Mammosphere Формирование анализа из рака молочной железы человека тканях и клеточных линий

Резюме

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Аннотация

Как здоровых тканей, многие крови и твердых злокачественных опухолей в настоящее время считается, организованы иерархически, с подмножеством стволовых-как раковые клетки, которые самообновлению, давая начало более дифференцированной потомства. Понимание и направленности этих раковых стволовых клеток при раке молочной железы, которые могут обладать повышенной химио- и лучевая устойчивость по сравнению с не-опухолевых стволовых оптом, стала важным направлением исследований. Маркеры в том числе CD44, CD24, и ALDH деятельности может быть оценена с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS) для перспективно выделения клеток, которые отображают усиление туморогенности при имплантации в ослабленным иммунитетом мышей: mammosphere анализ также стал широко используется для его способности ретроспективно определить Шар формирование клеток, которые развиваются из клеток-как клоны одного стебля. Здесь мы опишем подходы к соответствующей культивирования mammospheres из клеточных линий или первичных проб пациентов, их пассирования, и расчеты для оценки сферы Forming эффективность (SFE). Сначала мы обсудим основные моменты и подводные камни в соответствующем планировании и интерпретации mammosphere экспериментов.

Введение

Наличие линий опухолевых клеток во главе с стволовых, как раковые стволовые клетки значительно добавил к нашему пониманию опухоли неоднородности. Хотя некоторые фенотипического разнообразия в опухолях действительно возникает из клонального вырост генетически различных клонов, появляется существенный компонент результатом эпигенетических различий: раковые клетки могут перейти (иногда обратимо) между штоком, прародителя и дифференцированных состояний посредством активации или репрессии конкретного гена Программы выражение ^{1 - 3.} Это может отражать клеток внутреннего или внешнего фактора, отражает программу экспрессии генов в настоящее время, выраженное в ячейке с его результирующей аутокринного сигнализации в сочетании с паракринной сигналов от соседних рак, стромальные клетки иммунной системы или доставки модулирующие факторы и microenviromental условия, такие как степень гипоксия ^2,4,5.

Хотя инновационных клона отслеживания подходовпродвигаются наши способности к обучению предполагаемых раковых стволовых клеток в их в естественных нише ^{6 - 8,} сфера формирования анализы остаются популярными и удобный подход для оценки потенциала клеток рака молочной железы ", чтобы вести себя как стволовые клетки, по крайней мере, в условиях анализа, используемых. Он часто используется вместе с ретроспективных методов раковых стволовых очистки клеток, их выражения мембранных маркеров CD44 и CD24 ⁹ и уровней активности фермента ALDH (альдегиддегидрогеназой) ^10, маркеров, которые были предложены, чтобы соответствовать более mesenchymal- и эпителиальных -как раковые стволовые клетки соответственно ^11. Подход формирования сфера была впервые разработана в качестве нейросфера анализа, что позволяет рост предполагаемых стволовых клеток из отдельных клонов в неприлипающими, бессывороточной условиях с добавлением эпителиального фактора роста (EGF) ^12, а затем быть с пользой применены к нормальной и раковой тканях молочной железы.

Личность сфере формирования основателя ячейки и типы смешанных клеток, составляющих массу сфере, имеют отношение к выводам, которые можно сделать из mammo-, или в другой сфере формирования анализов. Долгосрочные покоя кости ФИДЕ стволовые клетки, как полагают, отдохнуть в G0 фазе, не будет испытывать точное сочетание факторов, которые будут благоприятствуют активации в естественных условиях. Mammosphere анализ, а не способствующая росту клеток либо на пороге митотического деления или уже разделительных ^13. Эти предшественники, хотя и не действительно покоя клетки, может быть этапом клеток, которые пролиферируют с митогены EGF и основной фактор роста фибробластов (bFGF), используемых в анализе. Тем не менее, они содержат ряд клеточно-ассоциированного сигнализации активируется стволовых дорожками ^14. Кроме того, скорость их образования относится к туморогенности ткани они были взяты из измеренного, когда их активности в анализах ограниченных разведений в ксенотрансплантатов мыши ^{2,15,16 <}/ SUP>.

Здесь мы предлагаем подробные протоколы, чтобы изолировать отдельные клетки и формировать первичные mammospheres из обеих клеточных линий рака молочной железы человека и в клинических образцах опухолей молочной железы. Мы также описывается, как выполнять последовательные проходы первичных mammospheres оценить самообновление, и как рассчитать сфера формирования эффективность, что позволяет проводить сравнения между разными плотностями высева (см схему на рисунке 1).

