İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Özet

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Özet

Sağlıklı dokuların, birçok kan ve katı maligniteler benzer şimdi daha farklılaşmış döl yol verirken kendine yenilemek kök benzeri kanser hücrelerinin bir alt kümesi olan, hiyerarşik olarak organize edilmesi düşünülmektedir. Anlama ve gelişmiş kemo ve olmayan kök tümör kitlesi ile karşılaştırıldığında radyo-dirence sahip olabilir meme kanserinde bu kanser kök hücrelerini hedefleyen, önemli bir araştırma alanı haline gelmiştir. Mammosphere deneyi de yaygın olarak geriye dönük sphere- tespit kabiliyeti için kullanılır hale gelmiştir: CD44, CD24, ve ALDH aktivitesi de dahil olmak üzere Marker prospektif, bağışıklık farelere implante edildiğinde gelişmiş tümör oluşum nedenlerinin göstermek hücreleri izole etmek için (FACS), flüoresans ile aktifleştirilen hücre kullanılarak değerlendirilebilir Tek kök hücre benzeri klonlarının gelişir hücreleri oluşturur. Burada hücre kuşakları ya da primer hasta numuneleri, bunların pasajlayarak ve küre f tahmin etmek için hesaplamalar mammospheres uygun kültür için yaklaşımlar anlatılmaktadıroluşturmayan verimlilik (SFE). Önce uygun planlama ve mammosphere deneylerin yorumunda önemli hususları ve tuzaklar tartışmak.

Giriş

kök benzeri kanser kök hücreleri tarafından başkanlığında tümör hücre soylarının varlığı büyük ölçüde tümör heterojenite anlayışımıza ekledi. Tümörlerde bazı fenotipik çeşitlilik genetik olarak farklı klonların klonal akıbet kaynaklanan yok iken, önemli bir bileşeni epigenetik farklılıklar sonucu görünür: kanser hücrelerinin spesifik genin aktivasyonu veya baskı yoluyla kök, atası ve farklılaşmış devletler arasında (geri dönüşümlü olarak bazen) geçiş yapabilirsiniz ifade programları ^1-3. Bu, şu anda modüle faktörleri veren kanser, stromal ve bağışıklık hücrelerinin komşu parakrin sinyal ile bağlantılı olarak elde edilen otokrin sinyalli bir hücrede ifade edilen gen ekspresyon programı yansıtan hücre iç ve dış faktörler yansıtır ve bu tür derecesi gibi microenviromental koşullar hipoksi ^2,4,5.

Yenilikçi soy izleme yaklaşımlar olsa dain vivo niş ⁶ varsayılan kanser kök hücrelerini incelemek için yeteneğimizi ilerleyen ^{- 8,} küre oluşturan deneyler, en az kullanılan deney koşulları altında, kök hücreleri gibi davranmaya meme kanseri hücrelerinin potansiyelini tahmin etmek popüler ve kullanışlı bir yaklaşım kalır. Genellikle daha mesenchymal- ve epitel karşılık önerilmiştir membran belirteçleri CD44 ve CD24 ⁹ ve enzim ALDH (aldehit dehidrojenaz) aktivitesi ^{seviyeleri, 10,} belirteçlerin bunların ifadesi ile, temizleme kanser kök hücreleri için geriye dönük yöntem ile birlikte kullanılır benzeri kanser kök hücreleri sırasıyla ^11. Küre oluşumu yaklaşım, ilk olarak epitel büyüme faktörü (EGF), ¹² ilavesi ile yapışkan olmayan, serumsuz koşullarda tek klonlardan putatif kök hücrelerinin büyümesini sağlayan neurosphere deneyi geliştirildi, daha sonra yararlı normal ve kanserli uygulanan meme dokularında.

