Valutazione della proprietà immunomodulanti di cellule staminali mesenchimali umane (MSC)

Riepilogo

Le proprietà immunomodulanti di cellule umane staminali mesenchimali (MSC) appaiono sempre più rilevante per l'applicazione clinica. Utilizzando un sistema di co-coltura di cellule staminali mesenchimali e leucociti del sangue periferico pre-colorati con il colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE), si descrive la valutazione in vitro di MSC immunomodulazione sulla proliferazione dei leucociti effettrici e sottopopolazioni specifiche.

Abstract

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Introduzione

Le cellule staminali mesenchimali umane (MSC) sono progenitrici somatiche che possono differenziarsi in lignaggi mesodermiche parassiali di ossa, cartilagine e tessuto adiposo ^1-4, così come ad alcuni lignaggi extramesodermal ^5. In primo luogo isolato dal midollo osseo adulto, questi progenitori multilineage ora sono state trovate in numerosi tessuti ^6-8 e, inaspettatamente, dimostrato di avere forti proprietà immunomodulanti che sembrano altamente suscettibili di applicazione clinica ^9-12. Meccanismi dettagliati coinvolti negli effetti immunomodulatori sono attivamente indagati dell'effettiva applicazione in entità patologiche specifiche. Uno dei modi più semplici per valutare immunomodulazione è valutando per la soppressione di effettori leucociti proliferazione ^13. La maggior parte dei leucociti effettrici quali T linfociti e monociti proliferano prodigiosamente quando stimolato o attivato. Funzione immunomodulante può essere valutata quando la soppressione diproliferazione è evidenziato.

Tradizionalmente, effettore leucociti proliferazione è stata valutata mediante rilevamento di ^[3 H] timidina nel DNA. Tuttavia, questo metodo ha svantaggi significativi a causa delle preoccupazioni di radiazioni e smaltimento post-utilizzo, così come il complesso attrezzature necessarie. Mentre ci sono saggi non radioattivi per valutare la proliferazione cellulare, l'estere carboxyfluorescein succinimidil (CFSE) test ha anche altri vantaggi come ad esempio consentendo l'identificazione delle popolazioni cellulari specifiche, il che è particolarmente utile in esperimenti di co-coltura di cellule che coinvolgono molteplici tipi. CFSE è un colorante cellulare fluorescente che può essere valutata mediante l'analisi di citometria di flusso. Come le cellule si dividono, l'intensità di questa etichetta cellulare diminuisce proporzionalmente; questo permette non solo la determinazione della proliferazione cellulare complessiva ma anche permette di valutare il numero di divisioni cellulari fino a 8 divisioni prima fluorescenza diventa difficile detect contro segnale di fondo. Inoltre, la stabilità della fluorescenza CFSE permette il monitoraggio in vivo di cellule marcate tali che le cellule possono essere visualizzati fino a molti mesi ^14.

Questo test può anche essere variata per valutare specifici tipi di leucociti effettrici o la funzione immunomodulante di specifiche popolazioni di MSC indotta leucociti-come immunomodulatori l'interleuchina-10 (IL-10), la produzione di ^monociti CD14 + ¹⁵ eseguendo magnetico tallone selezione marcatore superficie popolazioni di cellule di interesse prima o dopo co-coltura a seconda dei casi. Il nostro protocollo descrive il saggio base di valutare gli effetti immunomodulatorie delle MSC sui leucociti effettrici (diagramma di flusso mostrato nella Figura 1) e una variazione su questo test base per la valutazione di MSC indotta immunomodulazione leucociti su allogeniche CD4 ⁺ effettrici linfociti T (diagramma di flusso mostrato in figura 4).

Protocollo

Il consenso informato del paziente, come approvato dal comitato istituzionale di revisione deve essere ottenuto per l'uso di cellule umane.

