Modèles et méthodes pour évaluer le transport des Drug Delivery Systems à travers les barrières cellulaires

Résumé

De nombreuses applications thérapeutiques nécessitent un transport sûr et efficace des transporteurs de drogue et leurs cargaisons à travers les barrières cellulaires dans le corps. Cet article décrit une adaptation des méthodes établies pour évaluer la vitesse et le mécanisme de transport de nanovecteurs de médicaments (NCS) à travers les barrières cellulaires, telles que la gastro-intestinale (GI) épithélium.

Résumé

Transporteurs sous-micrométriques (nanocarriers; CN) améliorer l'efficacité des médicaments en améliorant la solubilité, stabilité, temps de circulation, le ciblage et la libération. En outre, traversant les barrières cellulaires dans le corps est crucial à la fois pour l'administration orale de CN thérapeutiques dans la circulation et le transport du sang vers les tissus, où l'intervention est nécessaire. Le transport NC à travers les barrières cellulaires est obtenue par: (i) la voie paracellulaire, par l'intermédiaire de la perturbation transitoire des jonctions qui s'imbriquent les cellules adjacentes, ou (ii) la voie transcellulaire, où les matériaux sont internalisées par endocytose et transportées à travers le corps de la cellule et sécrétée à la surface de la cellule opposée (transyctosis). Livraison à travers les barrières cellulaires peut être facilitée en couplant la thérapeutique ou de leurs supports avec des agents de ciblage qui se lient spécifiquement à des marqueurs de surface cellulaire impliquées dans le transport. Ici, nous fournissons des méthodes pour mesurer l'ampleur et le mécanisme du transport NC à travers une barrière cellulaire modèle, la WHIch est constitué d'une monocouche de gastro-intestinal (GI) de cellules épithéliales cultivées sur une membrane poreuse située dans un insert Transwell. Formation d'une barrière de perméabilité est confirmée par la mesure de la résistance trans-épithéliale électrique (TEER), le transport transépithélial d'une substance de contrôle, et l'immunomarquage des jonctions serrées. A titre d'exemple, ~ 200 nm CN polymères sont utilisés, qui portent une cargaison thérapeutique et sont revêtues d'un anticorps qui cible un déterminant de surface cellulaire. L'anticorps ou de la cargaison thérapeutique est marqué avec ¹²⁵ I pour radio-isotope le traçage et les coordonnateurs nationaux marqués sont ajoutés à la chambre haute sur la monocouche de cellules pour des périodes variables. CN associés aux cellules et / ou transportés à la chambre sous-jacente peut être détectée. Mesure de libre ¹²⁵ I permet la soustraction de la fraction dégradée. La voie paracellulaire est évaluée par la détermination de changements potentiels causés par le transport NC pour les paramètres de barrière décrits ci-dessus. Transcellulaire transports is déterminé en abordant l'effet de moduler endocytose et la transcytose voies.

Introduction

Barrières cellulaires dans le corps agissent comme une passerelle entre l'environnement extérieur et compartiments internes. C'est le cas pour la muqueuse épithéliale séparant la surface externe exposée de la gastro-intestinal (GI) et dans la circulation sanguine ^1-3. Des barrières cellulaires représentent également l'interface entre le sang et le parenchyme et les composants cellulaires de tissus et d'organes. C'est le cas pour le revêtement endothelial interne des vaisseaux sanguins, telles que la barrière hémato-pulmonaire, la barrière hémato-encéphalique, etc ¹ La capacité à traverser ces barrières cellulaires dans l'organisme est essentielle pour la distribution efficace des agents thérapeutiques et diagnostiques dans la circulation et les tissus / organes où une intervention est nécessaire.

