Formação Mammosphere Ensaio de cancro da mama humano tecidos e linhas celulares

Resumo

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Resumo

Similar aos tecidos saudáveis, muitas sangue e tumores sólidos são pensados ​​agora para ser organizados hierarquicamente, com um subconjunto de células-tronco cancerosas, como que se auto-renovar, dando origem a descendência mais diferenciada. Compreensão e segmentação destas células-tronco cancerosas no câncer de mama, que pode possuir reforçada quimio e radio-resistência em comparação com o volume do tumor não-haste, tornou-se uma importante área de pesquisa. Os marcadores, incluindo CD44, CD24, e a actividade de ALDH pode ser avaliada utilizando células activadas por fluorescência (FACS) para prospectivamente isolar células que exibem tumorigenicidade aumentada quando implantadas em ratinhos imunocomprometidos: o ensaio mammosphere também tem sido amplamente usada para a sua capacidade para identificar retrospectivamente sphere- formação de células que se desenvolvem a partir de clones de células-tronco como single. Aqui destacamos abordagens para a cultura apropriada de mammospheres de linhas celulares ou amostras primárias do paciente, sua passaging e cálculos para estimar esfera feficiência orming (SFE). Primeiro vamos discutir as principais considerações e armadilhas no planejamento e interpretação de experimentos mammosphere apropriado.

Introdução

A existência de linhagens de células tumorais chefiadas por células-tronco cancerosas-tronco como contribuiu largamente para a nossa compreensão da heterogeneidade tumor. Enquanto alguns diversidade fenotípica em tumores que surgem do crescimento clonal de clones geneticamente distintas, um componente substancial parece resultar de diferenças epigenéticas: as células cancerosas podem fazer a transição (por vezes de forma reversível) entre a haste, progenitor, e os estados diferenciados através da ativação ou repressão do gene específico programas de expressão ^1-3. Isto pode reflectir factores intrínsecos ou extrínsecos de células, reflectindo a expressão do gene programa actualmente a ser expresso em uma célula com a sua sinalização a autócrino resultante em conjunto com sinalização parácrina da vizinha cancro, estromais ou células imunitárias entregar factores moduladores, e microenviromental condições tais como o grau de hipóxia ^2,4,5.

Embora as abordagens rastreamento de linhagem inovadorasestão avançando a nossa capacidade de estudar as células-tronco do câncer putativos em sua in vivo nicho ^6-8, ensaios de formação de esfera continuará a ser uma abordagem popular e conveniente para estimar o potencial de células de câncer de mama "para se comportar como células-tronco, pelo menos nas condições de ensaio utilizados. É frequentemente utilizado juntamente com os métodos retrospectivos para cancro de células estaminais de purificação, pela sua expressão de marcadores de membrana CD44 e CD24 ^9, e os níveis de enzima ALDH (aldeído desidrogenase) de actividade ^10, marcadores que têm sido propostos para corresponder a mais mesenchymal- e epitelial -como células-tronco do câncer, respectivamente ^11. A abordagem formação esfera foi desenvolvido pela primeira vez como o ensaio de neuroesferas, permitindo o crescimento de células estaminais putativas a partir de clones individuais em não-aderentes, condições livres de soro, com a adição de factor de crescimento epitelial (EGF) ^12, sendo posteriormente aplicado utilmente ao normal e canceroso tecidos mamários.

A identidade da célula fundadora formador de esfera, e os tipos de células mistas que constituem a massa esfera, são relevantes para as deduções que podem ser feitos a partir de mammo-, ou outra esfera formando-ensaios. Células-tronco a longo prazo ósseas repouso fide, pensado para descansar em fase G0, não vai experimentar a combinação precisa de fatores que favorecem a ativação in vivo. O ensaio mammosphere vez permite o crescimento de células ou pronta para divisão mitótica ou já divisórias ^13. Estes progenitores, embora não uma célula verdadeiramente quiescente, pode ser a célula que prolifera fase com os agentes mitogénicos de EGF e factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) utilizados no ensaio. No entanto, eles contêm uma variedade de haste ativado sinalização associado a células vias ^14. Além disso, a taxa da sua formação está relacionada com a tumorigenicidade de tecido que foram retiradas, quando medido pela sua potência para ensaios de diluição limitadas em xenoenxertos de ratinho ^{2,15,16 <}/ Sup>.

Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para isolar células individuais e que geram mammospheres primárias de ambas as linhas de células de câncer de mama humano e amostras clínicas de tumores de mama. Nós também descrevem como executar passagens em série de mammospheres primários para avaliar a auto-renovação, e como calcular esfera formando eficiência que permite a comparação entre diferentes densidades de semeadura (ver esquema na figura 1).

Protocolo

Os procedimentos a seguir foram eticamente aprovado pelo Imperial College, de Londres.

1. Geração de primárias Mammospheres de linhas celulares de cancro da mama humano

NOTA: Execute as seguintes etapas sob uma capa de cultura estéril.

1. Prepare Mammosphere meios contendo DMEM / F12 suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 U / ml de estreptomicina. Prepare media completo imediatamente antes da utilização, adicionando 20 fator ng / ml recombinante de crescimento epidérmico humano (EGF; Sigma), 10 ng / ml fator recombinante humano básico de crescimento de fibroblastos (bFGF; Sistemas I & D) e suplemento 1x B27.
2. Aspirar meios de balão contendo aderentes MCF-7 ou MDA-MB-231 (ou uma linha celular de cancro da mama de sua escolha; 70-80% de confluência), lavar duas vezes em 1x PBS, e trypsinize células.
3. Centrifugar células a 200 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Células sobrenadante e ressuspender Decantar em 1-5 ml de mídia mammosphere. Pipetacima e para baixo e, se necessário, use um 40 um filtro cap filtro de células para obter a suspensão de uma única célula. Usar um hemocitómetro para assegurar uma suspensão de célula única formou (se não, usar uma agulha G 25, a seringa da suspensão de células até 3 vezes).
4. Se necessário isolar CD44 + CD24- subconjunto celular através de FACS utilizando anticorpos anti-CD24-ficoeritrina (PE) e isotiocianato (FITC) anticorpos monoclonais ^anti-9-CD44 fluoresceína. Alternativamente, isolar tais população que utiliza uma célula magnética ativado triagem do sistema (MACS) com anti-CD44 e microbeads combinados-anti-CD24 biotina, conforme as instruções do fabricante. Realizar seleção positiva usando LS colunas e seleção negativa usando colunas LD e confirmar os fenótipos de todas as células isoladas por citometria de fluxo ^17.
5. Calcula-se o número de células viáveis ​​por ml, utilizando azul de tripano.
   NOTA: A viabilidade das células é calculada como o número de células viáveis, dividido pelo número total de células dentro das grades na hemocytometer. As células que ocupam azul tripan são considerados inviáveis. O procedimento seguinte é utilizado para determinar com precisão a percentagem de células viáveis.
   1. Prepara-se uma solução 0,4% de azul de tripano em PBS. Adicionar 0,1 ml de solução de estoque de azul de tripano a 1 ml de células. Coloque um hemocitômetro e examinar imediatamente sob um microscópio com pequeno aumento. Contar o número de células totais e o número de células coradas de azul.
      As células viáveis ​​= [1,00 - (número de células azuis ÷ Número de células totais)] x 100.
   2. Para calcular o número de células viáveis ​​por ml de cultura, utilize a fórmula abaixo. Lembre-se de corrigir o fator de diluição.
      Número de células viáveis ​​× 10 × 1,1 = ⁴ células / ml de cultura
6. Ressuspender uma quantidade pré-determinada de células em 2 ml de meio mammosphere completos em cada poço de uma placa de 6 poços aderente ultra-baixo. A densidade de sementeira é normalmente 500-4,000 células / ^cm2 de células por poço. Utilização lo Opcionalmentefixação w placas de 24 poços enquanto sementeira de células com a mesma densidade em 0,5 ml de meio.
   NOTA: Recomendamos a otimização da densidade de semeadura e tempo de cultivo para cada linhas de células de interesse.
7. Incubar baixa de fixação 6-se placas de ultra a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 5-10 dias (dependendo da linha de células e o tamanho do mammospheres) sem perturbar as placas, particularmente durante a fase de crescimento dos primeiros 5 dias .

2. Geração de primárias Mammospheres de cancro da mama humano amostras clínicas

NOTA: tecido de cancro da mama humano pode ser obtido a partir de doentes submetidos a cirurgia para a remoção de tumores da mama. Tecido da loja em gelo durante até 24 horas em tubos de 50 ml estéreis em meio de cultura contendo 100 U / ml de penicilina e 100 U / ml de estreptomicina. Execute as seguintes etapas em uma capa de cultura estéril.

