İnsan Mezenkimal Kök Hücre İmmünomodüler Properties (MKH) değerlendirilmesi

Özet

İnsan mezenkimal kök hücrelerin (MSC) immünomodülatör özellikleri, klinik uygulama için giderek daha önemli görünmektedir. Floresan boya carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) ile ön-lekeli MSC ve periferal kan lökositlerinin bir ko-kültür sistemi kullanılarak, efektör lökosit çoğalmasının ve spesifik alt popülasyonları MSC immünomodülasyon in vitro değerlendirme tarif eder.

Özet

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Giriş

İnsan mezenkimal kök hücreler (MKH) bir kaç extramesodermal soy ⁵ yanı sıra, kemik, kıkırdak ve yağ dokusunda ^1-4 paraxial mezodermal soy içine ayırt edebilirsiniz somatik atalarıdır. İlk erişkin kemik iliğinden izole, bu mültilineaj atalarıdır artık klinik uygulama ^9-12 için son derece müsait görünen güçlü bağışıklık düzenleyici özelliklere sahip oldukları gösterilmiştir, beklenmedik, çok sayıda dokularda ^6-8 bulunabilir ve oylandı. Immünomodülatör etkileri katılan Detaylı mekanizmalar aktif spesifik hastalık varlıklar üzerinde etkili uygulama için araştırılmaktadır. Immünmodülasyonu değerlendirmek için en basit yollarından biri efektör lökosit çoğalması ¹³ bastırılması için değerlendirilmesi gereğidir. Uyarılmış ya da aktive olduğunda örneğin T lenfositler ve monositler gibi çoğu efektör lökositler müthiş eğlenir çoğalırlar. İmmünomodülatuar fonksiyonu değerlendirilebilir zaman bastırmaçoğalması kanıtlanmıştır.

Geleneksel olarak, efektör lökosit proliferasyonu DNA içine ^[3H] timidin eklenmesi saptanması ile değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, radyasyon ve kullanım sonrası imha endişelerine önemli dezavantajları, hem de gereken karmaşık bir ekipmana sahiptir. Hücre çoğalmasını değerlendirmek için radyoaktif olmayan tahliller olmakla birlikte, carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) deneyi gibi birçok hücre tipini içeren ko-kültür deneyleri özellikle yararlı olan, özel hücresel popülasyonlar, tanımlanması için izin verilmesi gibi başka avantajlara da sahiptir. CFSE, akış sitometrik analizi ile tespit edilebilir bir flüoresan hücre boyadır. Hücre bölünmeleri gibi, bu hücresel etiketin yoğunluğu orantılı azalır; Bu sadece genel hücre çoğalmasının tespitine imkan değil, aynı zamanda floresan det zorlaşır önce 8 tümen kadar hücre bölünmeleri sayısına değerlendirilmesi için izin verirEKT arka plan sinyali karşı. Ayrıca, flüoresan CFSE stabilitesi hücreleri aylarca ¹⁴ kadar görselleştirilebilir şekilde etiketlenmiş hücrelerin in vivo izlenmesi için izin verir.

Bu deney de efektör lökosit veya spesifik popülasyonlarının bağışıklık fonksiyonunun belirli türde değerlendirmek için değişik olabilir ve manyetik boncuk yüzey işaretleyici seçimi gerçekleştirerek bağışıklık lökosit-interlökin-10 (IL-10) üretilmesi, CD14 ⁺ monositleri ¹⁵ olarak MSC-kaynaklı önce veya uygun bir şekilde eş-kültür sonrası ilgi hücre popülasyonları. Bizim protokol (akış şeması gösterilmiştir (akış şeması Şekil 1 'de gösterildiği gibi) efektör lökositler üzerinde MSC immünomodülatör etkileri belirlemek temel deneyi ve allojenik ^CD4 + efektör T lemfositlerinin MSC-uyarılan lökosit immünomodülasyon değerlendirilmesi için bu temel tahlilinde bir değişik biçimi tarif edilmiştir Şekil 4'te).

Protokol

Kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanan Hasta onam insan hücrelerinin kullanımı için alınması gerekir.

