Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Özet

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Özet

Protein-DNA etkileşimleri birçok temel hücresel süreçlerin merkezinde yer alıyor. Örneğin, DNA replikasyonu, transkripsiyon, onarım ve kromozom organizasyon In vitro deneyler, DNA-bağlayıcı proteinlerin birçok çeşit fonksiyonu için ayrıntılı modeller oluşturmak için yardımcı olmuştur. Spesifik DNA yapıları ya da dizileri tanıyan DNA bağlayıcı proteinler tarafından yönetilir, henüz edilir , canlı hücresinin karmaşık ortamda bu süreçlerin ve onların örgütün kesin mekanizmaları çok daha az anlaşılır kalır. Yakın zamanda Fotoaktive Localization Mikroskopisi tek molekül izleme ile birleştirilmiş (PALM) kullanılarak canlı Escherichia coli hücrelerinde DNA tamir faaliyetleri ölçülmesi için bir yöntem geliştirmiştir. Bizim genel yaklaşım kromozomu ile dernek üzerine tek bir proteinin hareketlilik değişiklikle bireysel DNA-bağlama olayları tanımlar. Bağlı moleküllerinin protein fraksiyonu hareket için bir doğrudan niceliksel ölçümünü sağlartek hücre düzeyinde ivity ve alt-tabakalar ya da bağlanma siteleri bolluk. Burada, biz yöntemi kavramını açıklamak ve örnek hazırlama, veri toplama ve veri analizi işlemlerini göstermektedir.

Giriş

Bu protokol, Escherichia coli canlı hücreler protein-DNA etkileşimlerin doğrudan ölçülmesini anlatır. Bu kromozom (Şekil 1) bağlanan olarak teknik, tek bir floresan etiketli proteinin yayılma katsayısındaki bir değişiklik kullanır. Biz DNA polimeraz gecikmeli iplikçik çoğaltma ve eksizyon onarım yollar ¹ DNA boşlukları doldurur I (Pol1), bir prototip DNA-bağlayıcı protein kullanmak yöntemini göstermek için.

Süper çözünürlüklü floresan mikroskopi gelişi nanometre çözünürlükte hücrelerde moleküler yapıların görüntülenmesini sağlar. Fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (PALM) bir floresan devlet (Şekil 2) için bir başlangıç ​​karanlık durumdan aktif edilebilir floresan proteinleri kullanır. Sadece, tüm işaretli moleküllerin bir alt kümesi, bağımsız bir şekilde t, sıralı bir şekilde konumlarını belirlemek için herhangi bir zamanda devreyeo örnek ^2'de işaretli moleküllerin konsantrasyonu toplam. Molekül başına lokalizasyonu hassas esas olarak floresan Point Spread Fonksiyonu (PSF) büyüklüğüne bağlıdır toplanmış, fotonların sayısı ve arka plan sinyali ^3. Bu yöntemin bir çok uygulama hücresel yapıların görselleştirmenin geliştirilmesi üzerinde odaklanır. Izleme PALM tek molekül ile birleştirilebilir gerçekleştirilmesi ^4, doğrudan canlı hücreler içinde etiketlenmiş proteinlerin rasgele sayı hareketini izlemek için yeni yollar açılmıştır. Artan duyarlılık ve floresan mikroskoplar zamansal çözünürlüğü şimdi bakteriyel sitoplazmada ⁵ tek difüzyon floresan proteinleri izlenmesine izin.

Burada, PAmCherry, geri dönüşü olmayan 405 nm ışık ⁶ ile ışıma üzerine bir floresan duruma özelliğine sahip olmayan bir başlangıç ​​durumundan dönüştüren bir mühendislik floresan proteini kullanır. Aktive PAmCherry flüoroforlar görüntü olabilir561 nm uyarma ve photobleaching kadar birkaç kare için izlenen tarafından d. Biz Pol1 ve PAmCherry bir füzyon kullanan tek proteinlerin geçici DNA-bağlama olayları tanımlamak için yöntemin yeteneğini göstermektedir. Metil metansülfonat (MMS) ile hücrelerin tedavisi baz eksizyon onarım enzimleri ile aralıklı DNA alt tabakalar haline getirilmiştir DNA metilasyon hasara neden olur. Bizim yöntem MMS hasara ⁷ yanıt tek Pol1 moleküllerin bağlanma açıkça göstermektedir.

Protokol

1.. Hücre Kültürü

Steril kültür tüpleri ve pipet ipuçlarını kullanın. E. E. coli suşu AB1157 Pola-PAmCherry Pol1 bir C-terminal füzyon PAmCherry taşır. Füzyon et al Datsenko tarif edildiği gibi lambda-Red rekombinasyon kullanılarak yabani tip geni değiştirerek doğal kromozom sokulmuştur. Hücresel büyüme ve DNA hasar madde metil duyarlılık ile belirlendiği üzere, füzyon proteininin ⁸ İşlevsellik doğrulandı metansülfonat (MMS). Hücre soyunun yapımı hakkında daha fazla bilgi Uphoff et al. ⁷ bulunabilir, Datsenko et al. ⁸ ve Reyes-Lamothe et al. ⁹ hücre kültürleri otoflüoresanı azaltmak ve mikroskop lamı üzerine arka plan parçacıkların bulunduğu M9 minimal bir ortam içinde büyütülür. Alternatif olarak, besleyici açısından zengin tanımlanmış ortam ¹⁰ kullanılabilir.