1. Densità Isolamento gradiente di cellule periferiche mononucleari Sangue umano (PBMC)

1. Aggiungere 25 ml di sangue intero eparinizzati in un tubo da 50 ml con una pipetta 25 ml.
   1. Diluire le cellule con 25 ml di PBS (PBS).
2. Aggiungere 15 ml di gradiente di densità Ficoll-Paque in un nuovo tubo 50 ml, e mentre inclinando il tubo, molto lentamente e con attenzione aggiungono in 25 ml di sospensione cellulare diluita su gradiente di densità in modo che non vi è alcuna miscelazione del sangue intero con gradiente di densità, cioè., nessun disturbo dell'interfaccia gradiente di densità del sangue.
3. Centrifugare la sospensione dal punto 1.2 a 400 g per 30 e 40 minuti in un rotore oscillante secchiello temperatura controllata senza freno a 20 ° C.
   Nota: Tre strati distinti dovrebbero essere evidenti dopo la centrifugazione: °e l'essere al plasma strato superiore; lo strato inferiore è chiaro gradiente di densità Ficoll-Paque; e uno strato cellulare sottile, centrale è il PBMCs
4. Aspirare e scartare lo strato superiore per aspirazione con una pipetta Pasteur, con attenzione a non disturbare lo strato interfase delle cellule mononucleate (cioè, linfociti, monociti e piastrine).
5. Raccogliere accuratamente questo strato di cellule mononucleate con una pipetta 10 ml in un tubo da centrifuga da 50 ml.
6. Riempire il tubo con 20 ml di PBS, mescolare bene e centrifugare a 300 xg per 10 min a 20 ° C. Rimuovere il surnatante completamente dopo la centrifugazione.
7. Risospendere il pellet cellulare in 20 ml di PBS e centrifugare a 200 xg per 10-15 minuti a 20 ° C. Rimuovere il surnatante completamente dopo la centrifugazione.
   Nota: Questo passaggio rimuove le piastrine-che sono indesiderate, all'interno delle PBMC; questo passaggio può essere ripetuto per assicurare la rimozione completa delle piastrine.
8. Se nessuna selezione di popolazioni specifiche èdesiderato, pellet cellulare risospendere in leucociti terreno completo (10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di L-glutammina, e 1% di penicillina / streptomicina in terreno RPMI-1640) per la coltura, dopo l'esecuzione di un numero di cellule ¹⁶ di sospendere 1 ml di medio per 10 ⁷ PBMC prima di procedere alla fase successiva.

2. magnetica Etichettatura dei leucociti popolazioni (passare alla Fase 4 se nessuna selezione di popolazioni specifiche è obbligatorio)

1. Sospensione centrifugare PBMC a 300 × g per 10 minuti e aspirare il surnatante completamente.
2. Pellet cellulare Risospendere in 80 ml ​​di PBS per 10 ⁷ cellule totali.
3. Aggiungere 20 ml di sfere magnetiche specifici (ad esempio, CD14 sfere magnetiche per l'isolamento dei monociti, CD4 sfere magnetiche per l'isolamento dei linfociti T) per 10 ⁷ cellule totali.
4. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 2 e 8 ° C in frigorifero.
5. Aggiungere 1-2 ml di PBS per 10 ⁷ cellule per lavare e centrifugarea 300 g per 10 min.
6. Aspirare il surnatante e risospendere completamente fino a 10 ⁸ cellule in 500 ml di PBS.

3. magnetica Selezione delle sottopopolazioni di leucociti

Nota: Una varietà di separatori perline magnetiche e le colonne sono disponibili per l'isolamento della specifica popolazione di leucociti da marcatore di superficie cellulare da un certo numero di produttori. L'isolamento può essere da una selezione positiva sulla base di uno o pochi marcatori positivi o selezione negativa dopo l'esaurimento delle popolazioni indesiderate. Un orientamento generale di eseguire selezione positiva utilizzando un marcatore (ad esempio, per i linfociti T CD4 helper, o CD14 per i monociti) è indicato di seguito.

1. Preparare e separatore magnetico primo compresa colonna di separazione secondo le istruzioni del produttore.
2. Applicare provetta contenente il campione di PBMC etichettati. Fornire due 15 ml provette per la raccolta dell 'ed unlabel etichettata positivamentefrazioni cellulari ndr, seguendo le istruzioni del produttore.
3. Contare il numero di cellule ¹⁵ e sospendere nuovamente le leucociti selezionati positivamente (ad esempio, linfociti ^T CD4 + CD14 ⁺ o cellule) in leucociti terreno completo, utilizzando 1 ml di terreno per 10 ⁷ cellule.