İnsan Periferal Kan Tek Çekirdekli Hücreleri 1. yoğunluk gradyan izolasyonu (PBMC)

1. 25 ml'lik bir pipetle 50 ml'lik bir tüp içine tam kan heparinize 25 ml ilave edilir.
   1. Fosfat tamponlu tuz (PBS), 25 ml hücreleri seyreltilir.
2. Yeni 50 ml'lik bir tüp içine Ficoll Paque yoğunluk gradyanı 15 ml ilave edilir, ve tüpü eğerken, tam kan herhangi bir karıştırma ile olduğu şekilde çok yavaş ve dikkatli bir şekilde yoğunluk gradyanı içinde seyreltilmiş hücre süspansiyonu, 25 ml eklemek yoğunluk gradyan, yani., kan-yoğunluk gradyan arayüzünün hiçbir rahatsızlık.
3. Santrifüj 20 ° C 'de fren olmayan 30 sıcaklık kontrollü bir sallanma-kepçeli rotor içinde 40 dakika için 400 x g'de aşama 1,2 süspansiyon.
   Not: üç farklı tabakalar, santrifüj işleminden sonra belirgin olmalıdır: the üst katman varlık plazma; alt berrak tabaka Ficoll Paque yoğunluk gradyan olmak; ve ince, orta hücresel tabaka PBMC'leri olmak
4. Aspire edin ve mononükleer hücrelerin (örneğin, lemfositler, monositler ve trombositler) interfaz tabakası bozmamaya dikkat sahip bir Pasteur pipeti ile emme ile üst tabaka atılır.
5. Dikkatli bir şekilde yeni bir 50 ml'lik santrifüj tüpüne, 10 ml bir pipet ile bu tek çekirdekli hücre faz toplanır.
6. , 20 ml PBS ile tüp doldurun, iyice karıştırılmakta ve 20 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje tabi tutun. Santrifüj sonra tamamen süpernatantı.
7. 20 ° C'de 10-15 dakika boyunca 200 x g'da hücre PBS, 20 ml pelet ve santrifüj yeniden süspanse edin. Santrifüj sonra tamamen süpernatantı.
   Not: Bu adım trombositler-istenmeyen-içinde PBMC'ler vardır kaldırır; Bu adım, trombositlerin tam olarak çıkarılmasının sağlanması için tekrar edilebilir.
8. Belirli nüfusun herhangi bir seçim isebir hücre sayımı ¹⁶ gerçekleştirdikten sonra kültür için arzu edilen lökosit tam bir ortam içinde tekrar süspansiyon hücre topağı (% 10 fetal bovin serumu (FBS),% 1 L-glutamin ve% 1 penisilin / RPMI-1640 ortamı içinde streptomisin) içinde 1 ml askıya Bir sonraki adıma geçmeden önce 10 ⁷ PBMC'lerin başına ortam.

Lökosit Populasyonlarının 2. Manyetik Etiketleme (Belirli popülasyonlarının hiçbir Seçim Gerekli ise 4. adıma atlayın)

1. Tamamen 10 dakika ve aspirat süpernatant için 300 × g Santrifüj PBMC süspansiyon.
2. 10 ⁷ toplam hücre başına PBS 80 ul süspanse hücre pelet.
3. 10 ^7, toplam hücre başına (T lenfositlerinin izolasyonu için monositler, CD4 manyetik boncuk izolasyonu için, yani, CD14 manyetik boncuklar) belirtilen manyetik boncuk 20 ul ekle.
4. İyice karıştırın ve buzdolabında 8 ° C'de 2 ila 15 dakika inkübe edilir.
5. Yıkamak için 10 ⁷ hücre başına PBS 1-2 ml ekleyin ve santrifüj10 dakika boyunca 300 x g'de.
6. Süpernatant aspire tam ve 500 ul PBS içinde 10 ⁸ hücrelere kadar yeniden süspanse edin.

Lökosit alt popülasyonlarının 3. Manyetik Seçimi

Not: manyetik boncuk ayırıcılar ve sütun çeşitli üreticileri bir dizi hücre yüzeyi işaretleyicisi tarafından lökositlerin özel nüfus izolasyonu için kullanılabilir. İzolasyon, bir veya bir kaç olumlu belirteçleri üzerine veya istenmeyen popülasyonlarının tükenmesi sonrasında negatif seleksiyon tarafından temelli pozitif seçimi ile olabilir. (Yani, monositler için CD4 T yardımcı lenfositler için veya CD14), bir işaretleyici kullanılarak pozitif seçim gerçekleştirmek genel bir yaklaşım, aşağıda özetlenmiştir.

1. Hazırlama ve birinci manyetik ayırıcı üreticinin talimatlarına uygun ayırma kolonu da dahil olmak üzere.
2. Etiketli PBMC'lerin örneğini içeren tüp uygulayın. Olumlu etiketli ve unlabel toplanması için iki adet 15 ml santrifüj tüpleri sağlayınimalatçının talimatlarına uygun olarak ed hücre fraksiyonları,.
3. 10 ⁷ hücre başına ortam 1 ​​ml kullanılarak hücre sayısı ¹⁵ sayın ve lökosit tam bir ortam içinde pozitif seçilen lökosit (örneğin, ^CD4 + T lenfositleri veya CD14 ^{+ hücreler)} yeniden süspanse edin.