1. Çizgi E. coli suşu AB1157 seçici antibiyotik (burada, 25 ug / ml kanamisin) bir Luria Broth (LB) agaroz plaka üzerinde dondurulmuş gliserol stokundan Pola-PAmCherry ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. Tek bir hücre koloniden bir 5 ml LB kültürü inoküle ve 3 saat boyunca 220 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de büyür.
3. 5 ml kültür 1:10,000 seyreltin minimal ortam (M9 aracı, MEM amino asit + prolin, MEM vitaminleri,% 0.2 gliserol) ve 37 ° C, gece boyunca 220 rpm 'de çalkalanarak inkübe edin.
4. Sonraki sabah, bir spektrofotometre kullanılarak optik yoğunluğun (OD) ölçmek ve OD 0.025, 5 ml taze minimal ortam kültür seyreltin. Erken üslü fazda (OD 0.1) 220 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de 2 saat boyunca büyütün.
5. 5 dakika boyunca 2300 x g'de santrifüj ile bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücre 1 ml konsantre edin. Süpernatantı ve 20 ul artık orta ve vorteks hücre pelletini.

2. Mikroskop Slide preparatiyon

1. DH ₂ O.% 1,5 düşük floresan agaroz çözüm hazırlayın Çözelti berraklaşıncaya kadar agaroz eritmek için bir mikrodalga kullanarak. Hafifçe yukarı pipetleme ve aşağı birkaç kez 2x minimal ortamda 500 ul ile erimiş agaroz çözüm 500 ul karıştırın.
2. Bir mikroskop lamel (Hayır 1.5 kalınlık) merkezine eşit agaroz çözüm yaymak. Bu agaroz soğutur önce kabarcıklar kaçınarak, hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
3. Ikinci bir lamel (Hayır 1.5 kalınlık) ile pad düzleştirmek. Arka plan flüoresan partikülleri çıkarmak için, lamelleri önce 1 saat boyunca 500 ° C'de bir fırın içinde yakıldı. Yakılan lamelleri alüminyum folyo ile kaplanmış, oda sıcaklığında hafta boyunca depolanabilir.
4. DNA hasarı deneyler için, 100 mM MMS ihtiva eden bir agaroz ped hazırlar. Adımda 2,1-2,3 in prosedürü izleyin, ama 100 mM M bir son konsantrasyon için, eritilmiş% 1.5 agaroz 500 ul ile karıştırılmadan önce, M9 ortam 500 ul 8.3 ul ekle MMSMS. (Dikkat! MMS toksik ve mutajenik ve eldiven, maske, gözlük, ve laboratuvar önlüğü ile ele alınması gerekir).
5. Yastığın en üst slayt çıkarın ve ped üzerine konsantre edilmiş hücre süspansiyonu 1 ul ekle. Kullanılmayan bir yandı lamel (Hayır 1.5 kalınlık, mikroskop objektif özelliklerini eşleşen) ile pad kaplayarak ve slayt çok hafifçe basarak hücrelerin hareketsiz. Hücreler agaroz ped kurumadan immobilizasyonun 45 dakika içinde görüntülü olmalıdır. Daha deneyler sırasında kurumasını önlemek için, agaroz yastıkları silikon contalar kullanılarak kapatılabilir.
6. DNA-hasar deneyler için, görüntüleme önce oda sıcaklığında nemli bir kap içinde 20 dakika boyunca 100 mM MMS ihtiva eden agaroz ped üzerinde hareketsiz hücreler inkübe edilir.

3. Mikroskopi Veri Toplama hazırlanıyor

PALM algılama ve tek floresan proteinleri kesin lokalizasyonu dayanır. Duyarlılığı ve optimal hizalamaMikroskop, veri kalitesi için kritik öneme sahiptir. Tek molekül floresan mikroskoplar genellikle lamel yüzeyinden ince bir bölümünde heyecanlı sadece floroforlar tarafından sinyal-gürültü oranını artırmak için Toplam İç Yansıma (TIR) ​​aydınlatma kullanır. E. içinde İşte, görüntüleme coli derece hafifçe uyarma ışık açısını azaltarak bir TIRF mikroskop elde edilebilir eğimli aydınlatma ¹¹ gerektirir. PAmCherry görüntüleme bundan başka, bir foto-aktifleştirme 405 nm lazeri ve 561 nm bir uyarım lazer gerektirir. Floresans emisyon 114,5 nm / piksellik bir piksel uzunluğunda elde büyütülerek CCD (EMCCD) kamera çarparak bir elektron kaydedilir. Optimum yerelleştirme hassasiyet için, piksel boyutu yaklaşık çok sayıda piksel üzerinde sinyal yayma olmadan yeterli örnekleme sağlamak PSF standart sapma genişliği aynı olmalıdır. Şekil 3 minimal PALM kurulum şemasını göstermektedir. Movie 1ısmarlama mikroskop inşa sürecinin bir izlenim verir,. aletin ayrıntılı bilgi için Uphoff ark ^7'ye bakın.

