Modelos e Métodos para avaliar Transporte de Drug Delivery Systems através das barreiras celulares

Resumo

Muitas aplicações terapêuticas necessitam de transporte seguro e eficiente de transportadores de drogas e suas cargas através das barreiras celulares no organismo. Este artigo descreve uma adaptação de métodos estabelecidos para avaliar a taxa e o mecanismo de transporte da droga nanocarriers (NCS) através das barreiras celulares, tais como o tracto gastrointestinal (GI) epitélio.

Resumo

Portadores Sub-micrométricas (nanocarriers; CN) aumentar a eficácia de medicamentos, melhorando a solubilidade, estabilidade, tempo de circulação, segmentação, e solte. Além disso, atravessar barreiras celulares no corpo é crucial tanto para a administração oral de CNs terapêuticos para a circulação e transporte a partir do sangue para os tecidos, onde é necessária a intervenção. NC transporte através de barreiras celulares é conseguido por: (i) a via paracelular, através de disrupção transitória das junções que interligam as células adjacentes, ou (ii) a via intracelular, onde os materiais são internalizados por endocitose, transportado através do corpo da célula e secretados na superfície da célula oposta (transyctosis). Entrega através de barreiras celulares pode ser facilitada pelo acoplamento terapêutica ou dos seus transportadores com agentes de direccionamento que se ligam especificamente a marcadores da superfície celular envolvidas no transporte. Aqui, nós fornecemos métodos para medir a extensão e mecanismo de transporte NC através de uma barreira celular modelo, which consiste em uma monocamada de gastrintestinal (GI), as células epiteliais cultivadas em uma membrana porosa localizada em um transwell insert. Formação de uma barreira de permeabilidade é confirmado pela medição da resistência transepitelial elétrica (TEER), o transporte transepitelial de uma substância de controle e imunomarcação de junções apertadas. Como um exemplo, 200 ~ CNs polímero nm são utilizados, que transportam uma carga terapêutico e são revestidos com um anticorpo que tem como alvo um determinante da superfície celular. O anticorpo ou carga terapêutico é marcado com ^125I, para um rastreio de radioisótopos e CNs marcadas são adicionadas à câmara superior sobre a monocamada de células durante períodos de tempo variáveis. CNs associados para as células e / ou transportadas para a câmara subjacente pode ser detectada. Medição de livre ¹²⁵ I permite a subtração da fração degradada. A via paracelular é avaliada determinando mudanças potenciais causados ​​pelo transporte NC para os parâmetros de barreira descritos acima. Transcelular i transportes determinado, abordando o efeito de modular endocitose e transcitose caminhos.

Introdução

Barreiras celulares no corpo agir como um gateway entre o ambiente externo e compartimentos internos. Este é o caso para o forro epitelial que separa a superfície exterior exposta do tracto gastrointestinal (GI) e pela corrente sanguínea ^1-3. Barreiras celulares também representar a interface entre o sangue e o parênquima e os componentes celulares de tecidos e órgãos. Este é o caso para o interior do forro endotelial nos vasos sanguíneos, tais como a barreira sangue-pulmão, a barreira sangue-cérebro, etc ¹ A capacidade de ultrapassar estas barreiras celulares no corpo é crucial para a entrega eficaz dos agentes terapêuticos e de diagnóstico para a circulação e tecidos / órgãos onde é necessária intervenção.

Para melhorar a entrega de agentes terapêuticos ou de diagnóstico, estes compostos podem ser carregados em nanocarriers sub-micrométricas (CN). Estes veículos de entrega de droga pode ser formulado com uma variedade dequímicas e estruturas para otimizar a solubilidade de drogas, proteção, farmacocinética, liberação, metabolismo e ^4,5. CNs também pode ser funcionalizada com afinidade ou porções de direccionamento (por exemplo, anticorpos, péptidos, aptâmeros, açúcares, etc), para facilitar a aderência às áreas do corpo em que é necessária a acção terapêutica ^2,6. Segmentação de CNs para determinantes expressas na superfície de barreiras celulares podem facilitar ainda mais o transporte para dentro e / ou através destes forros ^2,6.

