Avaliação das propriedades imunomoduladora de mesenquimais humanas Células-Tronco (MSCs)

Resumo

As propriedades imunomoduladoras de células-tronco mesenquimais humanas (MSC) aparecem cada vez mais relevante para a aplicação clínica. Usando um sistema de co-cultura de MSCs e leucócitos do sangue periférico de pré-corados com o éster succinimidilo corante fluorescente carboxifluoresceína (CFSE), descreve-se a avaliação in vitro de MSC imunomodulação em proliferação e subpopulações efectoras de leucócitos específicos.

Resumo

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Introdução

Células estaminais mesenquimais humanas (MSCs) são progenitores somáticas que podem se diferenciar em linhagens mesodérmicos paraxiais as de osso, cartilagem, tecido adiposo e ^1-4, bem como a um extramesodermal algumas linhagens ^5. Primeiro isolada a partir da medula óssea adulta, estes progenitores multilinhagem foram agora encontrados em vários tecidos e ^6-8, inesperadamente, mostraram ter fortes propriedades imunomoduladoras que aparecem altamente passível de aplicação clínica ^9-12. Mecanismos detalhados envolvidos nos efeitos imunomoduladores estão ativamente sendo investigado por aplicação efectiva sobre as entidades de doenças específicas. Uma das maneiras mais simples para avaliar imunomodulação é através da avaliação para a supressão da efetoras de leucócitos proliferação ^13. A maioria dos leucócitos, tais como linfócitos efectores T e monócitos proliferar prodigiously quando estimulado ou activado. Função imunomoduladora pode ser avaliado quando a supressão deproliferação é evidenciado.

Tradicionalmente, a proliferação de leucócitos efectoras foi avaliada por detecção de ^[3 H] timidina em ADN. No entanto, este método tem desvantagens significativas, devido às preocupações de radiação e descarte pós-uso, bem como os equipamentos complexos necessários. Embora existam ensaios não radioactivos a fim de avaliar a proliferação celular, o éster de succinimidilo carboxifluoresceína (CFSE) ensaio tem outras vantagens tais como permitindo a identificação de populações celulares específicas, o que é especialmente útil em experiências de co-cultura, envolvendo vários tipos de células. CFSE é um corante fluorescente que celular pode ser avaliada por análise de citometria de fluxo. Como as células se dividem, a intensidade desta etiqueta celular é diminuída proporcionalmente; Isto não só possibilita a determinação da proliferação celular em geral, mas também permite a avaliação do número de divisões celulares até 8 divisões a fluorescência antes torna-se difícil para detect contra sinal de fundo. Além disso, a estabilidade do CFSE fluorescente in vivo permite a identificação de células que tais células marcadas podem ser visualizadas até diversos meses ^14.

Este ensaio pode também ser variada para avaliar tipos específicos de leucócitos efectoras ou a função imunomodulatória de populações específicas de MSC induzida por leucócitos, tais imunomoduladores como ^monócitos CD14 + a interleucina-10 (IL-10), produzindo ¹⁵ efectuando magnética talão selecção de marcadores de superfície populações de células de interesse antes ou após a co-cultura, conforme adequado. Nosso protocolo descreve o ensaio de base de avaliar os efeitos imunomoduladores de MSCs em leucócitos efectoras (diagrama de fluxo mostrado na Figura 1) e uma variação deste ensaio de base para a avaliação da induzida por MSC imunomodulação de leucócitos nos linfócitos CD4 ⁺ efectoras alogénicas T (fluxograma mostrado na Figura 4).

Protocolo

O consentimento informado do paciente conforme aprovado pelo conselho de revisão institucional deve ser obtido para o uso de células humanas.