1. Rutin mikroskop hizalama yapılması. 405 nm ve objektif önünde 561 nm sürekli dalga lazer yoğunluklarını ölçün. 3,5 mW (~ 400 W / cm ²⁾ ve 10 μW (~ 1 W / cm ²⁾ 405 nm yoğunluğu için 561 nm yoğunluğunu ayarlayın. 0-10 μW 405 nm yoğunluğu kademeli olarak ayarlanmasını sağlayan bir sürekli değişken nötr yoğunluk filtresi tekerleğini kullanın. Deney başlangıcına kadar lazer aydınlatmasını kapatın.
2. Mikroskop sahnede örnek yerleştirin ve iletilen ışık mikroskobu modu (Şekil 4A) odağa hücreleri getirmek. EMCCD kamera kazanç aşırı maruz kalma tarafından kameraya zarar görmesini önlemek için kapalı olması gerekir.
3. Veri boyutunu azaltmak ve kamera Okuması hızını artırmak için bir kırpılmış FOV'yi tanımlayın.
4. Ortam ışığına ve sviç, numuneyi KapakEMCCD kamera kazanç ch.
5. (0.26 msn kamera okuma süresi dahil) 15.26 msn / kareye kare hızını ayarlamak. Tartışma bölümünde "Pozlama süresi ve uyarım yoğunluklarını" Bkz.
6. Karanlık bir arka plan sinyali (Şekil 4B) kontrol etmek için kamera verilerini görüntüler.
7. 561 nm lazer açın ve uyarma arka plan sinyali (Şekil 4C) kontrol edin.
8. Pol1-PAmCherry füzyon proteinlerinin fotoaktivasyonu için 405 nm lazer açın ve floresan PSFs görünen kadar yoğunluğunu artırabilir.
9. Lamel yüzeyine yakın numunenin sadece ince bir bölümünü aydınlatmaya uyarma ışın açısını ayarlayın.
   1. Bu amaçla, lazer ışını bir 100X NA 1.4 amacın arka odak düzlemi (Şekil 3) içine odaklanmıştır. Kirişin dik bir odaklama lensi tercüme uzak bir açı altında amaç çıkmak için ışın neden olan amaç merkezinden odağı taşır.
   2. Aifloresans yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak ve arka plan sinyalinin en aza indirmek için m. Katı TIR uyarma lamel yüzeyin 100 nm olan görüntü florofor için uygun olduğuna dikkat edin, ancak, görüntüleme DNA-bağlama proteinleri E ile ilişkili coli nucleoid 0.8 um derin aydınlatma kadar gerektirir.

4. Veri Toplama

Burada, bir PALM film edinimi için genel protokol açıklar. Aynı prosedür, hasar E'de Pol1-PAmCherry füzyon proteinleri görüntüleme için de geçerlidir coli hücreleri ve MMS ile sürekli DNA hasarı tedavi altında. Hücre başına farklı molekül ağırlıklı ya da kopya sayısının füzyon proteinleri için olan yöntemin uygulanması (Tartışma bölümüne bakınız) elde etme, farklı ayarları gerektirir.

1. Iletilen ışık mikroskobu modunda hücrelerin yeni bir görüş alanı (FOV) bulun ve görüntü odak. Hücre anahatları (Şekil 4A) kaydetmek için bir kamera görüntüsünü alın.
2. Ortam ışıktan örnek kapak ve EMCCD kamera kazanç açın.
3. 561 nm lazer açın ve veri toplama başlamadan önce birkaç saniye için lamel hücresel otoflüoresanı ve arka plan noktalar çamaşır suyu. Hücreler için yetiştirilen ve M9 ortam içinde görüntülenmiş ve çok az floresan arka plan genellikle yoktur lamelleri yanmış kullanarak, ancak prebleaching örneğin LB olarak zengin Hücreler büyüme ortamı içinde görüntülenmesi için yararlı olabilir. Yoğun bir aydınlatma kadar prebleaching minimumda tutulmalıdır hücreler için toksik olduğuna dikkat edin.
4. 15.26 msn / karede sürekli 561 nm uyarma altında bir PALM film satın alma başlayın.
5. 405 nm lazer açın ve yavaş yavaş / cm ² 1 W kadar ulaşan, film boyunca yoğunluğunu artırabilir. Hücresel otoflüoresanı neden yüksek 405 nm şiddetleri kaçının. Floresan moleküllerin yoğunluğu dikkat - bu düşük aktivasyon oranları tutmak için önemlidir PSFs açıkça böyleHer bir çerçeve (Şekil 4D-F) izole edilmiştir.
6. 10,000 kare / film (hücre başına yansıması için moleküllerinin sayısına bağlı olarak) kaydedin; bir film tipik olarak 2-3 dakika sürer ve FOV boyutuna bağlı olarak sabit disk alanı 0.5-1 GB gerektirir.
7. Birden FOV için satın alma işlemi tekrarlayın. Her FOV PAmCherry flüoroforlar fotoaktive olsun, çünkü sadece bir kez görüntülenmiş ve geri dönüşümsüz beyazlatılmış unutmayın.

5. Veri Analizi

Bir otomatik ve sağlam veri analizi çerçeve yönteminin performansı ve verimliliği için gereklidir. Biz MATLAB yazılmış özel yazılımı kullanın.