O papel do transporte seletivamente substâncias entre dois ambientes exige certas características únicas entre as camadas de células. Uma tal característica é a polaridade da célula, pelo que a membrana apical voltada para o lúmen das cavidades varia de membrana basolateral orientada para o interstício de tecidos, no que diz respeito à morfologia e composição de lípidos, transportadores e receptores de membrana ^2. Outra característica envolve junctio intercelularns conectam células adjacentes. Regulamento das proteínas que formam junções apertadas, moléculas de adesão particularmente juncional (compotas), occludins e claudinas, modular a função de barreira para permitir seletivamente ou não transporte de substâncias entre as células, conhecidas como transporte paracelular, permitindo a passagem de materiais do lúmen para o espaço basolateral ^3. A ligação de vários elementos naturais e sintéticos (leucócitos, moléculas, partículas e sistemas de entrega de drogas) para barreiras celulares no corpo pode induzir a abertura de alvéolos-junção, que podem ser transiente e relativamente inócuo ou mais prolongada e, portanto, com o acesso de inseguro substâncias indesejáveis ​​através da barreira ^2,5,7-9. Por conseguinte, esta via pode ser avaliada pela medição da resistência eléctrica transepitelial (TEER) e difusão paracelular passiva de moléculas (aqui chamado vazamento paracelular), pelo que diminui a resistência à passagem da corrente eléctrica ou aumento de vazamento paracelular de um inert composto no espaço basolateral indicar abertura de junções intercelulares, respectivamente ^5,10,11. Para complementar estes métodos, qualquer uma das proteínas de junção apertadas listados acima podem ser coradas para avaliar a sua integridade, em que a coloração deve aparecer concentrada nas fronteiras célula-célula toda à volta da periferia da célula ^5,10,12.

Alternativamente, os sistemas de entrega de drogas que têm como alvo os determinantes da superfície celular específicos, tais como aqueles associados a poços revestidos por clatrina ou invaginações da membrana em forma de balão chamados caveolae, pode provocar absorção vesicular nas células por endocitose, proporcionando uma via para a entrega de drogas para compartimentos intracelulares ^{5, 13.} Além disso, a endocitose pode levar ao tráfico de vesículas em todo o corpo da célula para a liberação no lado basolateral, um fenômeno conhecido como transyctosis ou transporte transcelular ^14. Portanto, o conhecimento da cinética e mecanismo de endocitose podem ser utilizadas para explorar um intracelularnd entrega da droga para o espaço intracelular, o que oferece um modo relativamente seguro e controlado de entrega em comparação com a via paracelular. (Endocitose como é o caso da molécula de adesão celular (CAM) mediada) O mecanismo de endocitose podem ser avaliadas com moduladores de vias clássica (clathrin e endocitose mediada por caveolina e macropinocitose) ou rotas não-clássicos ^5,13,15 .

Considerando que o tráfico intracelular é frequentemente estudados em poços de padrão ou lamelas, a ausência de um compartimento basolateral opõe polarização celular e a capacidade para estudar o transporte ao longo das camadas de células. Para superar esse obstáculo, o transporte através monocamadas de células tem sido estudada usando transwell insere ^10,11,16,17, que consistem em uma câmara superior (apical), uma membrana permeável poroso onde as células unir e formar uma monocamada apertado, e um menor (basolateral) câmara (Figura 1). Nesta configuração, o transporte pode ser medido noapical-para-basolateral direcção através da administração de um tratamento para a câmara superior, na sequência de transporte, através da monocamada de células e membrana porosa subjacente, e por fim recolhendo o meio na câmara inferior de quantificação de material transportado. De transporte na direcção basolateral-para-apical, também pode ser medido por administração inicial para a câmara inferior e subsequente recolha da câmara superior ^5,10,12,16. Existem várias técnicas para verificar a formação da barreira de permeabilidade em transwells, incluindo TEER e ensaios de transporte paracelular, como descrito acima. Além disso, o filtro permeável no qual as células são cultivadas, pode ser removida para análise de imagens (por exemplo, por fluorescência, confocal, microscopia electrónica), como uma validação adicional do modelo de monocamada de células, bem como o mecanismo de transporte. A selecção do tipo de membrana, que está disponível em diferentes tamanhos de poros, os materiais, e áreas de superfície, depende de vários factors como o tamanho de substâncias ou objetos a serem transportados, tipo de célula, e método de imagem ^16,18-20. Transwell inserções também facilitar a quantificação controlada e precisa de transporte em comparação com sistemas de mamíferos complexos, como os volumes das câmaras e área de superfície celular são constantes conhecidas. Embora muitos fatores envolvidos na in vivo de entrega são eliminadas, incluindo a presença de muco intestinal, tensão de cisalhamento, enzimas digestivas, células do sistema imunológico, etc, esta pequena escala modelo in vitro fornece informações preliminares úteis sobre transporte.

