Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Özet

Hücre ve dokularda protein seviyeleri, çoğu zaman sıkı bir şekilde protein üretimi ve temizlenmesi dengesi ile düzenlenir. Fotoçevrim (FDAP) sonra floresans Bozunma kullanan proteinlerin temizlenme kinetiği deneysel in vivo olarak ölçülebilir.

Özet

Protein istikrar biyoloji birçok açıdan etkiler ve proteinlerin temizlenmesi kinetik ölçüm biyolojik sistemlere önemli bilgiler sağlayabilir. FDAP deneylerde, canlı organizmalar içinde protein açıklık ölçülebilir. İlgi dahilindeki bir proteini, photoconvertible floresan protein with in vivo ifade photoconverted ve zaman içinde photoconverted sinyal azalması takip edilir. Veriler daha sonra, protein yarı ömrünü tayin etmek için uygun bir açıklık modeli ile donatılmıştır. Önemlisi, organizmanın farklı bölümlerinde protein popülasyonlarının açıklık kinetiği bölmeli maskeleri uygulayarak ayrı ayrı muayene edilebilir. Bu yaklaşım, zebra balığı gelişimi esnasında salgılanan sinyal proteinleri ve hücre içi ve hücre dışı yarılanma ömürlerine belirlemek için kullanılmıştır. Burada, biz Zebra balığı embriyolar FDAP deneyler için bir protokol açıklar. Bu klirensi kinetiklerini belirlemek için FDAP kullanmak mümkün olmalıdırherhangi bir optik olarak erişilebilir bir organizmada bir taggable proteini.

Giriş

hücre ve organizmalardaki protein seviyeleri, üretim ve klirens oranlarına göre belirlenmektedir. Protein yarı ömürleri dakika gün ^1-4 aralığında olabilir. Birçok biyolojik sistemlerde, anahtar proteinlerin stabilizasyonu veya açıklık hücresel aktivite üzerinde önemli etkileri vardır. Hücre içi protein stabilitesi modülasyonu, hücre döngüsü ilerlemesinin ^5,6, gelişim sinyal ^7-9 apoptoz ¹⁰ ve normal fonksiyon ve nöronların ^11,12 ettirilmesi için gereklidir. Hücre dışı protein kararlılığı bir doku içinde dağılımı ve morphogens ^13,14 olarak salgılanan proteinler, kullanılabilirliğini etkiler.

Son birkaç yıldır, protein stabilitesi esas radyoaktif darbe-etiketleme ya da sikloheksimid kovalamaca deneyleri ¹⁵ kullanılarak hücre kültüründe değerlendirilmiştir. Böyle darbe kovalayıcı deneyler, hücreler ya da geçici olarak bir radyoaktif amino "darbe" maruzasit ön-maddeleri, yeni sentezlenmiş olan proteinlerle birleştirilmiştir, ya da protein sentezini inhibe sikloheksimid, maruz kaldığı. Kültürlenmiş hücreler, daha sonra farklı zaman noktalarında toplanır, ve ya (radyoaktif darbe kovalayıcı deneyler) otoradyografi ile takip immüno ya da (sikloheksimid deneylerinde) batı beneklemesinden zaman içinde protein açıklık ölçmek için kullanılır.

Konvansiyonel protein stabilitesi deneyleri bazı eksiklikleri vardır. İlk olarak, bu deneylerde proteinler genellikle endojen ortamlarda ifade edilmez, bunun yerine farklı türlerden elde edilen hücreler, doku kültürü içinde, bazen de. Stabiliteleri bağlam-bağımlı proteinleri için, bu yaklaşım sorunludur. İkinci olarak, zaman içinde tek tek hücreler ya da organizmalar protein açıklık takip etmek mümkün değildir, ve bu deneylerde elde edilen veriler, farklı zaman noktalarında farklı hücre popülasyonlarının ortalamasıdır. Tek tek hücreler başlamış olabilir bu yanaproteinin farklı miktarlarda farklı zamanlarda radyoaktif etiket ya da sikloheksimid almış olabilir, ya da farklı açıklık kinetiği, örneğin toplam veri yanıltıcı olabilecek olabilir. Son olarak, sikloheksimid takip deneylerinde durumunda, protein sentez önleyicisi ilave yapay protein kararlılığının ^16-18 değiştirebilir istenmeyen fizyolojik etkilere sahip olabilir. Bu eksiklikler, Fotoçevrim (FDAP) sonra photoconvertible proteinler Organizma ^19-25 canlı dinamik proteini açıklığını ölçmek için kullanan bir teknik Floresan Bozunma kullanılarak önlenebilir (FDAP teknik sınırlamaları için bölümüne bakınız).

