Оценка иммуномодулирующими свойствами человеческой мезенхимальных стволовых клеток (МСК)

Резюме

Иммуномодулирующих свойств мезенхимальных стволовых клеток человека (MSC) появляются все более актуальным для клинического применения. Используя систему совместного культивирования МСК и лейкоцитов периферической крови до окрашенных с карбоксифлуоресцеина флуоресцентный краситель сукцинимидиловым эфира (CFSE), мы опишем оценку MSC иммуномодуляцию в пробирке на пролиферацию эффекторных лейкоцитов и конкретных групп населения.

Аннотация

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Введение

Мезенхимальных стволовых клеток человека (МСК) в соматических предшественники, которые могут дифференцироваться в приосевой мезодермальных линий кости, хряща, и жировой ткани ^1-4, а также несколько линий extramesodermal ^5. Впервые выделен из костного мозга взрослого, эти предшественники мультилинейной Были обнаружены многочисленные ткани ^6-8 и, неожиданно, показано иметь сильные иммуномодулирующими свойствами, которые появляются высоко поддаются клиническому применению ^9-12. Подробные механизмы, участвующие в иммуномодулирующих эффектов активно расследуется для эффективного применения на конкретных нозологических единиц. Один из самых простых способов оценки иммуномодуляцию является оценка для подавления лейкоцитов эффекторной распространения ^13. Большинство эффекторные лейкоциты, такие как Т-лимфоцитов и моноцитов пролиферируют необыкновенно при стимуляции или активированный. Функция Иммуномодулирующая может быть оценена, когда подавлениеРаспространение свидетельствует.

Традиционно, эффектор лейкоцитов пролиферацию оценивали путем определения ^[3 H] тимидина в ДНК. Тем не менее, этот метод имеет существенные недостатки из-за озабоченности излучения и после применения распоряжении, а также комплексное оборудование, необходимое. В то время как есть нерадиоактивные анализы для оценки клеточной пролиферации, то карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир (CFSE) анализ имеет и другие преимущества, такие как возможность для идентификации конкретных клеточных популяций, что особенно полезно в сокультуры экспериментов с участием нескольких типов клеток. CFSE представляет собой флуоресцентный краситель, который сотовой может быть оценена с помощью анализа проточной цитометрии. Как клетки делятся, интенсивность этой клеточной этикетки уменьшается пропорционально; Это не только позволяет определять пролиферации клеток общего, но также позволяет оценить по количеству делений до 8 делений прежде, чем флуоресценция становится трудно опрЭСТ против фонового сигнала. Кроме того, стабильность флуоресцентного CFSE позволяет отслеживать в естественных меченых клеток таких, что клетки могут быть визуализированы до многих месяцев ^14.

Этот анализ также может изменяться для оценки конкретных типов эффекторных лейкоцитов или функции иммуномодулирующего конкретных популяций MSC-индуцированной иммуномодулирующие лейкоциты, такие как интерлейкин-10 (IL-10) получение CD14 ⁺ моноцитов ^15, выполняя магнитное шарик выбор поверхности маркера сотовые популяции интерес до или после совместного культивирования в соответствующих случаях. Наш протокол описывает основные анализа в оценке иммуномодулирующих эффектов МСК на эффекторных лейкоцитов (схема показана на рисунке 1) и вариации на этой основной тест для оценки MSC-индуцированной лейкоцитов иммуномодуляцию на аллогенных CD4 ⁺ эффекторных Т-лимфоцитов (схема показано на рисунке 4).

протокол

Пациент информированное согласие, утвержденным этическим комитетом должно быть получено для использования клеток человека.