Proliferasyonunun Değerlendirme lökosit 4. KAKE Boyama

Not: KAKE yaygın in vivo ve in vitro çalışmalar hem immünolojik araştırmalarda kullanılmaktadır. Bizim protokol MSC / PBMC (ya da diğer lökosit) etkileşimlerinin in vitro çalışma için optimize edilmiştir. KAKE in vitro etiketleme yürüten genel adımlar benzer olmakla birlikte, protokolün ¹⁴ özel doz ve zamanlama farklılıklar olabilir. Bu, bir dizi faktöre, örneğin kullanılan özel hücre tipi, hücre sayısı olabilir kullanılmış olan büyük olasılıkla CFSE floresan sinyalin şiddetini etkileyebilir.

1. 10 uM (CFSE-çalışma çözeltisi), istenen bir çalışma yoğunluğuna PBS içinde CFSE stok solüsyonu (10 mM) ile seyreltilir. CFSE-çözelti ile etiketlenmesi için 10 ⁷ hücreleri (örneğin, PBMC'ler veya T hücreleri) hazırlayın.
2. 10 dakika için 300 × g Santrifüj hücre pelet elde etmek ve süpernatant aspire.
3. Yavaşça önceden ısıtılmış (37 ° C) CFSE-çalışma çözeltisi 1 ml hücreleri yeniden süspanse edin ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca hücreler inkübe edin.
4. Fazla CFSE yıkayın için, önceden soğutulmuş (4 ° C) RPMI ortamı,% 10 FBS ihtiva eden (hacim ile) 10x hücre süspansiyonu seyreltin. 5 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj hücreleri tortu ve supernatant atın. Iki kere daha bu şekilde hücre pelletini yıkayın.
5. Santrifüj hücreleri yeniden pelet ve hücre sayısını ¹⁵ saymak. 1 ml yeni, önceden ısıtılmış lökosit tam bir ortamda 10 ⁷ hücreleri (PBMC'ler veya T hücreleri olarak) yeniden süspanse edin.

M 5. Co-kültürLökosit ve lökosit Aktivasyonu ile SC'ler

1. En fazla 30 dakika süreyle 37 ° C'ye kadar ön-sıcak MSC komple ortam (optimum MSC büyümesi için önceden test% 10 FBS (),% 1 L-glutamin ve% 1 penisilin / DMEM-düşük glikoz ortamında streptomisin).
2. 24 oyuklu plakalar içinde MSC tam orta 1 ml 50,000 hücre (MSC yoğunluğu: 25.000 hücre / ^cm2) de tohum erişkin 37 ° C kuluçka makinesi içinde ek olarak O / N, kök hücre için izin% 80 konfluansa ulaşmalarına.
3. Tohumlanmış MSC numaraları göre orta aspire ve, CFSE etiketli PBMC ekleme (daha önce işaretlenmiş lütfen yukarıda protokolü Adım 4'e bakınız), bir lökosit tam orta 1 ml (24 oyuklu plakalar içinde bir önceki güne tohumlanmış) kültürlenmiş MSC'Iere 01:10 (hücre oranı) PBMC'lerden için MKH ko-kültür oranı.
4. 1 ml lökosit tam orta toplam hacim içinde 10 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyona kadar, mitojen fitohemaglutinin (PHA), spesifik olmayan bir lökosit etkinleştirici Oyuk başına.
   1. Alternatively, özellikle T lenfositlerin aktivasyonu için uyarmak için: α-CD3 / 28, mikro-boncuklar kullanımı ve 1 bir kordon T'ye lenfosit oranını elde etmek için, iki hücre ortak-kültürünün eklemek: 1 arasındadır.
5. 500.000 PBMC / Negatif kontrol, levha (hücre yoğunluğu ya da belirli bir efektör nüfusunun lökosit: 250.000 lökosit / ^cm2) için, sadece 1 ml lökosit ortamla, 24 oyuklu bir plaka içerisinde, Pozitif kontrol için, ek olarak, iyi PBMC'lerin / aynı sayıda kaplama için 10 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar PHA ekleyin.
6. 3 ve ko-kültür deney 5 gün, fluoresein için uygun 488 nm eksitasyon ve emisyon filtreleriyle akış sitometrik analizi ¹⁷ CFSE etiketli lökosit çoğalmasının (yuvarlak dipli tüplerine yerleştirilmiştir) değerlendirir.
   Not: Akış sitometri analizi için hücre içi sitokin boyaması da mo olarak lökosit sitokin ekspresyon profili değişiklikleri değerlendirmek için, bu noktada bu KAKE etiketli lökositlere gerçekleştirilebilirMKH tarafından dulated. KAKE fluoresein için bir filtre uygun değerlendirilmiştir olduğundan, antikorlar, çeşitli sitokinler floresein veya benzer yelpazenin dışındaki fluorochromes konjuge gereken değerlendirmek için seçilen (yani, fikoeritrin, klorofil protein kompleksinin (PerCP) peridinin).