протокол

Приведенные ниже процедуры были этически утвержден Имперского колледжа в Лондоне.

1. Генерация первичных Mammospheres из груди человека раковых клеток линии

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия в стерильной капот культуры.

1. Подготовка Mammosphere Медиа, содержащий DMEM / F12 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 ед / мл стрептомицина. Подготовка полной среде непосредственно перед использованием путем добавления 20 нг / мл рекомбинантного фактора роста эпидермиса человека (EGF; Sigma), 10 нг / мл рекомбинантного основной фактор роста фибробластов человека (bFGF; R & D Systems) и 1x B27 добавки.
2. Вытяжку средств массовой информации из колбы, содержащей прилипшие MCF-7 или MDA-MB-231 клетки (линию клеток рака молочной железы на ваше усмотрение 70-80% слияния), промыть дважды в 1x PBS, и Trypsinize клетки.
3. Центрифуга клетки при 200 мкг при комнатной температуре в течение 5 мин. Декантируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 1-5 мл mammosphere СМИ. Пипеткавверх и вниз, и, при необходимости использования клеточный фильтр крышки фильтра 40 мкм для получения одного суспензии клеток. Используйте гемоцитометра, чтобы обеспечить суспензию отдельных клеток сформировала (если нет, используйте 25 г иглу в шприц суспензию клеток до 3 раз).
4. Если необходимо, CD44 + CD24- сотовой подмножество помощью FACS с использованием анти-CD24-фикоэритрин (РЕ) и анти-CD44-изотиоцианат флуоресцеина (FITC) моноклональными антителами ^9. Кроме того, изолировать такого населения, используя магнитную активирована (MACS) системы с анти-CD44 и анти-CD24-биотин комбинированных микросфер в соответствии с инструкциями изготовителя сортировки клеток. Выполните положительный выбор, используя LS колонки, и негативный отбор с использованием колонки LD и подтвердите фенотипы всех изолированных клеток методом проточной цитометрии ^17.
5. Рассчитать количество жизнеспособных клеток на мл с использованием трипанового синего.
   Примечание: Жизнеспособность клеток рассчитывали как количество жизнеспособных клеток, деленное на общее число клеток в сетях на hemocyTometer. Клетки, которые занимают трипанового синего считаются нежизнеспособными. Следующая процедура используется для точного определения доли жизнеспособных клеток.
   1. Приготовьте 0,4% раствора трипанового синего в ФБР. Добавить 0,1 мл трипанового синего раствора в 1 мл клеток. Загрузка гемоцитометра и исследовать непосредственно под микроскопом при малом увеличении. Подсчитайте общее количество клеток и число синих окрашивания клеток.
      Жизнеспособные клетки = [1,00 - (Количество синих клеток ÷ Количество всех клеток)] × 100.
   2. Для расчета числа жизнеспособных клеток на мл культуры, использовать формулу, приведенную ниже. Помните, для коррекции коэффициента разбавления.
      Количество жизнеспособных клеток × 10 ⁴ × 1,1 = клеток / культуры мл
6. Ресуспендируют заранее определенного количества клеток в 2 мл полной mammosphere информации в каждую лунку 6-луночного сверхнизким клейкого пластины. Плотность посева, как правило, 500-4,000 клеток / см ² ячейка на лунку. Дополнительно использование вотW крепления 24-луночные планшеты в то время как посев клеток при одинаковой плотности в 0,5 мл среды.
   Примечание: Мы рекомендуем оптимизации плотности и времени культуры посева для каждого клеточных линий, представляющих интерес.
7. Инкубируйте ультра низкой крепления 6-луночные планшеты при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 5-10 дней (в зависимости от клеточной линии и размера mammospheres), не нарушая пластины, в частности, во время фазы роста в течение первых 5 дней ,

2. Формирование первичных Mammospheres от рака молочной железы человека клинических образцов

Примечание: Человеческие ткани молочной железы могут быть получены от пациентов, перенесших операции по удалению опухолей молочной железы. Магазин ткани на льду в течение до 24 ч в 50 мл стерильные пробирки в культуральной среде, содержащей 100 U / мл пенициллина и 100 ед / мл стрептомицина. Выполните следующие действия в стерильной капот культуры.