Pour améliorer la prestation des agents thérapeutiques ou diagnostiques, ces composés peuvent être chargés dans nanocarriers sous-micrométriques (CN). Ces véhicules d'administration de médicaments peuvent être formulés avec une grande variété dechimiques et des structures pour optimiser la solubilité du médicament, la protection, la pharmacocinétique, la libération et le métabolisme ^{de 4,5.} CN peut également être fonctionnalisé par affinité ou des fractions de ciblage (par exemple, des anticorps, des peptides, des aptamères, des sucres, etc) pour faciliter l'adhésion à des zones du corps où l'effet thérapeutique est requis ^2,6. Ciblage des CN déterminants exprimés à la surface des barrières cellulaires peut en outre faciliter le transport dans et / ou à travers ces garnitures ^2,6.

Le rôle de transporter sélectivement les substances entre deux environnements nécessite certaines caractéristiques uniques entre les couches de cellules. Une de ces caractéristiques est la polarité cellulaire, grâce à quoi la membrane apicale en regard de la lumière de cavités varie de la membrane baso-latérale orientée vers l'interstitium des tissus, par rapport à la morphologie de la membrane et de la composition des lipides, des transporteurs, et ^deux récepteurs. Une autre caractéristique implique junctio intercellulairens de raccordement des cellules adjacentes. La régulation des protéines qui forment des jonctions serrées, des molécules d'adhérence en particulier de jonction (confitures), occludins et claudines, moduler la fonction de la barrière pour permettre de manière sélective ou non le transport de substances entre les cellules, appelées le transport paracellulaire, permettant le passage des matériaux à partir du lumen de l'espace basolatéral ^3. Reliure de nombreux éléments naturels et synthétiques (leucocytes, des molécules, des particules et des systèmes de délivrance de médicaments) à des barrières cellulaires dans le corps peut provoquer ouverture cellule jonction, qui peut être transitoire et relativement inoffensifs ou plus prolongée et, par conséquent, dangereux avec un accès de substances indésirables à travers la barrière ^2,5,7-9. Par conséquent, cette voie peut être évaluée en mesurant la résistance électrique trans-épithéliale (TEER) et passive paracellulaire diffusion des molécules (ci-après appelé de fuite paracellulaire), grâce à quoi une diminution de la résistance d'un courant électrique ou une fuite paracellulaire accrue d'une inecomposé rt dans l'espace basolatéral indiquer ouverture des jonctions cellulaires, respectivement ^5,10,11. En complément de ces méthodes, l'une des protéines des jonctions serrées énumérés ci-dessus peuvent être colorées pour évaluer leur intégrité, où la coloration doit apparaître concentrée aux frontières cellule-cellule tout autour de la périphérie de la cellule ^5,10,12.

Alternativement, les systèmes d'administration de médicaments qui ciblent les déterminants de surface cellulaire spécifiques, tels que ceux associés à des fosses recouvertes de clathrine ou invaginations de la membrane en forme de flacon-disant cavéoles, peuvent déclencher l'absorption vésiculaire dans les cellules par endocytose, fournir une avenue pour l'administration de médicaments à des compartiments intracellulaires ^{5, 13.} En outre, l'endocytose peut conduire à la traite des vésicules à travers le corps de la cellule de mise sur le côté basolatéral, un phénomène connu sous le nom transyctosis, ou le transport transcellulaire ^14. Par conséquent, la connaissance de la cinétique et le mécanisme d'endocytose peut être utilisé pour exploiter une intracellulairend délivrance transcellulaire des médicaments, qui offre un mode de livraison relativement sûre et contrôlée par rapport à la voie paracellulaire. (Endocytose comme dans le cas de la molécule d'adhésion cellulaire (CAM) médiée) Le mécanisme d'endocytose peut être évaluée avec des modulateurs de voies classiques (clathrine et endocytose de la cavéoline-médiation, et macropinocytose) ou des voies non classiques ^5,13,15 .