Photoconvertible proteinler olan uyarma ve emisyon özellikleri hafif ²⁶ özel dalga boylarına maruz kaldıktan sonra değiştirmek floresan proteinleri vardır. Genel olarak kullanılan bir varyant Dendra2 başlangıçta eski bir "yeşil için kırmızı" photoconvertible proteindiratıf ve emisyon yeşil floresan protein benzer özellikler, fakat UV ışık "Fotoçevrim" maruz kaldıktan sonra uyarma-onun / emisyon özellikleri kırmızı flüoresan protein ^23,27 benzer hale gelir. Daha da önemlisi, Fotoçevrim sonra üretilen yeni bir protein photoconverted proteinin sadece bir havuz Fotoçevrim üzerine üretimi ve temizlenmesi ayrılmasına ve gözlem izin photoconverted protein ile aynı uyarım / emisyon özellikleri sahip olmayacaktır. Photoconvertible proteinleri ile ilgi proteinleri Etiketleme ve böylece darbe-etiket için sağlam, optik erişilebilir canlılarla proteinleri uygun bir yol sağlar.

FDAP deneyleri (Şekil 1A) 'de, ilgi konusu bir protein photoconvertible protein ile etiketlenir ve bir canlı organizmada (Şekil 1B) olarak ifade edilmiştir. Füzyon proteini photoconverted edilir ve zaman içinde photoconverted sinyal azalması flüoresan ile izlenirce mikroskobu (Şekil 1C). Veriler daha sonra füzyon proteininin (Şekil 1D) yarı ömrünü tayin etmek için uygun bir model ile donatılmıştır.

Burada anlatılan FDAP tahlil erken embriyogenez ¹⁹ döneminde Zebra balığı embriyolarının salgılanan sinyal proteinlerin hücre dışı yarım hayatlarını belirlemek için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım, canlı görüntüleme tolere eder ve herhangi bir taggable hücre içi ya da hücre dışı proteinin açıklık izlemek için kullanılabilecek herhangi bir şeffaf model organizma için adapte edilebilir. Burada tarif edilen tekniğin varyasyonları kültürlenmiş hücreler ^20,23 ve Drosophila ²² ve fare ²¹ embriyo olarak yapılmıştır.

Protokol

1. Bir Photoconvertible Fusion Construct ve Damariçi dechorionated Zebra balığı Embriyolar Yaratma

1. Daha sonra Müller ve ark., ^{2012, 19} olarak füzyon proteinini kodlayan başlıklı mRNA üretmek için, in vitro transkripsiyon kullanın yeşilden kırmızı photoconvertible protein (Tartışma) füzyonlanan ilgi konusu bir proteini ihtiva eden bir fonksiyonel yapı oluşturur.
2. Tek hücre aşamasında yaklaşık 30 zebra balığı embriyoların chorions kaldırmak için pronase kullanın. Seçenek olarak ise, el forseps ²⁸ kullanılarak embriyolar dechorionate.
   Not: Embriyolar daha sonra görüntüleme için dechorionated gerekir. Arzu edildiği takdirde, embriyolar görüntüleme hemen önce, daha sonra koryon enjekte edilmiş ve dechorionated edilebilir.
   1. Standart Zebra balığı embriyo orta ¹⁹ Streptomyces griseus gelen Pronaz bir 5 mg / ml stok solüsyonu olun. 10 dk proteaz eritmek için izin için hafifçe oda sıcaklığında çözüm Kaya. Kısım 2 m,-20 ° C'de mikrosantrifüj tüplerine L ve dondurularak.
   2. ~ 8 mi embriyo orta ihtiva eden bir 5 cm çapında bir cam ya da agaroz kaplı plastik Petri tabağına aktarın tek hücreli aşamada embriyolar. Çanak çözülmüş Pronaz stok çözeltisi 2 ml ilave edilir ve 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
   3. Dechorionated embriyolar yırtılmasına neden olur biriyle temas gibi, hava veya plastik embriyolar maruz bırakmayın. Embriyo ortamı ile 200 ml'lik bir cam beher. Orta daldırarak ise Petri kabı eğerek beher embriyolar transfer.
   4. Embriyolar beher altına yerleşmiş sonra, daha sonra beher içine taze embriyo orta dökün, embriyo orta çoğu dökmek. beher içine boşaltılarak orta hafif dönen embriyolar zayıflamış chorions kaybetmenize neden olur.
   5. Adımı yineleyin 1.2.4.
3. Bir Alevli ucu bir cam Pasteur pipet kullanarak bir agaroz kaplı enjeksiyon çanak ²⁹ dechorionated embriyolar transfer. Yananpipet yaralandı embriyolar tırtıklı kenarları engeller.
4. (Şekil 1B, önerilen mRNA ve Alexa488-dekstran tutarlar için Tartışma) mRNA ve 3 kDa Alexa488-dekstran konjuge ^29,30 Eş-enjekte. Bölünme başlar kez bile mRNA dağılımını ve floresan boya sağlamak için hücrenin (değil sarısı) merkezine doğrudan enjekte edilir.
   Not: Alexa488 sinyal hücre içi ve hücre dışı floresan ayırt etmek için bölmeli maskeleri oluşturmak için veri analizi sırasında kullanılan olacaktır.
5. Embriyo maddesi ile dolu bir altı-çukurlu, plastik çanak 1-2% agaroz kaplı oyuk transfer enjekte embriyolar. Embriyolar geç küre sahne ³¹ (yaklaşık 5 saat sonra döllenme) ulaşana kadar 28 ° C'de karanlıkta inkübe edin. Steromikroskopla embriyolar her biri 2 saat kontrol edin ve ölen embriyolar tarafından oluşturulan herhangi bir enkaz kaldırmak.