1. Плотность Градиент Выделение человека мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)

1. Добавить 25 мл гепаринизированной цельной крови в 50 мл пробирку на 25 мл пипеткой.
   1. Развести клетки с 25 мл фосфатно-солевом буфере (PBS).
2. Добавить 15 мл градиента Ficoll-Paque плотности в новую пробирку 50 мл, и в то время наклона трубы, очень медленно и осторожно добавить в 25 мл разбавленной клеточной суспензии через градиент плотности, так что нет смешивания цельной крови с градиент плотности, т.е.., нет помех интерфейса градиента плотности в крови.
3. Центрифуга суспензии со стадии 1.2 при 400 х г в течение 30 мин до 40 в контролируемой температурой ротора бакет-без тормоза при 20 ° С.
   Примечание: Три различных слоев должно быть очевидно, после центрифугирования: йе верхний слой плазмы существо; нижняя прозрачный слой является градиент Ficoll-Paque плотность; и тонкий, средний слой сотовой будучи МНПК
4. Аспирируйте и выбросить верхний слой отсасыванием пипеткой Пастера, с осторожностью, чтобы не нарушить межфазного слоя мононуклеарных клеток (например, лимфоцитов, моноцитов и тромбоцитов).
5. Осторожно собрать эту мононуклеарных клеток слой с 10 мл пипетки к новому 50 мл центрифужную пробирку.
6. Заполните трубку с 20 мл PBS, хорошо перемешать и центрифуге при 300 × г в течение 10 мин при 20 ° С. Удалить супернатант полностью после центрифугирования.
7. Ресуспендируют осадок клеток в 20 мл PBS и в центрифуге при 200 × г в течение 10-15 мин при температуре 20 ° С. Удалить супернатант полностью после центрифугирования.
   Примечание: Этот шаг удаляет тромбоциты-которые-нежелательный в МНПК; Этот шаг может быть повторен для обеспечения полного удаления тромбоцитов.
8. Если выбор конкретных популяций нежелательно, ресуспендируют осадок клеток в лейкоцитарной полной среде (10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина в RPMI-1640 среде) для культивирования после выполнения подсчет клеток ¹⁶ приостановить 1 мл среднего за 10 ⁷ МНПК, прежде чем приступить к следующему шагу.

2. Магнитный Маркировка лейкоцитов населения (перейдите к шагу 4, если нет Выбор конкретных группах населения не требуется)

1. Центрифуга РВМС подвески при 300 х г в течение 10 мин и супернатант аспирата полностью.
2. Ресуспендируют осадок клеток в 80 мкл PBS на 10 ⁷ всех клеток.
3. Добавьте 20 мкл указанных магнитных шариков (т.е. CD14 магнитных шариков для изоляции моноцитов, лимфоцитов CD4 магнитных шариков для выделения Т-лимфоцитов) на 10 ⁷ всех клеток.
4. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 15 мин при 2 до 8 ° С в холодильнике.
5. Добавьте 1-2 мл PBS на 10 ⁷ клеток, чтобы вымыть и центрифугипри 300 х г в течение 10 мин.
6. Отберите супернатант и ресуспендируют полностью до 10 ⁸ клеток в 500 мкл PBS.

3. Магнитный Выбор субпопуляций лейкоцитов

Примечание: Различные магнитных сепараторов и колонн бортовых доступны для выделения специфических лейкоцитов населения по клеточной поверхности маркера из числа производителей. Изоляция может быть положительной селекции на основе одного или нескольких положительных маркеров или отрицательного отбора после истощения нежелательных групп населения. Общий подход к выполнению положительный выбор, используя один маркер (т.е. CD4 Т-хелперов для лимфоцитов, CD14 или для моноцитов) приводится ниже.

1. Подготовка и премьер-магнитный сепаратор, включая разделительную колонну в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Применение трубки, содержащей образец меченых РВМС. Обеспечить два 15 мл центрифужные пробирки для сбора положительно надписью и unlabelсотовые фракции Эд, следующие инструкции изготовителя.
3. Граф клеток ^номер 15 и ресуспендируют положительно выбранные лейкоциты (например, ^CD4 + Т-лимфоциты или CD14 ⁺ клеток) в полной среде лейкоцитов, используя 1 мл среды на 10 ⁷ клеток.

4. CFSE Окрашивание лейкоцитов для оценки распространения

Примечание: CFSE широко используется в иммунологических исследований, и для в естественных условиях и в пробирке исследования. Наш протокол был оптимизирован для изучения в пробирке MSC / РВМС (или других лейкоцитов) взаимодействий. В то время как общие этапы проведения CFSE в пробирке маркировки схожи, могут быть различия в определенной дозе и времени протокола ^14. Это может быть из-за ряда факторов, т.е. конкретного типа используемой клетки количества клеток использовали-которые могут, вероятно, влияет на интенсивность флуоресцентного сигнала CFSE.