Attendu que le trafic intracellulaire est souvent étudiée dans des puits ou des lamelles couvre-objet classiques, l'absence d'un compartiment basolatéral s'oppose à la polarisation de la cellule et la capacité d'étudier le transport à travers les couches de cellules. Pour surmonter cet obstacle, le transport à travers des monocouches de cellules a été longuement étudié en utilisant des inserts Transwell ^10,11,16,17, qui sont constitués d'une chambre supérieure (apicale), une membrane poreuse perméable, où les cellules se fixent et forment une monocouche étanche, et une plus faible (basolatérale) chambre (Figure 1). Dans cette configuration, le transport peut être mesurée dans l'apical-basolatéral à-direction par l'administration d'un traitement dans la chambre supérieure, à la suite du transport à travers la monocouche cellulaire et la membrane poreuse sous-jacente, et finalement la collecte du milieu dans la chambre inférieure, pour la quantification de matière transportée. Transport dans la direction basolatérale à apicale peut également être mesurée par administration initiale à la chambre inférieure et la collecte subséquente de la chambre supérieure ^5,10,12,16. Il existe diverses techniques pour vérifier la formation de la barrière de perméabilité sur transwells, y compris des dosages TEER et de transport paracellulaire, comme décrit ci-dessus. En outre, le filtre perméable à laquelle les cellules sont mises en culture peut être enlevé pour l'analyse d'imagerie (par exemple par fluorescence, confocal, microscope électronique), que en outre la validation du modèle de monocouche de cellules ainsi que le mécanisme de transport. Le choix du type de membrane, qui est disponible en différentes tailles de pores, les matériaux, et les zones de surface, dépend de divers factors tels que la taille des substances ou objets à transporter, le type de cellule, et la méthode d'imagerie ^16,18-20. Transwell inserts facilitent également la quantification précise et contrôlée du transport par rapport aux systèmes de mammifères complexes, comme les volumes des chambres et la zone de surface de la cellule sont des constantes connues. Bien que de nombreux facteurs impliqués dans la délivrance in vivo sont éliminés, y compris la présence de mucus intestinal, contrainte de cisaillement, les enzymes digestives, les cellules immunitaires, etc, cette petite échelle modèle in vitro fournit des informations préliminaires utiles concernant le transport.

A titre d'exemple pour illustrer l'adaptation de ces méthodes pour étudier le transport à travers les barrières cellulaires NC ^10,11,16,17, nous décrivons ici un cas où le potentiel de transport NC à travers l'épithélium gastro-intestinal a été modélisé en évaluant passage d'une livraison de drogue de modèle système à travers une monocouche de l'adénocarcinome colorectal humain epithelial (Caco-2) des cellules. A cette fin, caunes ont été cultivées dans des inserts Transwell, sur un pore de 0,8 um en polyéthylène téréphtalate (PET) filtre (diamètre 6,4 mm), qui est transparent et peut être utilisé pour l'imagerie par microscopie. L'état de la barrière de perméabilité est validé par la mesure de la TEER, le transport apical-basolatéral à-d'une substance de contrôle, l'albumine, la microscopie à fluorescence et la visualisation d'un élément des jonctions serrées, la protéine occludine. Un modèle de polymère ciblé NC est utilisé, composé de 100 nm, les nanoparticules de polystyrène non biodégradables. CN sont recouvertes par une adsorption de surface avec un anticorps ciblant seul ou une combinaison d'un anticorps de ciblage et un cargo thérapeutique, où l'une ou l'autre composant peut être marqué avec un radio-isotope ^125I pour le traçage. Dans l'exemple choisi, l'anticorps reconnaît la molécule d'adhésion intercellulaire-1 (ICAM-1), une protéine exprimée à la surface de l'épithélium gastro-intestinal (et d'autres), les cellules, ce qui a été montré pour faciliter le transport intracellulaire et transcellulaire o transporteurs de drogue de f et de leurs cargaisons ^21. La cargaison est l'alpha-galactosidase (α-Gal), une enzyme thérapeutique utilisé pour le traitement de la maladie de Fabry, une maladie de surcharge lysosomale génétique ^22.