1. Crocker et al. ¹² 'de tarif algoritmaları kullanarak lokalizasyonu analizi yapın, Holden ve ark. ¹³ HoldenI et al. ¹⁴ ve Wieser et al. ¹⁵ PSFs ilk 7 piksel ile bir Gauss çekirdek kullanarak bir bant geçiren filtre görüntüde tespit edilirs çapı (Şekil 5A). Aday pozisyonları arka plan sinyali (Şekil 5B) ve 4.5 kat, standart sapma üzerinde olan en yüksek piksel yoğunluğunun PSFs karşılık gelir. Aday PSF başına lokal parlak piksel eliptik bir Gauss fonksiyonu (Şekil 5C) takılması için ilk tahmin olarak hizmet vermektedir. Serbest formda parametreler şunlardır: x-konumunda, y-konumunda, x-genişliği, y-genişliği, dönme açısı, genlik ve arka plan ofset. Eliptik Gauss maskesi PSF bulanıklaştırır ve deforme pozlama süresi sırasında molekül oluşturmaktadır.
2. Aynı FOV iletilen ışık mikroskobu görüntü üzerine PALM filmin bütün çerçeveler de elde edilen (x, y) lokalizasyonu çizilir. Pol1-PAmCherry Yerleşimleri E. merkezi alanı içinde görünmelidir coli hücreleri (Şekil 6A). Birçok lokalizasyonu hücrelerin dışında görünüyorsa, yerelleştirme eşiği çok düşük ayarlanmış veya numune arka plan floresan parçacıklar içeriyordu.
3. Otomatik izleme analizi için, Crocker et açıklanan algoritması MATLAB uygulama ark. ^12. (Tartışma bölümünde "Difüzyon analizi" bakınız) kullanılabilir. Bir kullanıcı-tanımlı izleme penceresi içinde sonraki karelerde görünen pozisyonları bir yörünge oluşturmak için bağlanır. Çok bölgedeki aynı pencerede meydana durumda, parça benzersiz adım uzunlukları toplamı minimize tarafından atanır. Tek parçacık izleme verilerinden difüzyon katsayıları hesaplanırken çeşitli hususlar ayrıntılı bir tartışma için, Wieser vd. ¹⁵ bkz
   1. Algoritması bir parça sırasında geçici yanıp sönen veya cevapsız lokalizasyonu için hesap için bir bellek parametresini kullanır. Burada, 1 kare bellek parametresi; yüksek değerler uzun ömürlü koyu devletleriyle florosforlar izleme için kullanılabilir.
   2. Aşağıdaki kalibrasyon adımları dayanan uygun bir izleme penceresi seçin. Pol1 için, 0.57 mikron (5 piksel) kullanabilirsiniz.
   3. Pencere parametrelerini izleme aralığı için izleme algoritması çalıştırın. Parça (Şekil 6B) bölünmüş değildir mümkün olan en küçük izleme penceresi belirlemek için izleme penceresinin bir fonksiyonu olarak ölçülen, hücre başına parça sayısını hesaplayın.
   4. Hücre içindeki molekül hareketinin dağılımını görselleştirmek için aynı FOV iletilen ışık mikroskobu görüntü üzerinde elde edilen parça çizilir. Pol1 parça tek hücre (Şekil 6C-D) içinde sınırlı difüzyon göstermesi gerekir.
   5. Parça bir kısmı hücreler arasında çapraz görünüyorsa bu izleme penceresi çok büyük ve / veya fotoaktivasyon oranı (Şekil 6E) çok yüksek olduğu seçildi çünkü ayrı moleküller yanlışlıkla bağlantılı olduğunu göstermektedir.
   6. Ardışık lokalizasyonu (Şekil 6F) arasındaki adım uzunluklarının kümülatif dağılımını çiziniz. Eğrisi yükselir ve yeterince büyük izleme pencereler için sorunsuz doyururPencere çok küçük seçildi eğer bir kesme kenarı gösterir.
4. Pol1 difüzyon özelliklerini analiz etmek, N adımların toplamda her parça için ardışık yerleşimli arasındaki ortalama karesel deplasman (MSD)) hesaplamak:
   MSD = 1 / (N-1), _{i = 1} Σ ^N-1 (X _{i +1} - x _i) ² + (y _{i +1} - y _i) ^2.
   Sadece MSD değerleri istatistiksel belirsizliği azaltmak için en az 4 adım (N ≥ 5 yerelleştirmeler) ile izler içerir.
5. Birden fazla kare (Şekil 6G) üzerinde deplasmanları hesaplayarak lag kez aralığında MSD değerleri eğrisi çizilir. MSD eğrisinin şekli gözlenen moleküler hareket (Şekil 6H) sınıflandırmak için yardımcı olabilir.
6. MSD parça başına görünür difüzyon katsayısı D * hesaplayın:
   D * = MSD / (4 Dt) - _loc ² / ¨ t σ.
   İkinci term (Wieser vd. ¹⁵ bakın, burada σ _loc = 40 nm ve Dt = 15.26 msn) tahmin yerelleştirme hata düzeltir.
7. FOV (Şekil 7A) Tüm parçalar arasındaki ölçülen D * değerleri bir histogram çizilir.
8. Parça başına ölçülen D * değere dayalı kromozoma bağlı görünen bireysel Pol1 molekülleri tanımlamak. Bağın popülasyonları ayırmak (merkezli keskin dağıtım D * ~ 0 mikron ² / sn) ve D * <0,15 mikron ² / sn bir eşik ayarlayarak serbestçe difüzyon moleküller (geniş dağıtım D merkezli * ~ 0.9 mikron ² / sn) ( Şekil 7A ve 7D) kırmızı barlar.
9. Hasarsız hücrelerinin (Şekil 7A-C) ve MMS (Şekil 7D-E) ile DNA hasarı tedavi altında hücrelerde lokalizasyonu, izleme, ve Pol1 için difüzyon analizi yürütmek. Ciltli parça fraksiyonu DN doğrudan sayısal olarak ölçülmesini sağlarIn vivo Pol1 bir onarım aktivitesi.