küre oluşturucu kurucu hücre kimliği ve küre kitle oluşturan karışık hücre tipleri, meme ya da deneylerde oluşturan diğer küre yapılabilir çıkarımlar için de geçerlidir. Düşünce Uzun vadeli sakin kemik niyetli kök hücreleri, in vivo aktivasyon lehine olacağını faktörlerin kesin kombinasyonu karşılaşmazsınız, G0 fazında dinlenmek için. mammosphere tahlil yerine mitoz bölünme için dengelisin ya da zaten ¹³ bölünmesi ya hücrelerin büyümesini sağlar. Bu progenitörler, bir gerçek hareketsiz hücre de, testte kullanılan EGF ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), mitojen ile çoğalır hücre aşaması olabilir. Yine de, aktif kök hücre ilişkili sinyal bir dizi ¹⁴ yolaklarıyla içerirler. Buna ek olarak, bunların oluşum oranının fare ksenograftları ^2,15,16 sınırlı seyreltme deneylerinde gücü ile ölçülen bölgeden alınan doku, tümöre neden olması ile de ilgilidir ^</ Sup>.

Burada tek hücrelerin izole edilmesi ve insan göğüs kanseri hücre çizgileri ve göğüs tümörlerinin klinik örneklerde her iki primer mammospheres oluşturmak için ayrıntılı protokolleri sağlar. Biz de kendini yenileme değerlendirmek için birincil mammospheres seri pasajlar gerçekleştirmek için nasıl ve küre farklı ekim yoğunlukları arasında karşılaştırma (Şekil 1 şemaya bakınız) izin veren verimliliği oluşturan hesaplamak için nasıl açıklar.

Protokol

prosedürler aşağıda etik Imperial College, Londra tarafından onaylanmıştır.

İnsan Göğüs Kanseri Hücre Hatlarında Primer Mammospheres 1. Üretim

NOT: Bir steril kültür kaputu altında aşağıdaki adımları uygulayın.

1. Mammosphere Ortam, 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş DMEM / F12, 100 U / ml penisilin, 100 U / ml streptomisin ihtiva eden hazırlayın. 10 ng / ml yeniden birleştirici insana ait bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF R & D Systems) ve 1 x B27 ek, 20 ng / ml yeniden birleştirici insan epidermal büyüme faktörü (EGF Sigma) ilave edilerek, kullanımdan hemen önce komple ortamı hazırlar.
2. (Ya da seçtiğiniz bir meme kanseri hücre hattı,% 70-80 izdiham) yapışık MCF-7 veya MDA-MB-231 hücreleri içeren bir şişeye aspire medya, 1x PBS içinde iki kez yıkayın ve hücreleri trypsinize.
3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, 200 x g'de santrifüje hücreleri. Mammosphere medya 1-5 ml Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri. Pipet40 mikron hücre süzgeç kapağı filtresi yukarı ve aşağı ve gerekli kullanım halinde tek hücre süspansiyonu elde etmek. Tek bir hücre süspansiyonu (değilse, 3 kez hücre süspansiyonu kadar şırınga için bir 25 G iğne kullanımı) oluşmuştur emin olmak için, bir hemasitometre kullanarak.
4. FACS ile gerekli izole CD44 + CD24- hücresel alt kümesi, anti-CD24-fikoeritrin (PE) ve bir anti-CD44-floresin izotiyosiyanat (FITC) ile monoklonal antikorlar ⁹ kullanarak edin. Alternatif olarak, bir manyetik aktive hücre sıralama, anti-CD44 ve üreticinin talimatlarına göre, anti-CD24-biotin kombine mikro ile (MACS) sistemi kullanılarak bu nüfusu izole. LD sütunlarını kullanarak LS sütunları kullanarak pozitif seçim ve negatif seçim yapın ve ¹⁷ flow sitometri tüm izole hücrelerin fenotipleri onaylayın.
5. Tripan mavisi kullanarak, ml başına canlı hücre sayısını hesaplayın.
   Not: Hücre canlılığı hemocy ızgaralara içindeki hücrelerin toplam sayısı ile bölünmüş canlı hücre sayısı olarak hesaplanmıştırtometre. Tripan mavisi almak hücreler canlı olmayan olarak kabul edilir. Aşağıdaki prosedür tam olarak yaşayabilir hücrelerin oranını belirlemek için kullanılır.
   1. PBS içinde tripan mavisi bir% 0.4 çözelti hazırlayın. Hücrelerin 1 ml tripan mavi stok solüsyonu 0.1 ml ilave edilir. Hemasitometre yükleyin ve düşük büyütmede mikroskop altında incelemek hemen. Toplam hücre sayısı ve mavi boyama hücreleri sayın.
      Canlı hücreler, = [1,00 - (mavi hücre sayısı ÷ toplam hücre sayısı)] x 100.
   2. Kültür ml'si başına canlı hücre sayısını hesaplamak için aşağıdaki formül kullanılır. Seyreltme faktörü düzeltmek için unutmayın.
      10 ⁴ x 1.1 = hücre / ml kültüre x canlı hücre sayısı
6. 6-çukurlu ultra-düşük yapışkan bir plakanın her bir tam mammosphere ortam, 2 ml hücre önceden belirlenmiş bir miktarda yeniden süspanse edin. tohum yoğunluğu normalde 500-4,000 hücre / cm oyuk başına ² hücresidir. İsteğe bağlı kullanım loW ek 24 oyuklu plakalar ortam, 0.5 ml, aynı yoğunlukta tohum hücreleri ise.
   NOT: Bu ilgi her hücre hatları için ekim yoğunluğu ve kültür zaman optimizasyonu öneririz.
7. Özellikle ilk 5 gün büyümesi aşamasında plakalar bozmadan (hücre hattı ve mammospheres boyutuna bağlı olarak), 5-10 gün boyunca 37 ° C'de ve% 5 _CO2 seviyesinde ultra düşük bağlanma 6 oyuklu inkübe .