1. Transfira a amostra num tecido 100 milímetros placa de Petri com um pequeno volume de meio. REMOVe do tecido adiposo com tesoura estéril, scapel e pinças.
2. Adicionar 2-3 ml de DMEM / F12 e pique a amostra em 1 milímetro ³ peças com um scapel estéril ou lâmina de barbear até que não haja grandes pedaços permanecem.
3. Ressuspender as peças de tecido em pré-aquecida de 10 ml de DMEM contendo enzimas proteolíticas (3.000 U / ml de colagenase e 1.000 U / ml de hialuronidase) e incubar a 37 ° C num agitador rotativo até que todos os fragmentos de tecido são digeridos. Normalmente, a digestão completa leva 1-3 horas. Ajuste o tempo de digestão de acordo com caracteres patológicos de tumores. (Por exemplo adenocarcinoma de mama é geralmente mais difícil de digerir em comparação com carcinoma mucinoso que é mais frágil e necessita de menor tempo de digestão). Avaliar o grau de digestão cada hora ½ observando 20 suspensão ul sob hemocitômetro.
4. Permitir que os fragmentos a sedimentar durante 5 min, em seguida, transferir o sobrenadante num tubo de polipropileno cónico de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 10 min a ma quartoratura. Decantar cuidadosamente as células sobrenadante e ressuspender em 1-5 ml de mídia mammosphere.
5. Siga os passos descritos acima para 1,1-1,4 linhas celulares para obter e chapa suspensões de células individuais. Passe células através da seringa 25 G um máximo de 2 vezes, se necessário limitar células prejudiciais.

3. Mammosphere Formando Eficiência (%) Cálculo

1. Após o período de cultura, contar os mammospheres (maior do que 40 um) de diâmetro sob um microscópio com uma ampliação de 40X. Imagem digital 5 campos aleatórios utilizando uma câmera digital em um microscópio de luz e determinar o tamanho mammospheres usando o software de aquisição. Usar qualquer imagem Software Analysis.
2. Calcule Mammosphere Eficiência Formando (MFE%) utilizando a seguinte equação:
   MFE (%) = (# de mammospheres por poço) / (# de células semeadas por poço) x 100

4. Passaging Serial de Mammospheres de Avaliação da auto-renovação

1. Pipeta o meio contendo as mammospheres de cada poço para um tubo de 15 ml. Lavar os poços com PBS e adicionar aos media recolhidos. Centrifugar a 115 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
2. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de pré-aquecido 0,5% de tripsina / EDTA a 0,2%. Incubar por 2-3 min.
3. Adicionar 500 ul de FCS para neutralizar a tripsina. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender sedimento em 100 mL de mídia mammospheres, pipetagem cima e para baixo para desagregar esferas.
4. Contar as células com um hemocitómetro e determinar se as células estão em suspensão de célula única. Se não passar através de uma seringa 25 G até 3 vezes para se obter células isoladas. Semente as células em um novo ultra-baixo apego 6 bem-placa com a mesma densidade utilizado na geração primária.
5. Depois de 5-10 dias, conte esferas> 40 mm e calcular a eficiência de formação de esfera usando a fórmula relatada antes.

Resultados

Diferentes amostras ou os sujeitos a diferentes tratamentos podem variar no número de mammospheres> 40 mm que se formam após a normalização para células iniciais semeadas. Calcular mammosphere formando eficiência (MFE) para cada tratamento cultivadas em triplicado. Isto permite que as experiências com diferentes densidades de semeadura para ser comparadas. Os dados são melhor apresentado em um gráfico de barras, de preferência, com os controlos positivos e negativos, e mostrar o desvio padrão entre as cavi...

Discussão

Avaliação positiva dos mammospheres primárias e secundárias depende das células sendo banhado pelo suficientemente baixas densidades que mammospheres formulário a partir de clones de solteiro, com esfera de agregação mínima. No entanto em densidades que são muito baixos, muito poucos mammospheres podem formar para distinguir os efeitos de tratamentos estatisticamente. Densidade de semeadura deve ser otimizado para cada linha celular utilizada, uma vez que podem variar consideravelmente em suas eficiências esf...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2mM L-Glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS);	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin-0.2%EDTA;	Sigma Aldrich	59418C
Fetal Calf Serum	First Link UK	02-00-850
Trypan Blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6 well plates	Corning	CLS3814
Collagenase type 1A	Sigma Aldrich	C9891
Hyaluronidase	Sigma Aldrich	H3506
Sterile razor blades	Fisher Scientific	12443170
Sterile scalpel	Fisher Scientific	11758353
Sterile micro-dissecting scissors	Sigma Aldrich	S3146