Sonuçlar

In vivo olarak, protein-DNA etkileşimlerini incelemek için izleme ışıkla aktive edilen tek bir molekül kavramı, Şekil 1 'de gösterilmiştir. PAmCherry füzyon proteinleri, canlı E'de algılanır Bir seferde, hücre başına daha az bir molekül bir frekansta 405 nm ışık ile davranışsal tek moleküller, ışıkla aktive olan bir sıralı bir şekilde coli hücreleri. Aktive moleküller sürekli 561 nm uyarma altında görüntülenmiş. Hücrede moleküler hareketin geri dönülmez ağartmanın kadar bir dizi kare yakındaki bölgeselleştirmelerini bağlayarak izlenebilir. DNA bağlayıcı proteinlerin difüzyon kromozom bağlanması üzerine yavaşlatıldığı için, D * iz başına elde edilen, görünen yayılma katsayısının doğrudan bireysel protein-DNA etkileşim ve raporlar.

Şekil 2, canlı E'de Pol1-PAmCherry füzyon proteinlerinin foto-aktifleşmesini gösteriyor coli hücreleri. O 405 nm yoğunluğunun etkisin floresan moleküllerin yoğunluğu, Şekil 4'te görülebilir. Yoğunluk sadece 405 nm yoğunluğu ile ancak ek aktivasyonu için kullanılabilir moleküllerin sayısına göre belirlenir değil unutmayın; kalan moleküllerin havuzu PALM film boyunca tüketilir.

Lokalizasyon analizi Şekil 5'te gösterildiği gibi bir PALM filmin her bir çerçevesi için gerçekleştirilir. Bu canlı hücrelerde, sabit hücrelerde veya bağlı moleküllerinde hareketsiz molekülleri kullanarak lokalizasyonu hassas ölçülür. Bizim satın alma ayarları teorik tahmini ³ ile anlaşarak, σ _loc = 40 nm bir yerelleştirme kesinlik verdi.

Elde edilen Pol1 lokalizasyonları genel olarak E uzaysal organizasyonu yansıtan, hücrenin merkezi alan (Şekil 6A) işgal coli ⁷ nucleoid. Pol1 çoğunluğu dif ekran hasar görmemiş hücrelerde izlerŞekil 6C'de gösterildiği gibi füzyon. Tipik bir hücre E başına yaklaşık 400 Pol1 moleküllerinin kopya sayısı ile uyumlu birkaç yüz Pol1 parça (Şekil 6D) içerir . coli hücre ^1. 6B ve Şekiller 6E-F, uygun bir izleme penceresi parametresini seçiminde rehberlik - izleme penceresi çok büyük ise, farklı moleküller yanlışlıkla bir parçaya bağlı olma olasılığı daha yüksektir; izleme penceresi çok küçük ise, parça uzun adımlarla bölünecektir. Pol1 için MSD eğrisi hücre hapsi (Şekil 6G) nedeniyle daha uzun gecikme süreleri kısa gecikme süreleri ve saturatları için doğrusal yükselir. Moleküler hareket farklı türleri MSD analizi ile tespit edilebilir. Directed hareket parabolik eğri verir, Brown hareketi düz bir çizgi ile karakterize edilir, kapalı difüzyon eğri bir düzlüğe ulaşır; hareketsiz parçacıklar için MSD eğrisinin bir kaydırmada l temsil ederocalization belirsizlik (Şekil 6H). Tek parçacık izleme ve sorun giderme ipuçları hakkında ek bilgi Arnauld vd. ¹⁶ bulunabilir

Daha önce eksojen DNA alkilleme hasarı ⁷ yanıt olarak Pol1 DNA onarım aktivitesini ölçmek için yöntem uygulanır. Pol1 of D * histogram molekülleri (Şekil 7A-C) difüzyon baskın bir nüfus gösterir hasar görmemiş hücrelerde izler. % 2.7 bağlı Pol1 moleküllerinin küçük bir kısmı muhtemelen gecikmeli iplikçik çoğaltma ve endojen DNA hasarının onarımı yer almaktadır. Sürekli 100 mM MMS hasar altında,% 13.8 (Şekil 7D) D * ~ 0 mikron ² / sn artış ile parça nüfusu. Bu izler baz eksizyon tamir yolunun bir parçası olarak tek nükleotid boşlukları doldurmak için DNA onarım sentezini gerçekleştirerek bireysel Pol1 moleküllerini temsil eder. Ciltli parça pozisyonları bireysel konumlarını göstermekDNA hasarı ve onarımı siteleri (Şekil 7E-F).