Como exemplo para ilustrar a adaptação destes métodos para estudar o transporte NC através das barreiras celulares ^10,11,16,17, descrevemos aqui um caso em que o potencial de transporte NC através do epitélio GI foi modelada por avaliar passagem de um modelo de entrega de drogas sistema através de uma monocamada de adenocarcinoma colorrectal epitelial humano (Caco-2), as células. Para este fim, cvaras foram cultivados em inserções Transwell, numa poro de tereftalato 0,8 mM de polietileno (PET) de filtro (6,4 mm de diâmetro), que é transparente e pode ser usado para geração de imagens de microscopia. O estado da barreira de permeabilidade é validada medindo TEER, transporte apical-para-basolateral de uma substância de controlo, albumina, e a visualização de microscopia de fluorescência de um elemento das junções apertadas, ocludina proteína. Um modelo de polímero alvo NF é usado, consistindo de 100 nm, as nanopartículas de poliestireno não-biodegradáveis. CNs são revestidas por adsorção de superfície com um anticorpo alvo sozinho ou uma combinação de um anticorpo e uma carga alvo terapêutico, em que um ou outro componente pode ser marcado com ^125I, para um rastreio de radioisótopos. No exemplo escolhido, o anticorpo reconhece molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), uma proteína expressa sobre a superfície de GI epitelial (e outros), as células, que foram mostrados para facilitar o transporte intracelular e o espaço intracelular transportadores de drogas e suas cargas de f ^21. A carga é alfa-galactosidase (α-Gal), uma enzima terapêutica utilizada para o tratamento da doença de Fabry, uma doença de armazenamento lisossómico genético ^22.

Os CNs revestidos, de cerca de 200 nm de tamanho, são adicionados à câmara de apical sobre a monocamada celular e incubados a 37 ° C durante diferentes períodos de tempo, depois do que ¹²⁵ I em CNs podem ser detectados associados à monocamada de células e / ou transportada para a câmara inferior basolateral das células. Determinação adicional de ¹²⁵ I livre permite a subtração da fração degradada e estimativa de transporte NC revestido. O mecanismo de transporte é avaliada por meio de análise de alterações na permeabilidade da barreira pertencente à via paracelular, através dos parâmetros descritos acima, enquanto que o transporte transcelular é determinada por análise de alterações no transporte quando modulando vias de endocitose e transcitose.

ONTEÚDO "> Esses métodos fornecem informações valiosas sobre os modelos de barreira celular, a extensão ea taxa de transporte de um sistema de entrega de drogas, eo mecanismo desse transporte, permitindo completamente avaliação do potencial de liberação de fármacos através das barreiras celulares.

Protocolo

1. Cultura de uma monocamada de células em inserções Transwell

1. Em uma estéril, o nível de biossegurança 2 célula cultura capuz, coloque 0,8 milímetros de poros PET transwell inserções em uma placa de 24 poços (4 poços por condição, para significância estatística) com uma pinça. Todos os materiais que entram na capa deverá ser esterilizada com etanol.

Nota: O tamanho do poro do filtro deve ser escolhido de acordo com o tamanho médio da NC usado, para permitir o transporte através da membrana. Além disso, para obter resultados estatisticamente significativos, cada condição experimental requer um mínimo de quatro repetições (poços) dentro da mesma experiência, e um mínimo de três experiências independentes.