1. Densidade de isolamento gradiente de sangue periférico humano as células mononucleares (PBMC)

1. Adicionar 25 ml de sangue total heparinizado em um tubo de 50 ml por uma pipeta de 25 ml.
   1. Dilui-se as células com 25 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Adicionar 15 ml de gradiente de densidade de Ficoll-Paque em um novo tubo de 50 ml, e, enquanto a inclinação do tubo, muito lentamente e cuidadosamente adicionar 25 ml da suspensão diluída de células ao longo do gradiente de densidade, de modo que não há mistura do sangue total com o gradiente de densidade, isto é., há perturbação da interface do gradiente de densidade de sangue.
3. Centrifugar a suspensão a partir do passo 1.2 a 400 x g durante 30 a 40 min num rotor de balde oscilante-de temperatura controlada sem travão a 20 ° C.
   Nota: Três camadas distintas deve ser aparente após centrifugação: the camada superior de plasma estar; a camada clara de fundo sendo o gradiente de densidade Ficoll-Paque; e uma camada celular fina, sendo o meio PBMC
4. Aspirar e desprezar o camada superior por sucção com uma pipeta de Pasteur, com o cuidado de não perturbar a camada de células mononucleares de interfase (isto é, linfócitos, monócitos e plaquetas).
5. Recolher cuidadosamente a camada de células mononucleares com uma pipeta de 10 mL para um novo tubo de centrífuga de 50 ml.
6. Encher o tubo com 20 ml de PBS, misturar bem, e centrifugar a 300 x g durante 10 min a 20 ° C. Remover o sobrenadante completamente após centrifugação.
7. Ressuspender o sedimento celular em 20 ml de PBS e centrifugar a 200 x g durante 10-15 minutos a 20 ° C. Remover o sobrenadante completamente após centrifugação.
   Nota: Esta etapa remove as plaquetas-que são indesejados-nos PBMC; este passo pode ser repetido para assegurar a remoção completa das plaquetas.
8. Se nenhuma seleção de populações específicas édesejado, sedimento de células ressuspender em leucócitos meio completo (10% soro fetal de bovino (FBS), 1% de L-glutamina, e 1% de penicilina / estreptomicina, em meio RPMI-1640) para cultura após a realização de uma contagem de células ¹⁶ para suspender a 1 ml de médio por 10 ⁷ PBMC antes de prosseguir para a próxima etapa.

2. Rotulagem magnética de Leucócitos Populações (pule para o passo 4 se nenhuma seleção de populações específicas é Obrigatório)

1. Centrifugar a suspensão de PBMC a 300 × g durante 10 min e o sobrenadante aspirado completamente.
2. Ressuspender o sedimento celular em 80 ul de PBS por 10 ⁷ células totais.
3. Adicionar 20 uL de pérolas magnéticas especificados (isto é, CD14 esferas magnéticas para isolamento de monócitos CD4, esferas magnéticas para isolamento de linfócitos T) por 10 ⁷ células totais.
4. Misturar bem e incubar durante 15 min a 2 a 8 ° C no frigorífico.
5. Adicionar 1-2 ml de PBS por 10 ⁷ células para lavar e centrifugara 300 x g durante 10 min.
6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender completamente até ⁸ 10 células em 500 ul de PBS.

3. Seleção Magnética de subpopulações de leucócitos

Nota: Uma variedade de separadores de esférulas magnéticas e colunas estão disponíveis para o isolamento de populações específicas de leucócitos pelo marcador de superfície celular de uma série de fabricantes. O isolamento pode ser por selecção positiva com base em um ou alguns marcadores positivos ou por selecção negativa após a depleção de populações indesejadas. Uma abordagem geral de efectuar a selecção positiva usando um marcador (isto é, CD4 de linfócitos T auxiliares, ou de monócitos CD14) é descrito a seguir.

1. Preparar e separador magnético privilegiada incluindo coluna de separação de acordo com as instruções do fabricante.
2. Aplicar tubo contendo a amostra de PBMCs rotulados. Fornecer dois tubos de centrífuga de 15 ml para recolha do e unlabel marcado positivamentefrações celulares ed, seguindo as instruções do fabricante.
3. Contar o número de células ¹⁵ e ressuspender os leucócitos seleccionados positivamente (isto é, linfócitos ^T CD4 + ou ^CD14 + células) em meio completo de leucócitos, usando 1 ml de meio por 10 ⁷ células.