Şekil 1. Yöntemin grafik gösterimi. (A) floresan protein PAmCherry 405 nm ışık ile ışıma üzerine özelliğine sahip olmayan bir başlangıç ​​durumundan ışıkla aktive edilebilir. Parlak devlet 561 nm heyecanlı ve geri dönüşümsüz flüoroforun ağartıcılarının kadar 600 nm civarında floresan yayar. (B) fotoaktivasyon oranını kontrol sağlar görüntüleme herhangi bir zamanda yalnızca hücre başına tek bir davranışsal aktive PAmCherry füzyon proteini karanlık durumunda kalır henüz aktif edilmemiş ya da zaten ağartılmış moleküllere keyfi büyük havuz ise. (C) floresan molekülünün pozisyon izole PSF ve tr merkezinden belirlenirPhotobleaching kadar birkaç kare için acked. Birçok moleküllerin (D) parçalar sıralı bir şekilde kaydedilir. (EF), bir kromozom hedef sekans veya yapı ile bir DNA bağlayıcı proteinin etkileşim rastgele dağılan hareketi durur. Bağlanmış ve bağlanmamış molekülleri D * bir parça elde görünen yayılma katsayısı ile ayırt edilir. Bağlı moleküllerinin elde edilen fraksiyon, in vivo olarak bir DNA bağlayıcı proteinin aktivitesi için bir nicel ölçü verir. büyük resim görüntülemek için.

Şekil 2. Canlı E. Pol1-PAmCherry Foto-aktifleştirme bölgesinin coli hücreleri. Ölçek çubukları: 1 mikron. Şemalar her panelin altında gösterilmiştir. ( A) agaroz pad üzerinde hareketsiz hücrelerin ışık mikroskobu görüntüsü Bulaşan. (B) bir hücre içinde, tek bir PAmCherry flüorofor Phototactivating. (C) daha yüksek bir kuru foto-aktifleştirme flüoresan moleküllerinin sayısını artırır. (D) Bir PALM film Entegre PAmCherry floresan. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,. Işıkla aktive olan ve görüntüleme PAmCherry füzyon proteinleri için bir asgari PALM kurulum şematik D1:. Dikroyik ayna (örneğin 550 nm uzun geçiş). D2: Dichroic ayna (örneğin 570 nm uzun geçiş). L1: Ayarlama merceği. L2: TIR lens. L3: Tüp lens.1177/51177fig3highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 4. . 15.26 msn / çerçeve Ölçek çubukları ile bir PALM film Temsilcisi görüntüler: 1 mikron. (A) agaroz pad üzerinde hareketsiz hücrelerin ışık görüntüsünü Bulaşan. (B) lazerler ile EMCCD kamera ölçülen karanlık arka plan görüntüsü kapatılır. Fotoaktivasyonu önce sürekli 561 nm uyarma altında (C) Uyarma arka plan görüntüsü. (DF) Artmış 405 nm yoğunluğu sürekli 561 nm uyarma altında görüntülü PAmCherry yüksek fotoaktivasyon oranlarına yol açar. Kutulu alanlar aşağıda büyütülmüş gösterilmiştir. (D) Düşük 405 nm yoğunluğu (<1 μW) aktif FOV başına çok az floresan moleküller. (E) Orta 405yerelleştirme ve izleme analizleri için iyi bir PSF yoğunluğu nm yoğunluğu (~ 2 μW) fotoaktivasyon sonuçları. (F) Yükseköğretim 405 nm yoğunluğu (~ 10 μW) yerelleştirme ve izleme analizleri karartan bazı hücrelerde birden fazla floresan molekülü harekete geçirir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 5,. Yerelleştirme analizi İllüstrasyon. Ölçek çubukları: 1 mikron (A) Band-pass filtreleme sahte piksel gürültü kaldırır ve FOV genelinde yoğunluk Degradeleri düzleşir.. (B) Aday PSFs yanlış pozitif ve yanlış negatif algılamaları en aza indirmek için seçilmiş olan bir kullanıcı-tanımlı eşik dayalı filtrelenmiş görüntü tespit edilmiştir. Threshold arka standart sapma (sinyal-gürültü oranı, SNR) bölünmesiyle elde edilen bir aday pikselin en az yoğunluğuna karşılık gelir. (C) eşik iki boyutlu eliptik Gauss oturması için ilk yerelleştirme tahmin (turuncu çapraz) olarak hizmet geçer yerel parlak piksel. Ölçek çubukları: 0,5 mikron. Oluşan süper çözünürlük yerelleştirme (mavi çapraz) σ _loc ortalama hassasiyete sahiptir = 40 nm. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