1. Передача образца в 100 мм чашки Петри ткани с небольшим объемом средств массовой информации. Убре жировой ткани с помощью стерильных ножниц, scapel и пинцет.
2. Добавьте 2-3 мл DMEM / F12 и не стесняется образец в 1 мм ³ штук с стерильной scapel или лезвием бритвы, пока не большие куски остаются.
3. Ресуспендируют части ткани в предварительно нагревают 10 мл DMEM, содержащей протеолитические ферменты (3000 ед / мл коллагеназы и 1 000 ед / мл гиалуронидазы) и инкубируют при 37 ° С на ротационном шейкере, пока все фрагменты ткани не перевариваются. Обычно полное переваривание уходит от 1-3 часов. Отрегулируйте время пищеварения в соответствии с патологическими символов опухолей. (Например аденокарциномы молочной железы, как правило, труднее переваривать сравнению с коллоидный рак, который является более хрупким и нуждается в более короткое время пищеварения). Оцените степень переваривания Каждые полчаса, наблюдая 20 мкл суспензии при гемоцитометре.
4. Разрешить фрагменты для осаждения в течение 5 мин, а затем перенести супернатант в 15 мл коническую полипропиленовую пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 10 мин при комнатной ТЕАмойки. Осторожно перелейте надосадочную и ресуспендирования клеток в 1 - 5 мл mammosphere СМИ.
5. Следуйте инструкциям в 1,1-1,4 описанные выше для клеточных линий для получения и диска суспензии отдельных клеток. Pass клетки через 25 г шприц максимум 2 раза, если необходимо ограничить повреждающие клетки.

3. Mammosphere Формирование эффективность (%) Расчет

1. После периода культивирования, подсчета mammospheres (более 40 мкм) диаметр под микроскопом при 40-кратном увеличении. Цифровая изображение 5 случайных полей с помощью цифровой камеры на световом микроскопе и определить размер mammospheres с помощью программного обеспечения приобретения. Использовать любое изображение программное обеспечение для анализа.
2. Рассчитать Mammosphere Формирование эффективность (MFE%), используя следующее уравнение:
   МФБ (%) = (число mammospheres на лунку) / (число клеток, посеянных на лунку) х 100

4. Серийные пассажи Mammospheres по оценке самообновления

1. Внесите носитель, содержащий mammospheres из каждой лунки в 15 мл пробирку. Вымойте скважин с PBS и добавить к собранным СМИ. Центрифуга при 115 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
2. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 500 мкл подогретого 0,5% трипсина / 0,2% ЭДТА. Инкубируют в течение 2-3 мин.
3. Добавить 500 мкл FCS, чтобы нейтрализовать трипсина. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл mammospheres СМИ, пипетки вверх и вниз, чтобы разбить сферы.
4. Количество клеток с гемоцитометра и определить, если клетки в суспензии отдельных клеток. Если не пройти через 25 G шприц до 3 раз, чтобы получить отдельные клетки. Семенной клеток в новой ультра низкой крепления 6-луночный планшет при той же плотности, используемого в первичной генерации.
5. Через 5-10 дней, рассчитывать шары> 40 мкм и вычислить сферы формирования эффективности по формуле сообщалось ранее.

Результаты

Различные образцы или тех, кто подвергается различным лечения может варьироваться в количестве mammospheres> 40 мкм, которые образуют после нормализации для начальных клеток, посеянных. Рассчитать mammosphere формирования эффективности (МФБ) для каждого лечения, выращенных в трех экземплярах. Э?...

Обсуждение

Успешное оценка первичных и вторичных mammospheres зависит от клетки посевом при достаточно низких плотностей, которые mammospheres форму от отдельных клонов, с минимальным агрегации сферы. Однако при плотностях, которые слишком малы, слишком мало mammospheres могут образовывать различать эффекты леч?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2mM L-Glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS);	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin-0.2%EDTA;	Sigma Aldrich	59418C
Fetal Calf Serum	First Link UK	02-00-850
Trypan Blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6 well plates	Corning	CLS3814
Collagenase type 1A	Sigma Aldrich	C9891
Hyaluronidase	Sigma Aldrich	H3506
Sterile razor blades	Fisher Scientific	12443170
Sterile scalpel	Fisher Scientific	11758353
Sterile micro-dissecting scissors	Sigma Aldrich	S3146