İnsan Meme Kanseri Klinik Örneklerden İlköğretim Mammospheres 2. Nesil

Not: İnsan göğüs kanser dokusu göğüs tümörlerinin çıkarılması için cerrahi geçiren hastaların elde edilebilir. 100 E / ml penisilin ve 100 U / ml streptomisin ihtiva eden kültür ortamı içinde 50 ml steril tüplerde kadar, 24 saat boyunca buz üzerinde saklayın dokusudur. Bir steril kültür kaputu altında aşağıdaki adımları uygulayın.

1. Küçük bir ortam hacmi ile 100 mm doku Petri kabı içine örnek aktarın. RemovSteril makas, scapel ve cımbız kullanarak e yağ dokusu.
2. DMEM / F12 2-3 ml ekleyin ve hiçbir büyük parçalar kalmayıncaya kadar steril bir scapel veya jilet ile 1 mm ³ parçaya örnek kıyma.
3. Doku parçaları süspanse proteolitik enzimler (3000 U / ml kolajenaz ve 1000 U / ml hiyaluronidaz) ihtiva eden 10 mi DMEM önceden ısıtılmış ve doku parçaları sindirilir kadar bir döner sallayıcı içinde 37 ° C'de inkübe edin. Genellikle tam sindirim 1-3 saat sürer. Tümörlerin patolojik özelliklerine göre sindirim süresini ayarlayın. (Örneğin meme adenokarsinomu daha kırılgan ve daha kısa sindirim zamana ihtiyacı müsinöz karsinom göre sindirimi genellikle zordur). Hemasitometre altında 20 ul süspansiyon gözlemleyerek sindirim her ½ saat derecesini değerlendirin.
4. Parçaları daha sonra, 5 dakika boyunca tortu oda tem olarak 10 dakika süreyle 200 x g'de 15 ml konik bir polipropilen tüp ve santrifüj süpernatan transfer etmek içinsıcaklık. Mammosphere medya 5 ml - dikkatlice 1 süpernatant ve tekrar süspansiyon hücrelerini süzün.
5. Elde edilir ve tek hücre süspansiyonları plaka hücre hatları için, yukarıda tarif edilen adımları 1.1-1.4 izleyin. Gerekirse 25 G ile hücre hasar hücreleri sınırlamak için 2 kez fazla şırınga geçirin.