.. Izleme analizi Şekil 6 İllüstrasyon Ölçek çubukları: 1 mikron. (A) bir örnek hücre içinde Pol1-PAmCherry her tespit lokalizasyonu. (B) iz sayısı tespitİzleme penceresinin bir fonksiyonu olarak, örneğin hücrede ed. Küçük izleme pencereleri parça yüksek sayıda artifaktüel yol açar molekül yörüngeleri, bölünmüş. Kesikli çizgi izleme penceresi parametresi (0.57 mikron, 5 piksel) bizim seçim gösterir - bu adımları tam dağılımını tespit ve sağlam farklı moleküllerin yörüngeleri tutmak arasında iyi bir uzlaşma sağlar. Tek Pol1-PAmCherry molekülünün (C) Örnek parça. (D) rastgele renklerle gösterilen tüm ölçülen izler. Izleme penceresi seçilmiş ise (E) İzleme eserler (burada 0.8 um, 7 piksel) veya kare başına PSFs yoğunluğu çok yüksek, çok büyük. Izleme pencereler için adım uzunlukları (F) kümülatif dağılımları: 0.34 mikron (3 piksel, kırmızı çizgi), 0.57 mikron (5 piksel, mavi çizgi), ve 0.80 mikron (7 piksel, yeşil hat). 0.34 mikron izleme penceresi 0,34 mikron daha uzun adımlar keser unutmayın ki açıkçaadımların tam dağılımını keser. 0.80 mikron izleme penceresi olduğu gibi 0.57 mikron izleme penceresi adımlar hemen hemen aynı dağılımı algılar. (G) MSD eğri Pol1 sınırlıydı difüzyon gösterir. Yönlü hareketi, Brown hareketi, sınırlı difüzyon ve hareketsiz partiküller için (H) şematik MSD eğrileri. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 7. Canlı E. Pol1 DNA tamir aktivitesinin doğrudan ölçümü . coli hücreleri Ölçek çubukları: 1 mm. (A) bir hasar görmemiş hücrelerin FOV (N = 4162 parça) 4 veya daha fazla adım tüm parçalar için görünür difüzyon katsayısı D * Histogram. B olarak sınıflandırılan moleküllerinin popülasyonunun ound kırmızı vurgulanır. Pol1-PAmCherry (BC), parçalar iletilen ışık mikroskobu görüntü üzerinde gösterilmiştir. Kendi difüzyon katsayısı göre bağlı olarak sınıflandırılan parçalar kırmızı ile gösterilmiştir. (D) D * (N = 2128 parça) görüntüleme önce 100 mM MMS ile bir agaroz ped üzerinde immobilize edilir ve 20 dakika inkübe edilen hücrelerde ölçülen Pol1 parçaları için histogram. DNA tamir yapan bağlı moleküllerin nüfusu kırmızı gösterilir. (EF) Pol1-PAmCherry kırmızı tek Pol1 DNA onarım olayların izlerini gösteren iletilen ışık mikroskobu görüntüde izler. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Film 1. Bir ısmarlama PALM kurulum bina.JoVE_Uphoff_Movie1.avi "target =" _blank "> Videoyu izlemek için buraya tıklayın.

Tartışmalar

Biz deney başarısı için birkaç önemli konuları tartışmak.

Seçim ve floresan füzyon proteininin ifadesi: foto-aktifleştirilebilen ve photoswitchable floresan proteinleri ¹⁷ büyük bir palet bulunmaktadır. Özel seçim mikroskop özellikleri, mevcut özellikle lazerler ve filtreler bağlıdır. 405 nm ve 561 nm kombinasyonu yaygın ışıkla aktive floresan proteinleri için idealdir. Biz monomerik olduğu için PAmCherry ⁶ seçtik ve hücrelerde herhangi bir toplama gösterdi. Ayrıca, geri dönüşü olmayan bir foto-aktifleştirme hücre başına protein kopya sayısını ölçmek için aktif florofor sayısını sayma sağlar. Bunun yerine bir plazmidden füzyon proteini ifade nedeniyle, vahşi tip lokusta füzyon proteinini kodlayan genin kromozom ekleme tercih ederim. Bu floresan ettik ile ilgili proteinin tam yerine sağlarrsion ve vahşi tip ekspresyon seviyesini korur.

Foto-aktifleştirme oranı: Bu ortalama hücre başına daha az bir molekül filmin herhangi bir çerçeve içinde floresan halde olduğu gibi foto-aktifleştirme hızını ayarlamak için önemlidir. Bu, 405 nm yoğunluğuna bağlıdır ve moleküllerin sayısı etkinleştirilmesini yaptı. Çok düşük görüntüleme yoğunluklarda, ancak, tüm moleküller filmin sonundan önce görüntülenmiş olacak ya da çok uzun bir film satın gerekir. Filmin kaydedilen çerçeve sayısı hücre başına füzyon proteinleri ve ikinci uyarma koşullarında PAmCherry ortalama ışıkla ağartma ömür boyu kopya sayısına bağlıdır. Pol1 ait kopya sayısı ~ 400 molekül / hücre ¹ ile üstel ışıkla ağartma süresi dağılımının ortalama değeri ~ 4 kare olmuştur. Kademeli olarak 405 nm yoğunluğunu arttırarak, aktivasyon eşit filmin 10000 çerçeveler üzerinden dağıtılır. Bu nedenle, her bir hücre occupPSFs ve 10,000 kare bir film izleme komplikasyonların küçük üst üste sağlanması, ~ 1.600 kare bir toplam floresan moleküller ile ied.

Pozlama süresi ve uyarım şiddetleri: En önemlisi, pozlama süreleri az hareket bulanıklığı ile keskin PSFs gözlemlemek için yeterince kısa olması gerekir. Ancak, kare hızı yerelleştirme belirsizlik ötesinde ardışık çerçeveler arasında gözlemlenebilir moleküler hareket verecek şekilde seçilmelidir, aksi takdirde önemli fotonlar takip oversampling tarafından israf edilmektedir. Bağlanmamış moleküllerinin hareketi lokalizasyonu belirsizlik nedeniyle bağlanan moleküllerin belirgin hareketi açıkça ayırt edilebilir olması için yeterince uzun bir zaman aralıklarında örneklenir gerekir. Maruz kalma süresi ayarlandığında, PSF şiddeti ayarlanabilir olmalıdır. PSF lokalizasyonu hassas bir çerçeve süresi boyunca algılanan fotonların sayısı ile artar. Yükseköğretim uyarma yoğunlukları foton emisyon oranı met artırmakt da photobleaching hızı ve arka plan sinyali. İstenilen yerelleştirme hassasiyet verir düşük uyarım yoğunluğunu kullanın. Pol1-PAmCherry için biz 15.26 msn / çerçeve ve 3,5 mW 561 nm uyarma (400 W / cm ²⁾ seçti. Bu (Uphoff ve ark. ⁷ Tamamlayıcı bilgiler bakınız) veri toplama öncesi ve sonrası hücre büyümesini ve morfolojisi izleyerek belirli görüntüleme koşulları için hücre canlılığı teyit etmek önemlidir.