2. P Zebra balığı Embriyolar MontajBir Ters Konfokal Mikroskop üzerinde hotoconversion ve Görüntüleme

1. 04:59 sağlıklı embriyolar tespit ve çanak bunları kaldırmak için bir Alevli ucu ile bir cam Pasteur pipet kullanmak için Stereomikroskopta kullanın.
2. Yavaşça 1x Danieau embriyo orta eridi% 1 düşük erime noktası agaroz ~ 1 ml içeren bir mikrosantrifüj tüp içine embriyolar çıkarmak (Şekil 2A) (Malzemeler Listesi bakınız).
   Not: Agaroz, 40 ve 42 ° C arasındaki bir sıcaklığa sahip olmalıdır; yüksek sıcaklıklar embriyolar zarar verebilir.
3. Bazı agaroz ile birlikte geri pipet içine embriyolar çizin. Yavaşça bir cam alt çanak (Şekil 2B) kapak camına agaroz ve embriyolar çıkarmak. Kapak cam kalınlığı konfokal mikroskop hedefi ile uyumlu olduğundan emin olun.
   1. İsterseniz cam pipet yeniden kullanın. Pipet dışarı kalan agaroz temizlemek ve yukarı ve aşağı hızla tıkanma, pipet embriyo orta önlemek için.Aşağıdaki Bu amaçla stereomikroskop embriyo ortamının ~ 5 ml ile dolu bir 15 ml'lik tüp yerleştirin.
4. Hayvan kutup (blastoderm) cam kapak bakacak şekilde embriyolar konumlandırmak için bir metal prob kullanın. Agaroz 20-30 saniye içinde katılaşmaya beri hızla çalışın. Embriyolar 'pozisyonları izlemek ve agaroz sertleşir kadar gerekli yeniden ayarlamak için stereomikroskopta kullanın.
5. Embriyo istenilen sayıda monte edilene kadar tekrarlayın 2,1-2,4 adımları.
   Not: Tipik bir deneyde, dört ya da beş embriyolar her içeren dört agaroz damla kapak camına kolayca uyum sağlayacaktır. Yaklaşık 16 embriyolar tek ideal bir deneyde (Şekil 2C) sırasında görüntülenebilir.
6. Agaroz katılaşmış sonra, 1x Danieau embriyo orta ile cam alt çanak doldurun.

3. Photoconverting ve Photoconverted Sinyal azalması Ölçme

Bir 25X veya 40X su amacı iboyut ve zebra balığı embriyoların kırılma endeksi için uygun s. Su, beş saatlik deney sırasında buharlaşır beri, su yerine gerçek su gibi aynı kırılma indeksi ile daldırma yağı kullanmak en iyisidir. Daldırma yağı bir su (değil yağ) amacı ile kullanılmak üzere tasarlanmış olduğundan emin olun.