2. Preparar o meio de cultura de células contendo meio DMEM suplementado com 4,5 g / L de glicose, 15% de soro fetal bovino e 1% Pen Strep, e aquecer a 37 ° C em um banho de água.
3. Diluir adenocarcinoma colorretal epitelial humano (Caco-2) células em meio celular e lugar200-400 uL da solução das células na (apical) câmara da inserção transwell superior, a uma densidade de 1,5 x 10 ⁵ células / cm ^2. Encha a câmara inferior (basolateral) com 700-900 mL de meio de celular.
4. As células de cultura a 37 ° C, 5% de CO _2, e 95% de humidade durante 16-21 dias, substituindo o meio na câmara superior e inferior em cada 3-4 dias, utilizando os volumes indicados no passo 1.3. Substituir meio da seguinte forma a manter a pressão acima (em vez de seguir) a monocamada de células: aspirar o meio a partir da câmara inferior, aspirar o meio a partir da câmara superior, encher a câmara superior com meio fresco, e preencher a câmara inferior com meio fresco.

2. Validação do GI permeabilidade da barreira epitelial Usando resistência elétrica transepitelial (TEER) e imunocoloração de junções apertadas

1. Para o armazenamento de curto prazo (menos de 2 semanas), submergir eletrodos STX100 em uma solução eletrolíticação (0,1-0,15 M KCl ou NaCl). Ligue o cabo do eléctrodo para o eléctrodo de porta no medidor EVOM volt-ohm, de modo que o sistema é internamente em curto-circuito e o eléctrodo é mantido simetria. Para o armazenamento a longo prazo, lavar com dH ₂ O e armazenar em uma condição seca, escura.
2. Para esterilizar os eletrodos, imerso em etanol por 15 minutos e deixar secar ao ar por 15 s. Em alternativa, os eléctrodos podem ser armazenados em uma capa de UV. Lave os eletrodos em uma solução estéril eletrólito (solução salina tampão fosfato, PBS) ou 0,1-0,15 solução M KCl ou NaCl, antes de cada medição de resistência.
3. Com o medidor volt-ohm para definir a configuração da resistência, colocar verticalmente eléctrodos num poço contendo o inserto transwell, com o curto eléctrodo na câmara superior e a longo eléctrodo na câmara inferior de tocar no fundo do poço. Uma vez que a leitura EVOM estabiliza, registre o valor da resistência (dada em ohms; Ω) para cada poço.
4. Calcule resistividade (resisce normalizada para a área; Ω × cm ²⁾ de amostras subtraindo resistência fundo (TEER de inserções transwell sem células) e multiplicando por área de superfície da membrana. Os valores da resistividade são mais frequentemente descritos na literatura. (Ver discussão)
5. Repetir a medição a cada 1-2 dias, até que os valores TEER origem a um patamar máximo e, indicando a formação de uma barreira de permeabilidade, o que normalmente demora de 2-3 semanas a partir do momento do plaqueamento das células. Valores e tempo necessário para atingir a integridade da barreira Planalto Teer pode variar de acordo com o número de passagens celular.
6. Para verificar a presença de junções apertadas em monocamadas de células com elevado TEER (igual ou superior ao valor limiar para a formação da barreira), fixar as células por incubação com frio de paraformaldeído a 2% durante 15 min. Em seguida, lavar as células com PBS e incubar durante 30 min à temperatura ambiente com 1 ug / mL de anti-occludin. Lavar as células novamente com PBS e incubar durante 30 min à temperatura ambiente com 7,5 ug / ml de fanticorpos secundários luorescently-rotulados. Use poços com baixo TEER como um controlo negativo para a formação da barreira.

Observação: Como um substituto para o anti-ocludina, podem ser utilizados anticorpos para as proteínas de junção alternativos apertados.

7. Extirpar cuidadosamente a membrana do filtro em que a monocamada fixo está ligado, e montar em lâminas para imagens utilizando epifluorescência ou microscopia confocal.

3. Avaliando Transepitelial transporte das companhias alvo

1. Rotular o anticorpo (anticorpo monoclonal de rato contra ICAM-1, anti-ICAM, neste exemplo) a segmentação com ¹²⁵ I, tal como descrito anteriormente ^7. Use ensaio de Bradford para estimar a concentração de proteína e um contador gama para determinar o teor de ^125I no anticorpo, em seguida, calcular a actividade específica, em contagens por minuto (CPM) / mg de anticorpo marcado.