4. CFSE Coloração de leucócitos para avaliação da proliferação

Nota: CFSE tem sido amplamente utilizada em investigações imunológicas, tanto in vivo e in vitro. Nosso protocolo foi otimizado para estudo in vitro da MSC / PBMC (ou outros leucócitos) interações. Enquanto os passos gerais envolvidos na realização de CFSE marcação in vitro são semelhantes, pode haver diferenças na dose específica e tempo do protocolo ^14. Isto pode ser devido a um número de factores, isto é, o tipo específico de célula utilizado, o número de células utilizadas-que podem provavelmente afectar a intensidade do sinal fluorescente CFSE.

1. Dilui-se a solução de estoque de CFSE (10 mM) em PBS para a concentração de trabalho pretendida de 10 ^ M (solução de trabalho CFSE-). Prepare 10 ⁷ células (isto é, PBMCs ou células T) para marcação com a solução CFSE-working.
2. Centrifuga-se a 300 x g durante 10 minutos para se obter uma pelete de células e o sobrenadante aspirado.
3. Ressuspender as células suavemente em 1 ml de solução de pré-aquecido (37 ° C) CFSE-trabalho e incubar as células durante 10 min a 37 ° C.
4. Para lavar o excesso de CFSE, diluir a suspensão de células com 10 vezes (em volume) de pré-arrefecida (4 ° C), meio RPMI contendo 10% de FBS. Sedimentar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Lava-se a pelete de células desta forma duas vezes mais.
5. Re-sedimentar as células por centrifugação e contar o número de células ^15. Ressuspender 10 ⁷ células (quer PBMCs ou células T) em 1 mL de meio completo pré-aquecido de leucócitos fresco.

5. Co-cultura de MSCs com leucócitos e activação de leucócitos

1. Pré-quente MSC meio completo (10% de FBS (pré-testados para o crescimento óptimo MSC), 1% de L-glutamina, e 1% de penicilina / estreptomicina, em meio DMEM-baixo teor de glucose) a 37 ° C durante não mais do que 30 min.
2. MSCs semente a 50.000 células em 1 ml de MSC meio completo em placas de 24 poços (densidade MSC: 25.000 células ^/ cm2) para a ligação O / N em uma temperatura de 37 ° C incubadora, permitindo para as células estaminais para alcançar 80% de confluência.
3. Meio aspirado, e com base em números de MSC sem sementes, adicionar PBMC CFSE-marcadas (previamente marcado com consulte protocolo Passo 4 acima) para as MSCs cultivadas (semeadas no dia anterior em placas de 24 cavidades) em 1 ml de leucócitos meio completo a uma 01:10 (índice de célula) rácio co-cultura de MSCs para PBMC.
4. Adicionar o mitogénio fito-hemaglutinina (PHA), um activador de leucócitos não específica, a uma concentração final de 10 ug / ml em um volume total de 1 ml de leucócitos meio completo por poço.
   1. AlternativEly, para estimular a activação de linfócitos T especificamente: a-usar CD3 / 28 micropérolas e adicionar à co-cultura de duas células para obter uma razão de 1 talão de linfócitos-T-a: 1.
5. Para controlo negativo, placa 500.000 PBMCs / poço (ou uma população efectora específica de leucócitos; densidade celular: 250.000 leucócitos / ^cm2) numa placa de 24 cavidades com 1 ml de meio completo de leucócitos única; para o controlo positivo, para além do plaqueamento o mesmo número de PBMC / cavidade, adicionar PHA a uma concentração final de 10 ug / ml.
6. No terceiro e quinto dia da experiência de co-cultura, avaliar a proliferação de leucócitos marcados com CFSE (colocados em tubos de fundo redondo) por análise de citometria de fluxo ¹⁷ com 488 nm de excitação e emissão adequados para filtros de fluoresceína.
   Nota: Coloração de citocinas intracelulares para a análise de citometria de fluxo pode também ser realizada para estes leucócitos marcados com CFSE, neste ponto, para avaliar alterações no perfil de expressão de citoquinas de leucócitos como MOdulated por MSCs. Desde CFSE é avaliada com um filtro adequado para a fluoresceína, os anticorpos seleccionados para avaliar várias citocinas precisa ser conjugado com fluoresceína ou com excepção espectro semelhante fluorocromos (isto é, ficoeritrina, proteína peridinina clorofila complexo (PerCP)).