1. Развести маточного раствора CFSE (10 мм) в PBS к желаемой рабочей концентрации 10 мкМ (CFSE-рабочий раствор). Подготовка 10 ⁷ клеток (например, МПК или Т-клетки) для маркировки с CFSE-рабочего раствора.
2. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин, чтобы получить клеточный осадок и аспирата супернатант.
3. Ресуспендируют клеток осторожно в 1 мл подогретого (37 ° С) CFSE-рабочий раствор и инкубируют клетки в течение 10 мин при 37 ° С.
4. Смыть избыток CFSE, разбавленной клеточной суспензии с 10x (по объему) предварительно охлажденного (4 ° С) среды RPMI, содержащей 10% FBS. Осадка клеток путем центрифугирования при 300 мкг в течение 5 мин и отбросить супернатант. Промыть осадок клеток в этой манере в два раза больше.
5. Re-осаждения клеток центрифугированием и рассчитывать количество клеток ^15. Ресуспендируют 10 ⁷ клеток (МНПК либо или Т-клетки) в 1 мл свежего, предварительно нагретой лейкоцитов полной среде.

5. Совместное культивирование МСК с лейкоцитами и активации лейкоцитов

1. Предварительно теплой MSC полную среду (10% FBS (предварительное тестирование для оптимального роста MSC), 1% L-глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина в среде DMEM-среде низкой глюкозы) до 37 ° С в течение не более 30 мин.
2. Семенной МСК при 50000 клеток в 1 мл MSC полной среде в 24-луночные планшеты (плотность MSC: 25000 клеток ^/ см 2) для крепления O / N в 37 ° С инкубатор, что позволяет стволовых клеток, чтобы достичь 80% слияния.
3. Аспирируйте средний, и на основе сеяных чисел MSC, добавить CFSE меченные МНПК (ранее помечены-пожалуйста, обратитесь к протоколу шаге 4) в культивируемых МСК (посеяна в предыдущий день в 24-луночных планшетах) в 1 мл лейкоцитов полной среде при 1:10 (соотношение клеток) отношение ко-культура МСК в МНПК.
4. Добавить митогеном фитогемагглютинином (ФГА), неспецифический лейкоцитов активатор, до конечной концентрации 10 мкг / мл в общем объеме 1 мл полной среды лейкоцитов на лунку.
   1. АльтернативныеЭли, чтобы стимулировать для активации Т-лимфоцитов в частности: использование альфа-CD3 / 28 микрошарики и добавить к двуклеточной совместного культивирования для получения коэффициента шарика к Т-лимфоцитов 1: 1.
5. Для отрицательного контроля, пластины 500000 РВМС / лунку (или конкретной популяции эффекторных лейкоцитов, плотность клеток: 250000 лейкоцитов / см ²⁾ в 24-луночный планшет с 1 мл полного лейкоцитов только среды; для положительного контроля, в дополнение к покрывать такое же количество РВМС / лунку добавляют РНА до конечной концентрации 10 мкг / мл.
6. На 3-м и 5-й день эксперимента сокультуры, оценки распространения CFSE-меченых лейкоцитов (в круглых дно пробирки) по анализу проточной цитометрии ¹⁷ с 488 нм возбуждения и эмиссии фильтров, подходящих для флуоресцеина.
   Примечание: внутриклеточное окрашивание цитокинов для анализа проточной цитометрии также может быть выполнена с этим CFSE меченных лейкоцитов в этой точке на предмет изменений в лейкоцитарной цитокинов профиля экспрессии как Моdulated по МСК. Так CFSE оценивается с фильтром подходящей для флуоресцеина, антитела выбран оценить различные цитокины должны быть конъюгированы с другими, чем флуоресцеина или аналогичного спектра флюорохромами (т.е. фикоэритрин, перидинина хлорофилла белкового комплекса (PerCP)).