4. CFSE colorazione di leucociti per la valutazione di proliferazione

Nota: CFSE è stato ampiamente utilizzato in indagini immunologiche, sia in vivo e in vitro. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per lo studio in vitro di MSC / PBMC (o altri leucociti) interazioni. Mentre i passaggi generali coinvolti nella conduzione CFSE etichettatura in vitro sono simili, ci possono essere differenze di dosaggio specifica e la tempistica del protocollo ^14. Ciò può essere dovuto a una serie di fattori, vale a dire, il tipo di cellula specifico utilizzato, il numero di cellule utilizzate-che possono probabilmente influenzare l'intensità del segnale fluorescente CFSE.

1. Diluire la soluzione CFSE magazzino (10 mm) in PBS alla concentrazione di lavoro desiderata di 10 micron (soluzione CFSE-lavoro). Preparare 10 ⁷ cellule (ad esempio, PBMC o cellule T) per l'etichettatura con la soluzione CFSE-lavoro.
2. Centrifugare a 300 g per 10 minuti per ottenere un pellet di cellule e aspirare il surnatante.
3. Risospendere delicatamente le cellule in 1 ml di soluzione di pre-riscaldato (37 ° C) CFSE-lavoro e incubare le cellule per 10 min a 37 ° C.
4. Per lavare eccesso CFSE, diluire la sospensione cellulare con 10x (in volume) di preraffreddato (4 ° C) RPMI mezzo contenente 10% FBS. Sedimentare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Lavare il pellet di cellule in questo modo per altre due volte.
5. Re-agglomerare le cellule per centrifugazione e contare il numero di cellule ^15. Risospendere 10 ⁷ cellule (sia PBMC o cellule T) in 1 ml di fresco leucociti preriscaldata terreno completo.

5. Co-coltura di MSC con leucociti e attivazione dei leucociti

1. Pre-caldo MSC terreno completo (10% FBS (pretestati per una crescita ottimale MSC), 1% L-glutammina, 1% di penicillina e / streptomicina in terreno di glucosio DMEM-basso) a 37 ° C per non più di 30 min.
2. MSC Seed a 50.000 cellule in 1 ml di MSC terreno completo in piastre da 24 pozzetti (densità MSC: 25.000 cellule / cm ²⁾ per il fissaggio O / N in un incubatore a 37 °, consentendo alle cellule staminali di raggiungere l'80% di confluenza.
3. Media Aspirare, e sulla base di numeri MSC teste di serie, aggiungere PBMC CFSE etichettati (precedentemente etichettata-consultare sopra protocollo punto 4) a MSC coltivati ​​(testa di serie il giorno precedente in piastre da 24 pozzetti) in 1 ml di leucociti terreno completo in un 01:10 (rapporto cellulare) Rapporto co-coltura delle cellule staminali mesenchimali per PBMC.
4. Aggiungere il mitogeno fitoemoagglutinina (PHA), un non-specifico attivatore leucociti, ad una concentrazione finale di 10 ug / ml in un volume totale di 1 ml leucociti terreno completo per pozzetto.
   1. Alternatively, per stimolare l'attivazione dei linfociti T in particolare: utilizzare alfa-CD3 / 28 microsfere e aggiungere al due cellule co-coltura per ottenere un rapporto di linfociti da tallone a T di 1: 1.
5. Per il controllo negativo, piatto 500.000 PBMC / bene (o di una specifica popolazione effettore leucocitaria; densità cellulare: 250.000 leucociti / cm ²⁾ in un 24-pozzetti con 1 ml di leucociti solo terreno completo; per il controllo positivo, oltre alla placcatura lo stesso numero di PBMC / pozzetto, aggiungere PHA ad una concentrazione finale di 10 mg / ml.
6. Al 3 ° e 5 ° giorno dell'esperimento co-coltura, valutare la proliferazione dei leucociti CFSE marcati (posto in tubi tondi-basso) mediante analisi di citometria di flusso ^{17 con} 488 nm di eccitazione ed emissione di appositi filtri per fluoresceina.
   Nota: intracellulare colorazione citochine per citometria a flusso può essere eseguita anche a questi leucociti CFSE marcato a questo punto per valutare per i cambiamenti nel profilo di espressione dei leucociti citochine come modulated da MSC. Poiché CFSE viene valutata con un adeguato filtro per fluoresceina, gli anticorpi selezionati per valutare varie citochine devono essere coniugato con fluorocromi diversi fluoresceina o spettro simile (ad esempio, ficoeritrina, peridinina complesso proteico clorofilla (PerCP)).