Nota: Para controlar a especificidade, reRepita o processo de etiquetagem por IgG do rato, que será utilizado para preparar CNs revestidos não-alvo. Para estudar o transporte de uma carga terapêutico, repetir o procedimento de etiquetagem de carga, por exemplo, alfa-galactosidase (α-Gal), neste exemplo. As alternativas podem ser utilizados para o agente de direccionamento, o controlo não específico, ou de carga terapêutico. Métodos alternativos podem também ser utilizados para marcar compostos e estimar a concentração dos homólogos marcados.

2. Par o direccionamento do anticorpo marcado (anti-ICAM, no nosso exemplo) para a superfície de NCs. Neste exemplo, incubar nanobeads de poliestireno (diâmetro de 100 nm) durante 1 hora à temperatura ambiente com ^{125I-anti-ICAM} para permitir a adsorção de superfície, como descrito ^7.

Nota: Para o controlo de não-específica utilizar ^125I-IgG. Para rastrear o transporte de uma carga, use uma combinação de segmentação de anticorpos e ¹²⁵ marcados com carga I (α-Gal no nosso exemplo).

3. Centrifugar a 13.000 xg durante 3 min e remover os homólogos não-revestidos no sobrenadante por aspiração. Ressuspender o sedimento contendo CNs revestidos usando 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS por pipetagem, e sonicado de baixa potência para perturbar os agregados de partículas potenciais (20-30 breves pulsos).
4. Para caracterização, NC, medir o tamanho, polidispersidade e ζ potencial de partículas revestidas, utilizando dispersão de luz dinâmica (seguindo as instruções do fornecedor), e quantificar a quantidade de ^125I-marcado alvo (por exemplo, moléculas de anticorpo anti-ICAM) na superfície da partícula usando um contador gama.

Nota: Estes métodos podem ser repetidos para homólogos não-específicos e terapêuticos. O tamanho das partículas revestidas varia em torno de 200 nm.

5. Adicionar ¹²⁵ CNs I-anticorpo, (por exemplo, ¹²⁵ I-anti-ICAM; NCs 56 nCi / ml) para a câmara superior por cima confluentes monocamadas Caco-2 com TEER &# 8805; 350 Ω × cm ² (ver discussão) sobre o fundo (16-21 dias pós-semeadura). Incubar a 37 ° C durante uma hora ou mais intervalos desejado. Meça TEER (Seção 2.3), antes e após a incubação para avaliar os efeitos de CNs na barreira de permeabilidade.

Nota: Este procedimento pode ser repetido para homólogos não-específicos e terapêuticos.

6. Recolha de meio, as câmaras superiores e inferiores e lavá-los uma vez com 0,5 ml de DMEM a 37 ° C (câmara superior) ou 1 ml _{de dH2O} (câmara inferior). Recolher as lavagens para a medição do teor total de radioisótopo utilizando um contador gama.
7. Para a medição da fracção de células, excisar o filtro permeável, por exemplo, utilizando uma lâmina de barbear para cortar em torno das arestas, e incubam-se num contador gama com tubo de 1% de Triton X-100 durante 10 min (para libertar o conteúdo das células), antes de medir a célula -associado radioactividade total.
8. Para medir ¹²⁵ I rearrendadas de CNs durante o transporte ou devido a potencial degradação, primeira mistura 300 mL de amostra (das fracções superiores, inferiores, ou celulares), com 700 mL de 3% BSA em PBS e 200 mL de ácido tricloroacético (TCA). Incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Entretanto, este tempo, medir a radioactividade total da amostra em um contador gama.
9. Centrifugar as amostras TCA a 3000 xg durante 5 minutos para separar a proteína intacta (pelete) a partir da proteína degradada ou ^125I fracção (sobrenadante). Quantificar a radioatividade da fração livre ^{de 125} I e subtrair esse valor de radioatividade total medido antes da centrifugação. Isto irá fornecer a quantidade de proteína marcada que não se degrada.