6. Изменение: Эффектор Подавление Анализ магнитного бисера выбраны, МСЦ-индуцированной иммуномодулирующее лейкоцитов на активированном CFSE-меченых Эффектор ^CD4 + Т-клеток

1. Семенной МСК на 250000 клеток в 3 мл MSC полной среде в 6-луночных планшетах (плотность MSC: 25000 клеток / ^см 2) для крепления O / N в 37 ° C инкубатора, позволяющих стволовых клеток, чтобы достичь 80% слияния. По крайней мере, 3 6-луночные планшеты необходимы для обеспечения достаточного MSC-сокультивировали МНПК для выбора субпопуляционного.
2. Аспирируйте среднего и добавьте МНПК разделенных в соответствии Шаг 1, но в 6-луночных планшетах при 2,5 х 10 ^{6 клеток} / лунку (плотности клеток: 250000 леukocytes / см ²⁾ с 3 мл полной среды лейкоцитов. Совместное культивирование в течение 48-72 ч в 37 ° C инкубаторе.
3. Магнитный шарик-выберите конкретную популяцию МСК-индуцированных иммуномодулирующих лейкоцитов (то есть, CD14 ⁺ клеток), как в разделах 2-3.
   Примечания: Внутриклеточное окрашивание цитокинов для анализа проточной цитометрии могут быть выполнены в этот момент на предмет изменений в экспрессии лейкоцитов профиль цитокинов, т.е. экспрессии интерлейкина-10-а модулируется МСК.
4. Добавить CFSE меченных аллогенных ^CD4 + Т-клеток, полученных в соответствии с разделами 2-4 в 24-луночных планшетах в 1 мл лейкоцитов полного (плотности Т-клеток: 250000 клеток / см ²⁾ от среднего до борта выбранный МСЦ-индуцированных лейкоцитов в различных соотношениях , т.е. 1:10, 1: 5, 1: 2 и 1: 1 (элементов) соотношений.
5. Чтобы стимулировать ^CD4 + Т-клеток, добавить альфа-CD3 / 28 конъюгированные микрошарики, чтобы получить соотношение шарик к клетке 1: 1.
6. Для отрицательного контроля, пластина 500000 ^CD4 + Т-клеток / лунку в (плотности Т-клеток: 250000 клеток / см ²⁾ 24-луночного планшета с 1 мл лейкоцитов полной только среды; для положительного контроля, в дополнение к покрывать такое же количество ^CD4 + Т-клеток / лунка, добавить альфа-CD3 / 28 конъюгированные микрошарики, чтобы получить соотношение шарик к клетке 1: 1.
7. На ^{3-й день} совместного культивирования, оценки распространения CFSE меченных ^CD4 + Т-клеток (в круглых дно пробирки) с помощью анализа потока цитометрии ¹⁶ с 488 нм возбуждения и эмиссии фильтров, подходящих для флуоресцеина.

Результаты

Рисунок 1 обозначает общую схему эксперимента, и 2 показан внешний вид различных условиях культивирования клеток, визуализированных с помощью качестве фазово-контрастной микроскопии перевернутой. МСК в прилипшие клетки фибробластов с, веретенообразной морфологией, в то время ?...

Обсуждение

Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells^18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.

One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)	Life Technologies	V12883	Cellular label for detection of cell division
Phytoagglutinin (PHA)	Sigma	L8902	Activation of human PBMCs
Dynabeads Human T-Activator CD3/28	Life Technologies	111.32D	Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.
autoMACS™ Separator	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separator	Magnetic based cell separator
autoMACS® Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101	separation columns
CD14 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101	For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875	Human PBMC/leukocyte culture medium
DMEM, Low glucose, pyruvate	Life Technologies	11885	Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Supplementation for MSC complete medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
Fetal bovine serum (FBS)	1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
24-well cell culture plate	Corning	COR3524	Co-culture plate
50 ml centrifuge tube	Corning	430291	Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
15 ml centrifuge tube	Corning	430766	Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
Round-bottom tubes	BD Falcon	352008	Collection of cells for flow cytometric analysis