Les CN enrobés, de l'ordre de 200 nm de diamètre, sont ajoutés à la chambre apicale sur la monocouche cellulaire et incubées à 37 ° C pendant différentes périodes de temps, après quoi, ¹²⁵ I, le CN peuvent être détectés associés à la monocouche cellulaire et / ou transportée vers la chambre basolatérale-dessous les cellules. Détermination supplémentaire de droits ¹²⁵ I permet la soustraction de la fraction dégradée et l'estimation des revêtu transports NC. Le mécanisme de transport est en outre évalué en examinant les variations de la barrière de perméabilité relative à la voie paracellulaire, par l'intermédiaire des paramètres décrits ci-dessus, alors que le transport transcellulaire est déterminée en examinant les changements dans le transport lors de la modulation des voies de l'endocytose et la transcytose.

ontenu "> Ces méthodes fournissent des renseignements précieux sur les modèles de barrière cellulaire, l'ampleur et la vitesse de transport d'un système de délivrance de médicaments, et le mécanisme de ce type de transport, permettant tout à fait l'évaluation du potentiel pour l'administration de médicaments à travers les barrières cellulaires.

Protocole

Une. La culture d'une monocouche de cellules dans TRANSWELL Inserts

1. Dans un niveau de biosécurité 2 cellule culture hotte stérile, placer 0,8 mm pores PET TRANSWELL inserts dans une plaque de 24 puits (4 puits par condition, la signification statistique) avec une pince. Tous les matériaux entrant dans la hotte doivent être stérilisés avec de l'éthanol.

Remarque: La taille des pores du filtre doit être sélectionnée en accord à la taille moyenne de la NC utilisées, pour permettre le transport à travers la membrane. En outre, pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, chaque condition expérimentale a besoin d'un minimum de quatre répétitions (puits) à l'intérieur de la même expérience, et un minimum de trois expériences indépendantes.

2. Préparer un milieu de culture cellulaire contenant du milieu DMEM supplémenté avec 4,5 g / L de glucose, sérum bovin fœtal à 15%, et 1% de Pen Strep, et chauffer à 37 ° C dans un bain d'eau.
3. Diluer adénocarcinome colorectal épithéliales humaines (Caco-2) cellules dans un milieu cellulaire et le lieu200 à 400 pi de la solution de cellules dans le (apicale) chambre supérieure de l'insert Transwell, à une densité de 1,5 x 10 ⁵ cellules / cm ^2. Remplir le (basolatéral) avec la chambre inférieure 700 à 900 ul de milieu cellulaire.
4. des cellules de culture à 37 ° C, 5% CO ₂ et 95% d'humidité pendant 16 à 21 jours, en remplaçant le milieu dans la chambre supérieure et inférieure tous les 3-4 jours, en utilisant les volumes indiqués à l'étape 1.3. Remplacer le milieu dans l'ordre suivant pour maintenir la pression au-dessus (plutôt que ci-dessous) de la monocouche cellulaire: aspirer le fluide de la chambre inférieure, aspirer le milieu de la chambre supérieure, remplir la chambre supérieure avec du milieu frais, et de remplir la chambre inférieure avec milieu frais.

2. Validation de l'IG épithéliale barrière de perméabilité Utilisation transepitheliale résistance électrique (TEER) et Immunocoloration des jonctions serrées