4. Mecanismo de Transepitelial Transporte de nanocarriers alvejados

1. Etiqueta albumina com ¹²⁵ I, como descrito na Seção 3.1 e relatado anteriormente ^7.

Nota: A albumina é um 66.5kDa e, por conseguinte, uma parte relativamente grande da substância. Embora um controle válido para o transporte passivo de objetos maiores (por exemplo, 200 CNs nm usado aqui), ele deve ser substituído por moléculas menores traçadores inertes quando se estuda o transporte de portadores de drogas menores (ver Discussão).

2. Para avaliar o transporte paracelular usando vazamento paracelular albumina, de cultura de monocamadas Caco-2 em inserções Transwell como descritos acima.
3. Para o meio de câmara superior por cima da monocamada de células, adicionar ou ^{125I-albumina} (controlo negativo que mostra o nível basal de vazamento), ou ¹²⁵ CNs alvo-anticorpo I-albumina e não-marcados (como descrito na Secção 3.5). Incubar a 37 ° C para o intervalo selecionado de tempo (s), que deve coincidir com os examinados ao testar transporte NC. Meça TEER (Seção 2.3), antes, durante e após a incubação, em seguida, recolher todas as frações para total de ¹²⁵ I e gratuitos ¹²⁵ medições I, conforme indicado. na Seção 3 Nota: adição concomitante de ¹²⁵ de controlo I-albumina e não radiomarcado CNs IgG pode ser usado como um controlo.
4. Como um controlo positivo para a abertura de junções intercelulares, adicionar meio celular contendo 5 mM de H ₂ O ₂ para as câmaras superiores e inferiores da inserção transwell, e incubar a 37 ° C durante 30 min. Em seguida, meça TEER (Seção 2.3) e adicionar ¹²⁵ I-albumina para a câmara superior para os intervalos de tempo selecionados. Medir TEER em vários pontos de tempo ao longo da incubação para identificar o valor TEER deterioração causada por H ₂ O _2-induzida abertura das junções celulares.
5. Em experiências paralelas, avaliar o transporte transcelular, também chamado transcitose, de ¹²⁵ CNs I-alvejados por incubação confluentes monocamadas Caco-2 com 50 uM monodansylcadaverine (MDC; inibidor de endocitose mediada por clatrina), 1 ug / ml Filipin (inibidor de caveolar endocitose mediada), Wortmann 0,5 fiMem (inibidor de fosfatidilinositol 3-quinase [PI3K], envolvido em macropinocitose), ou 20 pM [5 - (N-etil-N-isopropil) amilorida] (EIPA, inibidor da macropinocitose e mediada por CAM endocitose ^15).

Nota: ^125I-IgG CNs e ^{125I-albumina} podem ser utilizados como controlos negativos para o efeito destes inibidores, e outros métodos (por exemplo, técnicas de siRNA) pode proporcionar a inibição mais selectiva.

6. Medir TEER (secção 2.3), antes, durante e após a incubação de células com inibidores e materiais radioativos, como um controlo adicional para o efeito dos inibidores sobre a permeabilidade monocamada.

Resultados

Como validação do nosso modelo de célula para estudar o transporte transepitelial de CNs segmentados, a Figura 2 mostra que monocamadas Caco-2 de células plaqueadas a uma densidade de 1,5 x 10 ⁵ células / cm ² atingiram a confluência ~ Dia 12 e mantida a integridade monocamada até ao Dia 18, indicado por TEER (Figura 2A). Isto foi validado pela presença de junções apertadas occludin-positivo (Figura 2B) em monocamadas com alta TEER (390 ?...

Discussão

Utilizando os métodos discutidos acima, um modelo celular para estudar o transporte de CNs orientadas através das barreiras celulares pode ser estabelecida, tal como o exemplo dado para Caco-2 de células epiteliais, o que é relevante para a avaliação do transporte a partir do lúmen GI para a corrente sanguínea, no caso dos sistemas de distribuição de drogas orais. A cultura de monocamadas de células epiteliais GI em inserções transwell medição de TEER e fluorescência imunocoloração de junções apertad...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90