, темном состоянии.
2. Для стерилизации электродов, погрузиться в этаноле в течение 15 мин и дайте высохнуть на воздухе в течение 15 сек. Кроме того, электроды могут храниться в УФ капотом. Промыть электроды в виде стерильного раствора электролита (фосфатный буфер солевой раствор, PBS) или 0,1-0,15 М KCl или NaCl раствором, перед каждым измерением сопротивления.
3. С вольтметр Ом установлен с настройкой сопротивления, вертикально разместить электроды в скважине, содержащий вставку Transwell, с коротким электродом в верхней камере и длинной электрода в нижней камере касаясь дна скважины. После того как показания EVOM стабилизируется, записать значение сопротивления (с учетом Ом; Ω) для каждой скважины.
4. Рассчитать сопротивления (стойкиесе, нормированная на площади; Ω × см ²⁾ образцов путем вычитания фона сопротивление (Тир из Transwell вставками без клеток) и умножения на поверхности мембраны. Значения удельного сопротивления наиболее часто сообщалось в литературе. (См. обсуждение)
5. Повторите измерения каждые 1-2 дня, пока TEER не ценит подъем до максимума и плато, указывая формирование барьера проницаемости, который обычно занимает 2-3 недели с момента клеток плетенки. Ценности и время, необходимое для достижения целостности барьера плато Тир может варьироваться в зависимости от числа пассажей клеток.
6. Чтобы проверить наличие плотных контактов в клеточных монослоев с высокой TEER (равной или выше порогового значения для формирования барьера), исправить клетки путем инкубации с холодной 2% параформальдегидом в течение 15 мин. Затем промыть клетки с PBS и инкубировали их в течение 30 мин при комнатной температуре с 1 мкг / мл анти-occludin. Промыть клетки снова с PBS и инкубировали их в течение 30 мин при комнатной температуре с 7,5 мкг / мл Fluorescently меченные вторичные антитела. С помощью скважин с низким TEER в качестве отрицательного контроля для формирования барьера.

Примечание: В качестве замены для анти-occludin, могут быть использованы антитела к альтернативным труднодоступных белков соединительных.

7. Осторожно вырезать мембрану фильтра, на котором фиксируется монослой прилагается, и установка на горками для визуализации с использованием эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.

3. Оценка трансэпителиальной Транспорт целевых перевозчиков

1. Этикетка ориентации антитела (мышиное моноклональное антитело против ICAM-1, анти-ICAM, в этом примере) с ¹²⁵ I, как описано выше ^7. Использование Бредфорда оценить концентрацию белка и гамма-счетчика, чтобы определить, ¹²⁵ I контент на антитела, а затем рассчитать специфическую активность в импульсах в минуту (СРМ) / мг меченого антитела.

Примечание: Для контроля специфичности, повторноторфа процедуру, маркировка мыши IgG, который будет использоваться для подготовки нецелевой НК покрытием. Для изучения транспорт терапевтического груза, повторите процедуру маркировки груза, например, альфа-галактозидазы (α-Гал) в этом примере. Альтернативы могут быть использованы для таргетинга агента, неспецифический управления или терапевтического груза. Альтернативные методы также могут быть использованы для обозначения соединений и оценить концентрацию меченых аналогов.

2. Пара меченый ориентации антитела (анти-ICAM в нашем примере) к поверхности НК. В этом примере, инкубировать полистирола nanobeads (диаметр 100 нм) в течение 1 ч при комнатной температуре с ¹²⁵ I-анти-ICAM чтобы поверхностной адсорбции, как описано ^7.

Примечание: Для неспецифическое управления использовать ¹²⁵ I-IgG. Чтобы проследить транспортировку груза, использовать сочетание ориентации антитела и ¹²⁵ I-меченого груз (α-Гал в нашем примере).

3. Центрифуга при 13000 мкг в течение 3 мин и удалить без покрытия аналогов в супернатант аспирацией. Ресуспендируют осадок, содержащий НК с покрытием с использованием 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS с помощью пипетки, и обрабатывают ультразвуком при низкой мощности, чтобы сорвать потенциальных агрегатов частиц (20-30 коротких импульсов).
4. Для НК характеристики, измерить размер, полидисперсность и ζ-потенциал частиц с покрытием с использованием динамического рассеяния света (в соответствии с инструкциями производителя), и количественно количество ¹²⁵ I-меченого ориентации молекулы антитела (например анти-ICAM) на поверхности частиц с помощью гамма-счетчике.

Примечание: Эти методы можно повторить для неспецифических и терапевтических аналогов. Размер покрытых частиц колеблется в пределах 200 нм.

5. Добавить ¹²⁵ I-антитело НК (например, ¹²⁵ I-анти-ICAM NCS; 56 нКи / мл) в верхнюю палату выше сливающихся Caco-2 монослоев с TEER &# 8805; 350 Ω × см ² (см. Обсуждение) над фоне (16-21 дней после посева). Инкубировать при 37 ° С в течение одного или более временных интервалов желании. Измерьте TEER (раздел 2.3) до и после инкубации с целью оценки последствий НК на барьер проницаемости.

Примечание: Эта процедура может быть повторена для неспецифических и терапевтических аналогов.