1. Pour le stockage à court terme (moins de 2 semaines), plonger les électrodes dans une solution STX100 d'électrolytetion (0,1-0,15 M KCl ou NaCl). Connecter le câble d'électrode à l'orifice d'électrode sur l'appareil EVOM volts ohms de telle sorte que le système est en court-circuit interne et l'électrode symétrie est conservée. Pour le stockage à long terme, rincer avec dH ₂ O et stocker dans un état ​​sec et sombre.
2. Pour stériliser les électrodes, immerger dans de l'éthanol pendant 15 minutes et laisser sécher à l'air pendant 15 sec. En variante, les électrodes peuvent être mémorisés dans une hotte à UV. Rincer les électrodes dans une solution stérile d'électrolyte (solution saline tamponnée de phosphate, PBS) ou de 0,1 à 0,15 M de KCl ou de NaCl solution, avant chaque mesure d'une résistance.
3. Avec l'appareil de mesure de tension ohm réglé sur la valeur de la résistance, de placer à la verticale des électrodes dans un puits contenant l'insert Transwell, avec le court-électrode dans la chambre supérieure et la longue chaîne de mesure dans la chambre inférieure touche le fond du puits. Une fois la lecture de EVOM stabilise, enregistrer la valeur de résistance (donné en ohms; Ω) de chaque bien.
4. Calculer la résistivité (résistanCE étalonnée par rapport à la zone; Ω × ² cm) des échantillons par soustraction de la résistance à l'arrière-plan (TEER des inserts Transwell sans cellules) et en multipliant par la membrane de surface. les valeurs de résistivité sont le plus souvent décrits dans la littérature. (Voir la discussion)
5. Répétez mesures tous les 1-2 jours jusqu'à ce que les valeurs TEER lieu à un maximum et plateau, indiquant la formation d'une barrière de perméabilité, ce qui prend généralement 2-3 semaines à partir du moment de platting cellulaire. Les valeurs et le temps nécessaire pour atteindre l'intégrité de la barrière Plateau TEER peuvent varier en fonction du nombre de passage de cellules.
6. Pour vérifier la présence de jonctions serrées dans des monocouches de cellules avec une grande TEER (supérieure ou égale à la valeur de seuil pour la formation de la barrière), fixer les cellules par incubation avec du paraformaldehyde froid à 2% pendant 15 min. Ensuite, laver les cellules avec du PBS et incuber pendant 30 min à température ambiante avec 1 pg / ml anti-occludine. Laver les cellules avec du PBS à nouveau et les incuber pendant 30 min à température ambiante avec 7,5 pg / ml de fAnticorps secondaires luorescently marqués. Utilisation des puits ayant un faible TEER en tant que témoin négatif pour la formation de la barrière.

Remarque: En tant que substitut pour l'anti-occludine, des anticorps dirigés contre les protéines des jonctions serrées alternatives peuvent être utilisées.

7. Exciser soigneusement la membrane de filtre sur lequel la monocouche fixe est fixé, et monter sur des lames pour l'imagerie utilisant épifluorescence ou la microscopie confocale.

3. Évaluer transepitheliale transport des transporteurs ciblées

1. Marquer l'anticorps (anticorps monoclonal de souris contre ICAM-1 et anti-ICAM, dans cet exemple) avec ¹²⁵ I de ciblage, comme décrit précédemment ^7. Utilisation dosage de Bradford pour estimer la concentration en protéines et un compteur gamma pour déterminer ^125I contenu sur l'anticorps, puis calculer l'activité spécifique en coups par minute (CPM) / mg de l'anticorps marqué.

Remarque: Pour contrôler la spécificité, retourbe par la procédure d'étiquetage de l'IgG de souris, qui sera utilisé pour préparer CN enrobés non ciblées. Pour étudier le transport d'une cargaison thérapeutique, répétez la procédure d'étiquetage de la cargaison, par exemple, l'alpha-galactosidase (α-Gal) dans cet exemple. Alternatives peuvent être utilisés pour l'agent de ciblage, le contrôle non spécifique, ou de la cargaison thérapeutique. D'autres méthodes peuvent également être utilisées pour marquer les composés et estimer la concentration des homologues marqués.

2. Couple le ciblage marqué anticorps (anti-ICAM dans notre exemple) à la surface du CN. Dans cet exemple, incuber nanobilles de polystyrène (diamètre de 100 nm) pendant 1 heure à température ambiante avec du ^{125I-anti-ICAM} pour permettre l'adsorption de surface, tel que décrit ^7.