6. Varyasyon: Efektör baskılama tahlili Manyetik Aktif CFSE etiketli Efektör ^CD4 + T hücreleri üzerinde bağışıklık ayarlayıcı Lökositler MSC ile indüklenen, Boncuk seçilen

1. 6-yuvalı plakalar içinde MSC tam orta 3 ml 250,000 hücreler (MSC yoğunluğu: 25.000 hücre / ^cm2) de tohum erişkin 37 ° C kuluçka makinesi içinde ek olarak O / N, kök hücre için izin% 80 konfluansa ulaşmalarına. En az 3 ila 6 oyuklu plakalar alt popülasyonu seçimi için yeterli MSC-kültive PBMC'ler sağlamak için gereklidir.
2. Kültür ortamı basınçla, ve Adım 1 'deki gibi fakat / oyuk (hücre yoğunluğu 2.5 x 10 ⁶ hücre 6 oyuklu plakalar içinde ayrılmış PBMC ekleyin: 250,000 leLökosit tam orta 3 ml ukocytes / ^cm2). 37 ° C kuluçka makinesi içinde 48-72 saat boyunca Co-kültür.
3. Manyetik Bölüm 2-3 uyarınca MSC kaynaklı immünomodülatör lökositlerin (yani, CD14 ⁺ hücreler) spesifik nüfusu boncuk seçin.
   Notlar: akış sitometri analizi için hücre içi sitokin boyaması lökosit sitokin ekspresyon profili, yani ekspresyonunda değişiklikler için değerlendirmek üzere bu noktada gerçekleştirilebilir interlökin-10-as MSC tarafından modüle.
4. 24 oyuklu plakalar içinde Bölüm 2-4 uyarınca üretilen allojenik ^CD4 + T hücrelerinin CFSE etiketli ekle 1 lökosit komple ortam (T hücre yoğunluğu: 250.000 hücre / ^cm2) arasında mi çeşitli oranlarda Boncuk seçilen MSC kaynaklı lökosit örneğin, 1:10, 1: 5, 1: 2 ve 1: 1 oranları (hücre hücre).
5. CD4 ^{+ T hücreleri} teşvik etmek, 1 bir kordon-hücre oranı elde etmek α-CD3 / 28 konjuge mikroboncukları ekleyin: 1.
6. Negatif kontrol için, 5 plaka00.000 ^CD4 + T hücre / oyuk, 24 gözenekli bir plaka (T hücre yoğunluğu: 250.000 hücre / ^cm2) 'de, sadece 1 ml lökosit tam orta; Pozitif kontrol için, ek olarak 1, bir kordon-hücre oranını elde etmek için α-CD3 / 28 konjuge mikroboncukları eklemek / ^oyuk, CD4 + T hücreleri aynı sayıda kaplama: 1 arasındadır.
7. Eş-kültür ^3. gününde, fluoresein için uygun 488 nm eksitasyon ve emisyon filtreleriyle akış sitometrik analizi ile ¹⁶ (yuvarlak tabanlı tüp içine yerleştirilmişlerdir) CFSE etiketli ^CD4 + T hücrelerinin proliferasyonunu değerlendirmek.

Sonuçlar

Şekil 1, deney genel şema gösterir, ve Şekil 2, faz-kontrast ters mikroskobu ile gösterildiği gibi çeşitli hücre kültürü koşullarının görünümünü göstermektedir. PBMC'ler ve lökositlerin küçük yuvarlak yapışmayan hücreler iken erişkin bir fibroblastik, iğ şeklinde morfolojiye sahip yapışmayan hücreler bulunmaktadır. Bu iki morfolojik olarak farklı hücre tipleri açık bir şekilde ko-kültür görülebilir. Testin sonunda, PBMC'ler (veya leuckotyes) Akış sitomet...

Tartışmalar

Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells^18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.

One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)	Life Technologies	V12883	Cellular label for detection of cell division
Phytoagglutinin (PHA)	Sigma	L8902	Activation of human PBMCs
Dynabeads Human T-Activator CD3/28	Life Technologies	111.32D	Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.
autoMACS™ Separator	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separator	Magnetic based cell separator
autoMACS® Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101	separation columns
CD14 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101	For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875	Human PBMC/leukocyte culture medium
DMEM, Low glucose, pyruvate	Life Technologies	11885	Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Supplementation for MSC complete medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
Fetal bovine serum (FBS)	1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
24-well cell culture plate	Corning	COR3524	Co-culture plate
50 ml centrifuge tube	Corning	430291	Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
15 ml centrifuge tube	Corning	430766	Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
Round-bottom tubes	BD Falcon	352008	Collection of cells for flow cytometric analysis