Mammosphere Formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires

Résumé

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Résumé

Similaires aux tissus sains, beaucoup de sang et de tumeurs solides sont maintenant pensés pour être organisée hiérarchiquement, avec un sous-ensemble de cellules cancéreuses souches ressemblant que l'auto-renouveler tout en donnant naissance à une descendance plus différenciée. Comprendre et cibler ces cellules souches cancéreuses dans le cancer du sein, qui peuvent posséder amélioré chimio- et radio-résistance par rapport à la masse de la tumeur non-tige, est devenu un domaine de recherche important. Marqueurs y compris CD44, CD24, et l'activité de l'ALDH peut être évaluée en utilisant cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler de façon prospective les cellules qui affichent la tumorigénicité accrue lorsqu'ils sont implantés dans des souris immunodéprimées: le dosage de mammosphere a également été largement utilisée pour sa capacité à identifier a posteriori SPHERE formant des cellules qui se développent à partir de souches unique clones de cellules comparables. Nous exposons ici approches pour la culture appropriée de mammospheres partir de lignées cellulaires ou d'échantillons primaires des patients, de leur passages, et des calculs pour estimer la sphère fl'efficacité ormer (SFE). D'abord, nous discutons des considérations et des pièges clés dans la planification et l'interprétation des expériences mammosphere appropriée.

Introduction

L'existence de lignées cellulaires tumorales dirigés par des cellules souches du cancer souches ressemblant a grandement ajouté à notre compréhension de l'hétérogénéité tumorale. Alors que certains diversité phénotypique dans les tumeurs ne se pose de l'excroissance clonale de clones génétiquement distinctes, une composante importante semble résulter de différences épigénétiques: les cellules cancéreuses peuvent transition (parfois réversible) entre la tige, l'ancêtre, et les Etats différenciées via l'activation ou la répression de gène spécifique les programmes d'expression ^1-3. Cela peut tenir compte de facteurs intrinsèques ou extrinsèques cellulaires, ce qui reflète le programme d'expression génique actuellement être exprimé dans une cellule avec son signalisation autocrine résultant en liaison avec signalisation paracrine d'un cancer, stromales ou les cellules immunitaires voisine délivrant facteurs modulateurs et les conditions microenviromental tels que le degré de hypoxie ^2,4,5.

Bien que la lignée traçage des approches novatricessont avancer notre capacité à étudier les cellules souches du cancer putatifs dans leur niche in vivo ^6-8, les dosages de la sphère de formation restent une approche populaire et pratique pour estimer le potentiel des cellules de cancer du sein de se comporter comme des cellules souches, au moins dans les conditions de dosage utilisées. Il est souvent utilisé aux côtés méthodes rétrospectives pour les cellules souches du cancer de purification, par leur expression de marqueurs membranaires CD44 et CD24 ⁹ et les niveaux de l'enzyme ALDH (aldéhyde déshydrogénase) d'activité ^10, les marqueurs qui ont été proposés pour correspondre à plus mesenchymal- et épithélial -comme cellules respectivement ¹¹ souches du cancer. L'approche de la formation de la sphère a d'abord été développé en tant que dosage de neurosphères, permettant la croissance de cellules souches putatives provenant de clones individuels dans non adhérentes, des conditions sans sérum avec l'ajout de l'épithélium du facteur de croissance (EGF) ^12, puis est utilement appliquée à normaux et cancéreux tissus mammaires.

L'identité de la cellule fondateur sphère de formation, et les types de cellules mixtes qui composent la masse de la sphère, sont pertinentes pour les conclusions qui peuvent être fabriqués à partir de mammographie, ou autre sphère formant essais. Os repos cellules souches de bonne à long terme, la pensée de se reposer en phase G0, ne sera pas l'expérience de la combinaison précise de facteurs qui favoriseraient activation in vivo. Le dosage de la place mammosphere permet la croissance des cellules soit prête pour la division mitotique ou déjà en division ^13. Ces progéniteurs, mais pas véritablement une cellule de repos, peuvent être le stade de la cellule qui prolifère avec les mitogenes et EGF facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) utilisés dans le dosage. Néanmoins, ils contiennent une gamme de la signalisation associée aux cellules souches activé cheminements de ^14. En outre, la vitesse de leur formation se rapporte à la tumorigénicité de tissu ont été prélevés, lorsqu'elle est mesurée par leur efficacité dans des essais de dilution limitée dans des xénogreffes de souris ^{2,15,16 <}/ Sup>.

Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour isoler des cellules individuelles et de générer mammospheres primaires des deux lignées cellulaires de cancer du sein humain et des échantillons cliniques de tumeurs du sein. Nous décrivons également comment effectuer des passages en série de mammospheres primaires pour évaluer l'auto-renouvellement, et comment calculer sphère formant efficacité qui permet la comparaison entre les différentes densités de semis (voir schéma de la figure 1).