6. Сбор среды из верхней и нижней палат и мыть их раз с 0,5 мл DMEM при 37 ° C (верхняя палата) или 1 мл дН ₂ O (нижняя палата). Сбор моет для измерения общего содержания радиоизотопов с помощью гамма-счетчика.
7. Для измерения клеточной фракции, акцизного проницаемой фильтр, например, с помощью лезвия бритвы вырезать по краям, и инкубировать в гамма-счетной трубки с 1% Triton X-100 в течение 10 мин (чтобы освободить содержимое ячейки), до измерительной ячейки связанных общая радиоактивность.
8. Для измерения ¹²⁵ я повторноарендованные у НК во время транспортировки или из-за потенциальной деградации, первый микс 300 мкл образца (из верхних, нижних, или клеточных фракций) с 700 мкл 3% БСА в PBS и 200 мкл трихлоруксусной кислоты (ТСА). Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Между тем на этот раз, измерения общего радиоактивность этого образца в гамма-счетчике.
9. Центрифуга образцов при TCA 3000 мкг в течение 5 мин, чтобы отделить интактный белок (гранулы) от деградации белка или ¹²⁵ I надосадочной фракции (). Количественная радиоактивности свободной ¹²⁵ I фракции и вычесть это значение из общего объема радиоактивности, измеренный перед центрифугированием. Это обеспечит количества меченого белка, который не разрушается.

4. Механизм трансэпителиальной транспорта целенаправленных наноносителей

1. Этикетка альбумина с ¹²⁵ I, как описано в разделе 3.1 и сообщалось ранее ^7.

Примечание: Альбумин 66,5кДа белок и, следовательно, относительно большое вещество. Хотя действительный контроль для пассивного перевозки крупных объектов (например, 200 нм НК используется здесь), он должен быть замещена мелких инертных молекул-меток при изучении переноса небольших носителей лекарственных средств (см. обсуждение).

2. Для оценки парацеллюлярного транспорта с использованием альбумина утечки парацеллюлярного, культуры Сасо-2 монослоев на Transwell вставками, как описано выше.
3. Для верхней среде камеры выше клеточного монослоя, добавить либо ¹²⁵ наедине I-альбумина (отрицательный контроль показывая базального уровня утечки), или ¹²⁵ I-альбумина и не меченные радиоактивным изотопом НК антител целевых (как описано в разделе 3.5). Инкубировать при 37 ° С в течение выбранного интервала (а) Время, которое должно соответствовать обследованных при тестировании NC транспорт. Измерьте TEER (раздел 2.3) до, во время и после инкубации, затем собрать все фракции для общей ¹²⁵ I и свободного ¹²⁵ I измерений, как указано. в разделе 3 Примечание: Одновременное добавление ¹²⁵ I-альбумина и не радиоактивно контрольных IgG НК могут быть использованы в качестве контроля.
4. В качестве положительного контроля для открытия межклеточные добавить клеток средой, содержащей 5 мМ H ₂ O ₂ в верхней и нижней камерах Transwell вставки, и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Затем измерить TEER (раздел 2.3) и добавьте ¹²⁵ I-альбумина в верхнюю палату для отдельных временных интервалов. Измерьте TEER в различные моменты времени по всей инкубации определить распад значение Тир, вызванной Н ₂ О _{2-индуцированного} открытие соединений элементов.
5. В параллельных экспериментах, оценивать трансцеллюлярного транспорта, также называемый трансцитоза, ¹²⁵ I-целевых НК путем инкубации сливные Сасо-2 монослоев либо 50 мкМ monodansylcadaverine (MDC; ингибитор клатрин-опосредованного эндоцитоза), 1 мкг / мл филипин (ингибитор caveolar эндоцитоза), 0,5 мкМ Wortmannв (ингибитор фосфатидилинозитол 3-киназы [PI3K], участвующих в макропиноцитозом) или 20 мкМ [5 - (N-этил-N-изопропил) амилорид] (EIPA, ингибитор макропиноцитозом и CAM-опосредованного эндоцитоза ^15).

Примечание: ¹²⁵ I-IgG НК и ¹²⁵ I-альбумина могут быть использованы в качестве отрицательных контролей для влияния этих ингибиторов, а также другие методы (например, методы миРНК) может обеспечить более селективное ингибирование.

6. Измерение TEER (раздел 2.3) до, во время и после инкубации клеток с радиоактивно меченных ингибиторов и материалов, в качестве дополнительного контроля для эффекта ингибиторов на монослойной проницаемости.

Результаты

Как проверки нашей модели клеток для изучения трансэпителиальный транспорт целевых НК, Рисунок 2 показывает, что Сасо-2 монослои клеток высевали при плотности 1,5 × 10 ⁵ клеток / см ^2, достигнутой слияния ~ день 12 и поддерживается целостность монослоя до Дня 18, обозначае?...

Обсуждение

Используя методы, описанные выше, модель сотового для изучения транспорт целевых НК всей клеточные барьеры могут быть установлены, например, примера, приведенного в Caco-2 эпителиальных клеток, которая имеет отношение к оценке транспорт из GI просвета в кровь в случае оральных систем дост...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90