3. Mammosphere Verimliliği (%) hesaplanması Şekillendirme

1. Kültür döneminden sonra, 40X büyütmede mikroskop altında mammospheres (fazla 40 um) çapı sayılır. Dijital görüntü 5 rastgele bir ışık mikroskobu dijital kamera kullanarak alanlar ve satın alma yazılımı kullanarak mammospheres boyutunu belirler. Herhangi bir resim Analizi Yazılım kullanın.
2. Aşağıdaki denklem kullanılarak Mammosphere Şekillendirme Verimliliği (MFE%) hesaplayın:
   MFE (%) = (kuyu başına mammospheres içinde) / (oyuk başına tohumlanmış hücrelerin içinde) x 100

Kendini yenileme Değerlendirme Mammospheres 4. Seri Pasajlanması

1. Pipet bir 15 ml tüp içine, her kuyudan mammospheres ihtiva eden ortam. PBS ile kuyu yıkayın ve toplanan medya ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 115 x g'de santrifüjleyin.
2. Süpernatant atılır ve önceden ısıtılmış% 0.5 tripsin /% 0.2 EDTA, 500 ul pelletini. 2-3 dakika boyunca inkübe edin.
3. Tripsin nötralize etmek için FCS 500 ul ekleyin. 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. Küreleri parçalamak için aşağı mammospheres medya, pipet yukarı 100 ul süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın ve.
4. Hemasitometre ile hücre sayımı ve hücreler, tek bir hücre süspansiyonu olup olmadığını belirlemektedir. Bir 25 G geçmesine değilse tek hücre elde etmek için 3 kez şırınga. Birincil oluşturmada kullanılan aynı yoğunlukta bir ultra düşük bağlanma 6 oyuklu bir plakaya hücreleri Tohum.
5. 5-10 gün sonra, küreler> 40 um saymak ve daha önce bildirilen formülü kullanarak küre oluşturan verimliliği hesaplamak.

Sonuçlar

Farklı numuneler ya da farklı muamelelere tabi olan tohumlanmıştır ilk hücreler için normalize sonra meydana mammospheres> 40 um sayı açısından değişiklik gösterebilir. Üç kez yetiştirilen her bir muamele için mammosphere oluşturucu etkinliği (MFE) hesaplayın. Bu durum, farklı tohum yoğunluğu ile deneyler karşılaştırılabilir sağlar. Veri en ideal pozitif ve negatif kontroller ile, bir çubuk grafikte görüntülenir ve üçlü kuyular arasında standart sapma gösteriyor. Sürekli% 60-80...

Tartışmalar

Birincil ve ikincil mammospheres Başarılı değerlendirme hücreleri az küre agregasyonu ile, tek klonlar formu mammospheres yeterince düşük yoğunluklarda kaplama olan dayanır. Bununla birlikte çok düşük yoğunluklarda, çok az mammospheres istatistiksel tedavisinin etkilerini ayırt oluşturabilir. Ekim yoğunluğu onların küre oluşturan verimlilikleri de önemli ölçüde değişebilir çünkü kullanılan her hücre hattı için optimize edilmelidir (Low-E-kaderin ifade olanlar daha az istikrarlı ve d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2mM L-Glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS);	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin-0.2%EDTA;	Sigma Aldrich	59418C
Fetal Calf Serum	First Link UK	02-00-850
Trypan Blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6 well plates	Corning	CLS3814
Collagenase type 1A	Sigma Aldrich	C9891
Hyaluronidase	Sigma Aldrich	H3506
Sterile razor blades	Fisher Scientific	12443170
Sterile scalpel	Fisher Scientific	11758353
Sterile micro-dissecting scissors	Sigma Aldrich	S3146