Remarque: Pour le contrôle non spécifique, utilisez ¹²⁵ I-IgG. Pour tracer le transport d'une cargaison, utiliser une combinaison de ciblage anticorps et ¹²⁵ I-marqué fret (α-Gal dans notre exemple).

3. Centrifuger à 13 000 g pendant 3 min et retirez les homologues non revêtues dans le surnageant par aspiration. Remettre en suspension le culot contenant les CN enrobés en utilisant 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS par pipetage, et de traitement par ultrasons à faible puissance pour perturber agrégats de particules de potentiel (20-30 brèves impulsions).
4. Pour NC caractérisation, mesurer la taille, polydispersité, et ζ potentiel de particules enrobées en utilisant la diffusion dynamique de la lumière (en suivant les instructions du fournisseur), et de quantifier le nombre de ¹²⁵ I-marqué ciblant des molécules d'anticorps (par exemple, anti-ICAM) sur la surface des particules en utilisant un compteur gamma.

Note: Ces méthodes peuvent être répétées pour les homologues non spécifiques et thérapeutiques. La taille des particules enrobées est comprise d'environ 200 nm.

5. Ajouter ¹²⁵ CN I-anticorps (par exemple, ^{125I-anti-ICAM;} MDO 56 nCi / ml) à la chambre supérieure au-dessus de confluence des monocouches Caco-2 avec TEER et# 8805; 350 Ω x cm ² (voir discussion) sur fond (16-21 jours après le semis). Incuber à 37 ° C pendant une temps ou des intervalles plus désiré. Mesurer TEER (section 2.3) avant et après incubation à évaluer les effets de la CN sur la barrière de perméabilité.

Remarque: Cette procédure peut être répétée pour les homologues non spécifiques et thérapeutiques.

6. Recueillir moyen des chambres supérieures et inférieures et les laver une fois avec 0,5 ml de DMEM à 37 ° C (chambre haute) ou 1 ml dH ₂ O (chambre basse). Recueillir les lavages pour la mesure de la teneur totale de radio-isotope à l'aide d'un compteur gamma.
7. Pour la mesure de la fraction de cellules, exciser le filtre perméable, par exemple en utilisant une lame de rasoir pour couper les bords, et incuber dans un tube compteur gamma avec 1% de Triton X-100 pendant 10 min (pour libérer le contenu des cellules), avant de la cellule de mesure associée à la radioactivité totale.
8. Pour mesurer ¹²⁵ je reloué de CN pendant le transport ou en raison de la dégradation potentielle, premier mélange 300 ul d'échantillon (des fractions supérieures, inférieures ou cellulaires) avec 700 pi de 3% de BSA dans du PBS et 200 ul d'acide trichloroacétique (TCA). Incuber à température ambiante pendant 15 min. Entre-temps ce temps, mesurer la radioactivité totale de l'échantillon dans un compteur gamma.
9. Centrifuger les échantillons de TCA à 3000 xg pendant 5 minutes pour séparer les protéines intactes (pastille) à partir de la protéine dégradée ou ^125I fraction (surnageant). Quantifier la radioactivité de la libre ¹²⁵ je fraction et soustraire cette valeur de la radioactivité totale mesurée avant la centrifugation. Cela fournira la quantité de protéine marquée qui n'est pas dégradé.

4. Mécanisme de transepitheliale Transport de nanocarriers ciblées

1. Étiquette albumine avec ¹²⁵ I tel que décrit à la section 3.1 et précédemment rapporté ^7.

Note: L'albumine est un 66,5kDa et, par conséquent, une substance relativement grande. Même si un contrôle valable pour le transport passif des objets plus grands (par exemple 200 nm CN utilisés ici), il doit être remplacé par de plus petites molécules traceurs inertes d'étudier le transport des transporteurs de drogue petits (voir Discussion).