6. Variazione: Effector Soppressione Assay magnetico Bead-selezionata, MSC-indotta immunomodulante leucociti attivati ​​su CFSE etichettati cellule effettrici ^CD4 + T

1. MSC Seed a 250.000 cellule in 3 ml di MSC terreno completo a 6 pozzetti (densità MSC: 25.000 cellule / cm ²⁾ per il fissaggio O / N in un incubatore a 37 °, consentendo alle cellule staminali di raggiungere l'80% di confluenza. Almeno 3 6 pozzetti sono necessari per garantire sufficiente di PBMC MSC-messi in coltura per la selezione sottopopolazione.
2. Aspirare il terreno, e aggiungere PBMC separati secondo la Fase 1, ma in 6 pozzetti a 2,5 x 10 ⁶ cellule / pozzetto (densità delle cellule: 250.000 leukocytes / cm ²⁾ con 3 ml di terreno completo leucociti. Co-coltura per 48-72 ore in un incubatore a 37 °.
3. Magnetic bead-seleziona specifica popolazione di leucociti immunomodulatori MSC-indotta (ad esempio, CD14 ⁺ cellule) come da Sezioni 2-3.
   Note: colorazione intracellulare di citochine per l'analisi citometrica possono essere eseguite a questo punto per valutare variazioni di leucociti citochine profilo di espressione, cioè, espressione di interleuchina-10 come modulati dal MSC.
4. Add CFSE marcato allogeniche ^cellule T CD4 + generati secondo le sezioni 2-4 in piastre da 24 pozzetti in 1 ml di leucociti completa (densità delle cellule T: 250.000 cellule / cm ²⁾ a medio leucociti MSC-indotta tallone-selezionato a vari rapporti , cioè, 1:10, 1: 5, 1: 2 e 1: 1 (cella per cella) rapporti.
5. Per stimolare le cellule ^T CD4 +, aggiungere alfa-CD3 / 28 microsfere coniugati per ottenere un rapporto di tallone-cellula di 1: 1.
6. Per un controllo negativo, piatto 500.000 ^cellule T CD4 + / bene in un (densità cellulare T: 250.000 cellule / cm ²⁾ 24-pozzetti con 1 ml di leucociti solo terreno completo; per il controllo positivo, oltre alla placcatura lo stesso numero di cellule CD4 ⁺ T / pozzetto, aggiungere alfa-CD3 / 28 microsfere coniugate ad ottenere un rapporto da tallone a cella di 1: 1.
7. Il giorno ³ ° di co-coltura, valutare la proliferazione di CFSE etichettati ^cellule T CD4 + (posti in tubi tondi fondo) per citometria a flusso di analisi ^{16 con} 488 nm di eccitazione ed emissione di appositi filtri per fluoresceina.

Risultati

Figura 1 denota lo schema generale dell'esperimento, e la figura 2 mostra l'aspetto delle diverse condizioni di coltura cellulare come visualizzato in contrasto di fase invertita microscopia. Le MSC sono cellule aderenti con fibroblastica, morfologia a forma di fuso, mentre PBMC e leucociti sono piccole cellule non aderenti rotonde. Questi due tipi di cellule morfologicamente differenti può essere visto chiaramente nella co-coltura. Al termine del test, quando le PBMC (o leuckotyes) vengono aspirat...

Discussione

Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells^18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.

One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)	Life Technologies	V12883	Cellular label for detection of cell division
Phytoagglutinin (PHA)	Sigma	L8902	Activation of human PBMCs
Dynabeads Human T-Activator CD3/28	Life Technologies	111.32D	Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.
autoMACS™ Separator	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separator	Magnetic based cell separator
autoMACS® Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101	separation columns
CD14 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101	For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875	Human PBMC/leukocyte culture medium
DMEM, Low glucose, pyruvate	Life Technologies	11885	Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Supplementation for MSC complete medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
Fetal bovine serum (FBS)	1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
24-well cell culture plate	Corning	COR3524	Co-culture plate
50 ml centrifuge tube	Corning	430291	Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
15 ml centrifuge tube	Corning	430766	Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
Round-bottom tubes	BD Falcon	352008	Collection of cells for flow cytometric analysis