Pol1 in vivo ⁷ aralıklı bir DNA alt tabakasına ~ 2 sn bağlayıcı bir zamanı sergiler; bu nedenle moleküllerin çoğunluğu bir parçanın tüm süre boyunca ilişkili veya ilişkisiz devlet ya olmasını bekliyoruz. Kromozom siteleri sitoplazmada Pol1 difüzyon (~ 1 mikron ² daha difüzyon katsayı büyüklüğü alt birkaç siparişleri (~ 10 ^-5 mikron ² / sn, Elmore ve diğ. ¹⁸⁾ çünkü bağlı moleküller aslında hareketsiz görünür / sn).

Difüzyon analizi: görünür difüzyon katsayısı D * tek tek parçaları MSD hesaplanır, istatistiksel hatayı azaltmak için 4 adımda (5 kare) az üzerinde ortalama. O ~ moleküllerinin% 75 tanımlanan görüntüleme koşulları için en az 5 kare içinde çamaşır suyu edin. Gibi kısa parçalar ilişkili ve ilişkisiz molekülleri ayırt etmek için yeterli istatistiksel kesinlik vermemektedir. Bununla birlikte, protein aktivitesi rapor bağlanmış ve bağlanmamış moleküllerinin nispi fraksiyonları analiz parçaların toplam sayısının bağımsızdır.

Belirsizlik bir molekülün ¹⁵ her lokalizasyonu için belirgin bir rasgele adım ekler, çünkü D * hesaplanmasında PSF yerelleştirme hatası (σ _loc) için hesap yararlıdır.

Bağlı ve difüzyon moleküllerin sınıflandırılması artırmak için, D * bot hesaplanması tavsiyeİki çerçeve, zaman içinde tek aşamalı değiştirmeler ve yer değiştirmeler h. Bu iki ayrı D * eşikleri ayarlamak mümkün olur: D * (15 msn) <0,15 mikron ² / sn ve D * (30 msn) <0.075 mikron ² / sn.

D * pozlama süresinde nedeniyle difüzyon bulanıklık parçaları ve hareket hücre hapsinde etkilenir belirgin difüzyon katsayısı olduğunu unutmayın. Doğru, tarafsız difüzyon katsayıları ayıklamak için, bir stokastik Brown hareketi modeli ^5,7 dayalı simüle verilere gözlenen hareketini karşılaştırmak yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Simüle veriler de veri analizi prosedürlerini test etmek için kullanılır.

Bu yöntemin olası uygulamalar: Bu kromozoma bağlanması üzerine bir proteinin hareketliliğinde değişiklik ile in vivo koşullarında protein-DNA etkileşim görselleştirme ve miktarının belirlenmesi için genel bir yaklaşım açıklanmıştır. DNA-ya da etkinlikleriOnarımında yer alan RNA bağlayıcı proteinler, replikasyon, transkripsiyon ve kromozom bakım böylece optik kırılma sınırın altında bir uzamsal çözünürlük ile tek-hücre seviyesinde gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Fotoaktive tek molekül izleme hücre başına birkaç işaretli moleküllerin kısıtlanır geleneksel izleme yöntemlerinin uzanır. In vivo moleküler difüzyon ölçen alternatif bir yöntem (sıkı bağlamak) Photobleaching sonra Floresan Kurtarma olduğunu. FRAP büyük hücreler küresel difüzyon özelliklerini ölçmek için çok yararlı olsa da, özellikle küçük bakteri hücreleri için, uzamsal olarak heterojen bir ortamda farklı hareketlilik ile çeşitli moleküler türlerin çözmek için yeteneği sınırlıdır.

Bu DNA-bağlama aktiviteleri ve E içinde farklı protein bir dizi alt-hücresel lokalizasyon ölçmek için izleme ışıkla aktive edilen tek molekül uyguladık coli Pol1, DNA ligaz, FIS protein, DNA da dahil olmak üzerepolimeraz III ^7, hem de kromozomlar protein MukB, E, ve F ¹⁹ yapısal bakımı. Bu yöntem aynı zamanda, diğer hücre tiplerine adapte edilebilir tahmin ediyoruz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a PAmCherry DNA-binding fusion protein			created by Lambda-Red recombination
MEM amino acids	Invitrogen	11130-051	minimal medium supplement
MEM vitamins	Invitrogen	11120-052	minimal medium supplement
Agarose	BioRad	161-3100	certified molecular biology grade
Microscope coverslips No 1.5 thickness	Menzel	BB024060SC	remove background particles by heating slides in furnace at 500 °C for 1 hr
Methyl methanesulfonate (MMS)	Sigma-Aldrich	129925	CAUTION: toxic
PALM setup	home-built		described in Uphoff et al.7
MATLAB	MathWorks		for data analysis and visualization
Localization software	custom-written, available online	http://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html	MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis. Cite Holden et al.13 if used in publication.
Tracking software	available online	http://physics.georgetown.edu/matlab/	MATLAB implementation by Blair and Dufresne. Cite Crocker & Grier12 if used in publication.