1. Objektif ve kapak cam arasındaki yağ filmi görüntüleme sırasında farklı embriyo pozisyonlara sahne hamle olarak kırmak olmaz sağlamak için objektif immersiyon büyük bir damla yerleştirin. Çanak zaman sahne hamle kayması olmaz ki güvenli sahneye cam alt çanak yerleştirin. Mümkünse, 28 ° C, zebra balığı gelişimi için en uygun sıcaklıkta bir ısıtılmış bölmesi kullanırlar.
2. Konfokal mikroskop yazılım paketinde her embriyonun konumunu tanımlayın. Her embriyo z-derinliğini ayarlayın ve her embriyo kabaca aynı uçağı hedef çalışmayın.
   Not: Yaklaşık 30 mikron hayvan kutup bir gitmek olduğunuEmbriyonun kuşatıcı tabaka önlenebilir, bu derinlikte beri od derinliği, görüntüleme alanı maksimize edilir ve ışık saçılması düzeydedir. ~ 3.3 um bir kalınlığa sahip tek bir optik dilim yeterli veri sağlar; z-yığını (bakınız Bölüm 5) elde etmek için herhangi bir ihtiyaç vardır.
3. Deney sırasında iki sinyal toplayın: Alexa488-dekstran "yeşil" sinyali eşlenik hangi photoconverted sonra hücre içi ve hücre floresan-ve füzyon proteini "kırmızı" sinyali izole veri analizi sırasında kullanılacaktır.
   1. 488 nm lazer kullanarak Alexa488 Excite ve ~ 500 ve 540 nm arasında yayılan floresan toplamak. Not: Fotoçevrim sonra çok sayıda yeşil için kırmızı photoconvertible proteinler (ör Dendra2) bir 543 nm lazer ile uyarılmasına ve ~ 550 ve 650 nm arasında floresan yayabilir. Kullanılan photoconvertible proteine ​​dayalı olarak gerekli ayarlayın.
4. Edinme "ön-Fotoçevrim"Görüntüleri ve görüntüye uygun görüntüleme koşulları (adım 3.2) daha önce tanımlanmış pozisyonların her konfokal mikroskop yazılımını yapılandırmak beş saatlik zaman kurs için her 10 veya 20 dakika (bakınız Bölüm 5 ve Tartışma).
5. Füzyon proteinini photoconvert için, 2 dakika boyunca% 100 çıkışında bir ~ 300-400 nm eksitasyon filtreli bir cıva arklı lambadan gelen UV ışığı embriyo grupları 10X objektif geçmek ve maruz kalmaktadır. . Tekdüze Fotoçevrim (Bölüm 5) teşvik etmek z-ekseni boyunca odak kayması daldırma yağ Fotoçevrim sırasında 10x objektif üzerine damlamamasını emin olun.
   Not: Fotoçevrim sırasında odaklama kaydırma deneyi arasında değişkenlik önlemek için otomatik olarak yapılabilir.
6. Hemen Fotoçevrim sonra geri 25X veya 40X objektif geçin. Adım 3.2 daha önce tanımlanmış pozisyon hala doğru olduğundan emin olun. Çanak photoconv sırasında kaymıştır Eğerersion, embriyoların pozisyonları yeniden tanımlamak.
   1. Adım 3.4 oluşturulan programını başlatın ve görüntüleme 5 saat devam etmesine izin. Fotoçevrim ve her embriyo için görüntüleme başlangıcı arasında geçen süre unutmayın.
7. Bazen deney kontrol. Danieau en ortamının seviyesini izlemek ve gerekirse daha eklemek. O durdu, eğer yazılımı yeniden başlatın.
8. Katlanarak azalan modeli asimptota tahmin etmek için veri analizi sırasında kullanılacak eşiğe değerlerini belirlemek için, deneyde Alexa488-dekstran ancak mRNA enjekte edilmiş bazı embriyoları içerir. Ayrıca müteakip veri analizi sırasında kullanılacak alet gürültü, belirlemek için, bir numunenin yokluğunda bir görüntü kazanır.