Protocole

Les procédures ci-dessous ont été éthique approuvé par l'Imperial College, Londres.

1. Génération de mammospheres primaires du sein humain Cancer Cell Lines

REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes sous une hotte de culture stérile.

1. Préparez mammosphere des milieux contenant du DMEM / F12 supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 U / ml de streptomycine. Préparer les médias complète immédiatement avant utilisation en ajoutant 20 facteur ng / ml recombinant de croissance épidermique humain (EGF; Sigma), 10 ng / ml de base facteur humain recombinant de croissance des fibroblastes (bFGF; R & D Systems) et le supplément 1x B27.
2. Aspirer le milieu de flacon contenant adhérentes MCF-7 ou MDA-MB-231 cellules (ou une ligne de votre choix de cellules de cancer du sein; 70-80% de confluence), laver deux fois dans PBS 1x et Trypsiniser cellules.
3. Centrifuger les cellules à 200 xg à température ambiante pendant 5 min. Cellules surnageant et remettre décantation dans 1-5 ml de milieu mammosphere. Pipettede haut en bas et si nécessaire utiliser un filtre de plafonnement des tamis cellulaire de 40 um pour obtenir une suspension à cellule unique. Utiliser un hémocytomètre pour assurer une suspension cellulaire unique est formée (dans la négative, utiliser une aiguille G 25 à la seringue la suspension de cellules jusqu'à 3 fois).
4. Si nécessaire isolat CD44 + CD24- sous-ensemble cellulaire via FACS en utilisant anti-CD24-phycoérythrine (PE) et l'isothiocyanate (FITC) des anticorps monoclonaux anti-CD44 ^{9-fluorescéine.} Alternativement, isoler telle population en utilisant un système (MACS) avec anti-CD44 et les microbilles combinées anti-CD24-biotine selon les instructions du fabricant magnétique des cellules activées de tri. Effectuer une sélection positive en utilisant LS colonnes, et la sélection négative en utilisant des colonnes de LD et de confirmer les phénotypes de toutes les cellules isolées par cytométrie de flux ^17.
5. Calculer le nombre de cellules viables par ml en utilisant du bleu trypan.
   REMARQUE: La viabilité des cellules est calculé comme le nombre de cellules viables, divisé par le nombre total de cellules dans les grilles sur la hemocyTometer. Les cellules qui prennent bleu trypan sont considérés comme non viable. La procédure suivante est utilisée pour déterminer avec précision la proportion de cellules viables.
   1. Préparer une solution à 0,4% de bleu trypan dans du PBS. Ajouter 0,1 ml de solution stock trypan bleu à 1 ml de cellules. Chargez un hémocytomètre et d'examiner immédiatement sous un microscope à faible grossissement. Compter le nombre de cellules totales et du nombre de cellules à coloration bleue.
      Les cellules viables = [1,00 - (Nombre de cellules bleues ÷ Nombre de cellules totales)] × 100.
   2. Pour calculer le nombre de cellules viables par ml de culture, utiliser la formule ci-dessous. Rappelez-vous pour corriger le facteur de dilution.
      Nombre de cellules viables × 10 × 1,1 = ⁴ cellules / ml de culture
6. Reprendre un montant pré-déterminé de cellules dans 2 ml de milieu mammosphere complets dans chaque puits d'une plaque adhérente à 6 puits ultra-faible. La densité de semis est normalement 500-4,000 cellules / cm ² cellule par puits. Éventuellement utiliser low fixation des plaques 24 puits pendant l'ensemencement des cellules à la même densité dans 0,5 ml de milieu.
   NOTE: Nous recommandons l'optimisation de la densité et l'heure de la culture ensemencement pour chaque lignées cellulaires d'intérêt.
7. Incuber à faible fixation des plaques 6 puits ultra à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 5 à 10 jours (selon la lignée cellulaire et de la taille de mammospheres) sans perturber les plaques, en particulier pendant la phase des 5 premiers jours de croissance .

2. Génération de mammospheres primaires de cancer du sein humain échantillons cliniques

REMARQUE: tissu de cancer du sein humain peut être obtenu à partir de patients subissant une intervention chirurgicale pour l'élimination des tumeurs du sein. tissu de magasin sur de la glace pendant jusqu'à 24 heures dans 50 ml dans des tubes stériles dans des milieux de culture contenant 100 U / ml de pénicilline et 100 U / ml de streptomycine. Effectuez les étapes suivantes sous une hotte de culture stérile.