2. Pour évaluer le transport paracellulaire utilisant paracellulaire fuite de l'albumine, de la culture Caco-2 Des monocouches sur des inserts Transwell tels que décrits ci-dessus.
3. Au milieu de la chambre supérieure au-dessus de la monocouche cellulaire, ajouter soit ¹²⁵ I-albumine seul (contrôle négatif indiquant le niveau basal de fuite), ou ¹²⁵ Comités Nationaux d'anticorps ciblés I-albumine et non radiomarqués (tel que décrit à la section 3.5). Incuber à 37 ° C pour l'intervalle sélectionné de temps (s), ce qui devrait correspondre à ceux examinés lors de l'essai de transport NC. Mesurer TEER (section 2.3) avant, pendant et après l'incubation, collecter toutes les fractions pour un total ^{de 125} I et ¹²⁵ I gratuits mesures comme indiqué. dans la section 3 Remarque: outre concomitante de ¹²⁵ commande I-albumine et non radiomarqué CN IgG peut être utilisé comme un contrôle.
4. En tant que témoin positif pour l'ouverture des jonctions intercellulaires, ajouter milieux cellulaires contenant 5 mM de H ₂ O ₂ dans les chambres supérieure et inférieure de l'insert Transwell, et incuber à 37 ° C pendant 30 min. Ensuite, mesurez TEER (section 2.3) et ajouter ¹²⁵ I-albumine à la chambre supérieure pour les intervalles de temps choisis. Mesurer la TEER à différents points dans le temps tout au long de l'incubation pour identifier décroissance de la valeur TEER provoquée par H ₂ O _2-ouverture induite par des jonctions cellulaires.
5. Dans des expériences parallèles, évaluer transport transcellulaire, également appelé transcytose, de ¹²⁵ Comités Nationaux je ciblées par incubation confluentes Caco-2 monocouches soit avec 50 uM monodansylcadavérine (MDC; inhibiteur de l'endocytose clathrine), 1 pg / ml filipine (inhibiteur de caveolar endocytose médiée), 0,5 uM Wortmanndans (inhibiteur de la phosphatidylinositol 3-kinase [PI3K], impliqué dans macropinocytose), ou 20 uM [5 - (N-éthyl-N-isopropyl) amiloride] (IEAP, inhibiteur de macropinocytose et endocytose médiée ^CAM-15).

Note: ¹²⁵ I-IgG CN ^I-125 et de l'albumine peuvent être utilisés comme témoins négatifs pour l'effet de ces inhibiteurs, et d'autres méthodes (par exemple des techniques de siARN) peuvent fournir une inhibition plus sélective.

6. Mesurer TEER (section 2.3), avant, pendant, et après incubation des cellules avec des inhibiteurs et des matériaux radio-marqués, comme un contrôle supplémentaire de l'effet des inhibiteurs sur la perméabilité de la monocouche.

Résultats

Comme validation de notre modèle cellulaire pour étudier le transport transépithélial de CN ciblées, la figure 2 montre que les cellules Caco-2 Des monocouches de cellules étalées à une densité de 1,5 x 10 ⁵ cellules / cm ² atteint la confluence ~ Jour 12 et maintenu l'intégrité de la monocouche jusqu'au jour 18, indiqué par la TEER (Figure 2A). Cela a été validé par la présence de jonctions serrées occludines positif (figure 2B)

Discussion

En utilisant les méthodes discutées ci-dessus, un modèle cellulaire pour l'étude du transport des commandes numériques ciblées à travers les barrières cellulaires peut être établi, tel que l'exemple fourni pour Caco-2 des cellules epitheliales, ce qui est pertinent pour l'évaluation du transport de la lumière du GI dans le sang, dans le cas des systèmes d'administration de médicaments par voie orale. Mise en culture des monocouches de cellules épithéliales gastro-intestinal dans des inser...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90