4. PyFDAP kullanma Veri Analizi

1. Görme her embriyo zaman ders veri setleri inceleyin. Imag sırasında ölen embriyolar veri setleri atınphotoconverted sinyalin çok düşük seviyelerde olması, ya da alışılmadık bakmak ve hareketli ve (yaralı veya hasta embriyoların tipik) bölünmesi durduruldu hücre bölgeleri ihtiva önemli ölçüde değiştirdi ing,.
   Not: Bazen, immersiyon kabarcıkları veya diğer eserler bir başka kullanışlı veri kümesi içinde bir ya da iki resim görünecektir. Eserler içeren herhangi bir resim Not; daha sonra atılır ve bu veri setinden diğer zaman noktaları yine analiz edilebilir.
2. FDAP verilerini analiz etmek için Python tabanlı yazılım paketi PyFDAP kullanın. PyFDAP her görüntünün ortalama hücre içi ve hücre dışı kırmızı floresans yoğunluğunu belirlemek ve katlanarak azalan işlevi ⁵⁶ (Şekil 3) ile veri oturtulması ile yarı ömürleri hesaplar.
   1. PyFDAP İndir (bkz Malzeme Listesi).
   2. Kullanım PyFDAP hücre içi ve hücre dışı photoconverted sinyal (Şekil 3A, B) ayırmak için. BizeBir hücre içi maske oluşturmak için, kesinlikle içi olan Alexa488 sinyali, e. Ortalama dışı yoğunluğunu hesaplanırken düşünülen hücre içi piksel engellemek için gelen kırmızı kanal görüntü bu maskeyi uygulayın. Ortalama hücre içi yoğunluğunu ölçmek için, maske ters.
   3. PyFDAP, adım 4.2.2 oluşturulan maskeli görüntüleri. Görme bu görüntüleri incelemek ve maskeler doğru dışı alandan hücre içi (bu nadir olmalı ayırt etmeyen veri setleri atmak; o hücre zarları dışı uzay maskeli edildiği görüntülerde yer almaktadır dikkat ancak eşikleme değiştirerek kaldırılmış olabilir algoritması ya da bir zar maske sokulması (örn kullanılarak membran CFP)). Ayrıca adım 4.1 tanımlanan eserler (örneğin, immersiyon kabarcıkları) içeren herhangi bir tek görüntüleri atın.
   4. EAC ortalama hücre dışı ve hücre içi floresan yoğunlukları hesaplamak için PyFDAP kullanarakh görüntüsü. PyFDAP özetlenebilir toplam piksel sayısına göre maske ve bölme dışında kalan piksel yoğunlukları toplanmasıyla bu ortalamalar hesaplar.
   5. Aşağıdaki üstel fonksiyonu ile floresan verilerini (Şekil 3C) Fit:
      
      t, zamandır sonrası Fotoçevrim, C (t), t, belirli bir değerde yoğunluğu olduğu, c, _0, t = 0 yoğunluğu, k temizlenme hızı sabittir, ve y, ₀ fonksiyonu floresan gibi yaklaşımlar asimptot olan azaltır (Şekil 1D). y, ₀ adım 3.8 ¹⁹ ölçümlere göre kısıtlanabilir.
   6. Aşağıdaki ilişkiyi kullanarak temizlenme oranı sabitleri (k) hücre dışı ve hücre içi protein yarı-ömürleri (τ) hesaplamak için PyFDAP kullanın:
      