1. Transférer l'échantillon dans une boîte de 100 mm tissus Petri avec un petit volume de médias. Remove du tissu adipeux avec des ciseaux stérile, scalpel et des pinces.
2. Ajouter 2-3 ml de DMEM / F12 et émincer l'échantillon dans une mm ³ morceaux avec un scalpel stérile ou lame de rasoir jusqu'à ce qu'aucun gros morceaux restent.
3. Remettre en suspension les morceaux de tissu dans préchauffée 10 ml de DMEM contenant des enzymes protéolytiques (3000 U / ml de collagénase et 1000 U / ml hyaluronidase) et incuber à 37 ° C dans un agitateur rotatif jusqu'à ce que tous les fragments de tissus sont digérés. Habituellement digestion complète prend 1-3 heures. Réglez le temps de digestion selon caractères pathologiques de tumeurs. (Par exemple adénocarcinome du sein est généralement plus difficile à digérer par rapport au carcinome mucineux qui est plus fragile et a besoin de plus courte durée de digestion). Évaluer le degré de digestion chaque demi-heure en observant 20 ul suspension en vertu hémocytomètre.
4. Autoriser les fragments dans les sédiments pendant 5 min, puis transférer le surnageant dans un tube en polypropylène de 15 ml conique et centrifuger à 200 g pendant 10 min à temtempérature. Décanter avec soin les cellules surnageant et remettre en suspension dans 1-5 ml de milieu de mammosphere.
5. Suivez les étapes décrites ci-dessus 01/01 au 01/04 pour les lignées cellulaires afin d'obtenir et plaque suspensions de cellules isolées. Cellules passe à travers le G 25 seringue un maximum de deux fois si nécessaire pour limiter endommager les cellules.

3. mammosphere efficacité de formation (%) Calcul

1. Après la période de culture, compter les mammospheres (supérieure à 40 um) de diamètre sous un microscope au grossissement de 40X. Image numériquement cinq domaines aléatoires en utilisant un appareil photo numérique sur un microscope optique et déterminent la taille des mammospheres l'aide du logiciel d'acquisition. Utilisez ne importe quel logiciel d'analyse d'images.
2. Calculer mammosphere efficacité Forming (MFE%) selon l'équation suivante:
   MFE (%) = (nombre de mammospheres par puits) / (nombre de cellules ensemencées par puits) x 100

4. Le passage en série de mammospheres pour l'évaluation de l'auto-renouvellement

1. Pipette le support contenant les mammospheres de chaque puits dans un tube de 15 ml. Laver les puits avec du PBS et ajouter aux médias recueillies. Centrifuger à 115 g pendant 10 min à température ambiante.
2. Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 pi de 0,5% de trypsine / EDTA 0,2% préchauffé. Incuber pendant 2-3 min.
3. Ajouter 500 pi de FCS pour neutraliser la trypsine. Centrifuger à 500 g pendant 5 min. Rejeter le surnageant et remettre le culot dans 100 pi de mammospheres médias, pipetage de haut en bas de désagréger sphères.
4. Compter les cellules avec un hémocytomètre et déterminer si les cellules sont en suspension à une seule cellule. Si non passer par un G 25 seringue jusqu'à trois fois pour obtenir des cellules individuelles. Ensemencer les cellules dans un nouveau plus bas attachement plaque ultra 6 puits à la même densité utilisé dans la génération primaire.
5. Après 5-10 jours, comptez sphères> 40 um et de calculer l'efficacité de la sphère de formation selon la formule rapportée auparavant.

Résultats

Différents échantillons ou ceux qui sont soumis à des traitements différents peuvent varier dans le nombre de mammospheres> 40 um qui se forment après la normalisation pour les cellules ensemencées initiales. Calculer mammosphere efficacité de formation (MFE) pour chaque traitement grandi en trois exemplaires. Cela permet des expériences avec différentes densités d'ensemencement à comparer. Les données sont affichées sur un meilleur diagramme à barres, de préférence avec des contrôles positifs et...

Discussion

Évaluation positive des mammospheres primaires et secondaires se appuie sur les cellules étant étalées à suffisamment faibles densités qui mammospheres forme de clones uniques, avec une agrégation de la sphère minimale. Cependant, à des densités trop faibles, trop peu mammospheres peuvent former de distinguer les effets des traitements statistiquement. La densité de semis doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire utilisée, car ils peuvent varier considérablement dans leur sphère formant efficaci...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2mM L-Glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS);	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin-0.2%EDTA;	Sigma Aldrich	59418C
Fetal Calf Serum	First Link UK	02-00-850
Trypan Blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6 well plates	Corning	CLS3814
Collagenase type 1A	Sigma Aldrich	C9891
Hyaluronidase	Sigma Aldrich	H3506
Sterile razor blades	Fisher Scientific	12443170
Sterile scalpel	Fisher Scientific	11758353
Sterile micro-dissecting scissors	Sigma Aldrich	S3146