6. Variação: Effector Suppression Ensaio Magnetic Bead-selecionado, MSC-induzida imunomoduladora leucócitos ativados em CFSE rotulados células efetoras ^T CD4 +

1. MSCs semente a 250.000 células em 3 ml de MSC meio completo em placas de 6 poços (densidade MSC: 25.000 células ^/ cm2) para a ligação O / N em uma temperatura de 37 ° C incubadora, permitindo para as células estaminais para alcançar 80% de confluência. Pelo menos 3 placas de 6 poços são necessárias para garantir PBMC MSC-cocultivadas suficientes para a seleção sub-população.
2. Aspirar o meio e adicionar PBMC separados de acordo com Passo 1, mas em placas de 6 poços, a 2,5 x 10 ⁶ células / poço (densidade celular: 250.000 leukocytes / cm ²⁾ com 3 ml de meio completo de leucócitos. A co-cultura durante 48-72 horas numa incubadora a 37 ° C.
3. Magnetic talão-selecionar população específica de leucócitos induzidos imunomoduladores-MSC (ou seja, CD14 ⁺ células) como por secções 2-3.
   Notas: a coloração de citocinas intracelulares para a análise de citometria de fluxo pode ser realizada neste ponto para avaliar mudanças no perfil de expressão de citoquinas de leucócitos, isto é, a expressão de interleucina-10 como modulada por MSC.
4. Adicionar CFSE marcado com células ^T CD4 + alogeneicas gerados como por secções 2-4 em placas de 24 poços em 1 ml de leucócitos completo (densidade de células T: 250.000 células / cm ²⁾ forma a leucócitos induzida por MSC seleccionado por esferas em várias proporções , ou seja, 1:10, 1: 5, 1: 2 e 1: 1 (célula para célula) as proporções.
5. Para estimular as células ^T CD4 +, adicionar cc-CD3 / 28 micropérolas conjugados para obter uma razão talão-a-célula de 1: 1.
6. Para um controlo negativo, a chapa 500.000 células ^T CD4 + / poço num (a densidade de células T: 250000 células / cm ²⁾ de 24 poços da placa com 1 ml de meio completo de leucócitos única; para o controlo positivo, para além do plaqueamento o mesmo número de células ^T CD4 + / cavidade, adicionar a-CD3 / 28 micropérolas conjugados para obter uma razão talão-a-célula de 1: 1.
7. No dia ³ de co-cultura de, avaliar a proliferação de células ^T CD4 + CFSE-marcados (colocados em tubos de fundo redondo) por análise citométrica de fluxo ¹⁶ com 488 nm de excitação e emissão adequados para filtros de fluoresceína.

Resultados

A Figura 1 indica o esquema geral do experimento, e A Figura 2 demonstra a aparência das várias condições de cultura de células tal como visualizado por microscopia de contraste de fase invertida. MSC são células aderentes com um fibroblástica, morfologia fusiforme, enquanto que PBMCs e leucócitos são pequenas células não-aderentes redondos. Estes dois tipos de células morfologicamente diferentes pode ser claramente visto na co-cultura. No fim do ensaio, quando os PBMC (ou leuckotyes) são aspi...

Discussão

Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells^18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.

One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)	Life Technologies	V12883	Cellular label for detection of cell division
Phytoagglutinin (PHA)	Sigma	L8902	Activation of human PBMCs
Dynabeads Human T-Activator CD3/28	Life Technologies	111.32D	Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.
autoMACS™ Separator	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separator	Magnetic based cell separator
autoMACS® Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101	separation columns
CD14 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101	For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875	Human PBMC/leukocyte culture medium
DMEM, Low glucose, pyruvate	Life Technologies	11885	Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Supplementation for MSC complete medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
Fetal bovine serum (FBS)	1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
24-well cell culture plate	Corning	COR3524	Co-culture plate
50 ml centrifuge tube	Corning	430291	Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
15 ml centrifuge tube	Corning	430766	Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
Round-bottom tubes	BD Falcon	352008	Collection of cells for flow cytometric analysis