5. Kontrol Deneyleri foto ağartıcı, istenmeden Fotoçevrim ve Fotoçevrim üniformluğunu değerlendirmek için

1. Değerlendirme photobleaching
   Not: ışıkla ağartma ilgili proteinin klirens ek olarak floresan protein ağartma özelliklerini yansıtan, flüoresans yoğunluğunda bir suni kaybına neden olabilir.
   1. Mümkün photobleaching değerlendirmek görüntüleme ve görüntüleme arasında 20 dakika aralıklarla (Şekil 4) ile ikinci sette arasında 10 dakikalık aralıklarla FDAP deneyler bir set yapmak. Bölüm 4'de tarif edildiği gibi PyFDAP kullanıldığı deneylerde her iki seti verilerini analiz edin.
   2. 10 ve 20 dakika süre deneyler yarı ömürleri karşılaştırın. Daha uzun yarılanma ömürleri 20 dakika süre deneyler önemli photobleaching gösterir. Her iki deneyden olan yarı-ömürleri aynı ise, ışık birimiobleaching önemli bir endişe değildir.
   3. Alternatif olarak, hemen Fotoçevrim sonra ~ 30 görüntülerin bir dizi satın alarak photobleaching değerlendirmek. Flüoresans yoğunluğunda önemli bir azalma önemli photobleaching gösterir.
   4. Photobleaching tespit edilirse, alt lazer gücünü kullanmak görüntüleme süresini azaltmak, ya da bir daha ışığa photoconvertible protein ³² kullanmayı düşünün.
2. Yanlışlıkla Fotoçevrim değerlendirilmesi.
   Not: Dendra2 488 nm aydınlatma ²⁷ kullanılarak photoconverted edilebilir. 488 nm lazer ile verici Alexa488 ilgili proteinin belirgin yarı ömrü aşama 3.3.1 yanlışlıkla Fotoçevrim ve bu nedenle suni artış tarif edildiği gibi zaman mümkündür. Ancak bizler ve başkaları ³³ 488 ​​nm aydınlatma zebra balığı embriyolar Fotoçevrim verimsiz bir yöntem olduğu bulunmuştur.
   1. Yersiz Fotoçevrim tespit etmek için aşama 5.1.1 tarif kontrol deneyini kullanarak. 10 ve 20 dakika süre deneyler yarı ömürleri karşılaştırın. 20 dakika süre deneylerden daha kısa yarı ömürleri önemli ölçüde istenmeyen Fotoçevrim göstermektedir. Her iki deneylerden yarı ömürleri aynı ise, yanlışlıkla Fotoçevrim önemli bir endişe değildir.
   2. Yanlışlıkla Fotoçevrim tespit edilirse, Dendra2 photoconverting yanlışlıkla önlemek için daha düşük bir 488 nm lazer gücü ve daha kısa görüntüleme kez kullanmak.
3. Fotoçevrim tekdüzelik değerlendirilmesi.
   Not: Fotoçevrim embriyo hayvan kutbuna doğru bastırılmaktadır ise, floresan azalma derin düzlemler (Şekil 5A); proteinin difüzyon ya da hücre hareketi ile etkilenecektir.
   1. Fotoçevrim düzgün olup olmadığını belirlemek için, (hücre dışı füzyon proteinleri ile deneyler için), salgılanan, photoconvertible protein ya da (hücre içi füzyon proteinleri ile deneyler için), sitoplazmik photoconvertible proteini ifade eder. Her zamanki gibi Photoconvert ttavuk 80 dakika boyunca her 20 dakikada blastodermin en kapsayan z-yığını kazanır.
   2. Fotoçevrim hayvan kutup karşı önyargılı ise, derin düzlemlerde floresan yoğunluğu nedeniyle difüzyon veya hücre hareketi (Şekil 5B) zamanla artacaktır. Muntazam olmayan Fotoçevrim tespit edilirse, Fotoçevrim sırasında embriyonun içine derin odaklanır.

Sonuçlar

FDAP zebra balığı embriyolar ¹⁹ hücre dışı sinyal gönderme proteinleri yarı ömürleri belirlemek için kullanılmıştır. Bu proteinlerden biri olan şaşılıklarını embriyojenez ³⁴ boyunca mesendodermal genlerin ekspresyonuna neden olur. Şaşı Dendra2 QRT-PCR ile ve in situ hibridizasyon deneyleri ¹⁹ de gösterildiği gibi, etiketsiz perspektif benzer seviyelerde mesendodermal genlerin ifadesini aktive eder. Embriyolar Alexa488-dekstran ve mRNA şaşı ...

Tartışmalar

Bir FDAP deney başarısı fonksiyonel photoconvertible füzyon proteininin üretimi dayanır. Bir protein etiketleme onun biyolojik aktivitesini ve / veya yerleşim yeri, çözünürlük ve stabilite ^36-41 dahil olmak üzere biyo-fiziksel özelliklerini etkileyebilir. Aktif aktiviteleri için çok sayıda farklı füzyon yapılarının aktivitesi test etmek için hazırlanabilir. Bunun ötesinde ilgili protein için photoconvertible proteini göre konumunu değiştirmek veya daha fazla bağlayıcılar ile

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)			Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)			To generate capped mRNA for injection into embryos
Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)			Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks
6-well plastic dish (BD Falcon)			Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting
Embryo medium			250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)			Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage
5 cm diameter glass petri dish			For embryo dechorionation
200 ml glass beaker			For embryo dechorionation
Microinjection apparatus			For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage
Stereomicroscope			For injecting and mounting embryos
1x Danieau's medium			Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2
UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)			For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40 - 42 °C when ready to use
Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)			For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos
Metal probe			For positioning embryos during mounting
Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)			Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5
15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium			For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette
Inverted laser scanning confocal microscope			A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required
Heated stage			To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment
Confocal software capable of time-lapse imaging			Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals
25x or 40x water objective			Objective for imaging
10x air objective			Objective for photoconversion
Immersion oil			Immersion oil with the same refractive index as water