Beurteilung der immunmodulatorischen Eigenschaften von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs)

Zusammenfassung

Die immunmodulatorischen Eigenschaften von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) erscheint für die klinische Anwendung zunehmend relevant. Verwendung eines Co-Kultursystem der MSCs und peripheren Blutleukozyten mit dem Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) vorgefärbten beschreiben wir den in vitro Beurteilung der MSC Immunomodulation auf Effektorzellen Leukozyten Proliferation und bestimmten Subpopulationen.

Zusammenfassung

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

Einleitung

Humane mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind somatische Vorläufern, die in die achsparallel mesodermalen Abstammungslinien von Knochen, Knorpel und Fettgewebe ^1-4, um ein paar extramesodermal Linien ⁵ unterscheiden kann, wie auch. Zuerst von der erwachsenen Knochenmark isoliert wurden diese multilineage Vorläufern jetzt in zahlreichen Geweben ^6-8 gefunden und unerwarteterweise gezeigt, dass starke immunmodulatorische Eigenschaften, die sehr gut für die klinische Anwendung ^9-12 erscheinen müssen. Detaillierte Mechanismen in den immunmodulatorische Effekte einbezogen werden aktiv für eine wirksame Anwendung auf spezifische Krankheitsentitäten untersucht. Eine der direkten Weg zur Immunmodulation zu bewerten, ist durch die Ermittlung für die Unterdrückung der Proliferation von Leukozyten-Effektor ^13. Effektor meisten Leukozyten wie T-Lymphozyten und Monozyten zu vermehren prodigiously wenn sie stimuliert oder aktiviert. Immunmodulatorische Funktion kann geprüft werden, wenn UnterdrückungProliferation wird belegt.

Traditionell wurde Effektor Leukozyten Proliferation durch Detektion von ^[3 H] Thymidin-Einbau in die DNA untersucht. , Dieses Verfahren hat jedoch erhebliche Nachteile auf Grund der Bedenken von Strahlung und post-Nutzung zur Verfügung, ebenso wie die komplexe Ausrüstung erforderlich. Zwar gibt es nicht-radioaktiven Assays, die Zellproliferation zu beurteilen, hat das Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) -Assay andere Vorteile, wie beispielsweise, die eine Identifizierung von spezifischen Zellpopulationen, die besonders nützlich bei der Co-Kultur-Experimente mit mehreren Zelltypen. CFSE ein fluoreszierender Farbstoff, der zellulären durch durchflusszytometrische Analyse bestimmt werden kann. Wie Zellen sich teilen, wird die Intensität dieses zellulären Etikett proportional verringert; Dies ermöglicht nicht nur die Bestimmung der Gesamt-Zellproliferation, sondern ermöglicht auch die Beurteilung von der Anzahl der Zellteilungen bis 8 Einheiten, bevor die Fluoreszenz wird schwierig, detect gegen Hintergrundsignal. Darüber hinaus ist die Stabilität des fluoreszierenden CFSE ermöglicht in vivo Verfolgung von markierten Zellen, so daß Zellen können bis zu vielen Monaten ¹⁴ visualisiert werden.

Dieser Assay kann auch variiert werden, um spezifische Typen von Effektorzellen Leukozyten oder immunmodulatorischen Funktion spezifischer Populationen auszuwerten MSC-induzierte immunmodulatorische Leukozyten-wie Interleukin-10 (IL-10) produzieren CD14 ⁺ Monocyten ¹⁵ durch Ausführen einer Magnetperle Oberflächenmarker Auswahl Zellpopulationen von Interesse vor oder nach der Ko-Kultur, wie angemessen. Unser Protokoll beschreibt die grundlegende Assay zur Beurteilung der immunmodulatorischen Wirkung von MSCs auf Effektorzellen Leukozyten (Flussdiagramm in Figur 1 gezeigt) und einer Variation dieser Basistest zur Bewertung der MSC-induzierte Leukozyten-Immunmodulation zur allogenen CD4 ⁺ Effektor-T-Lymphozyten (Flußdiagramm gezeigten in Abbildung 4).

Protokoll

Patientenzustimmung, wie durch die Ethikkommission genehmigt muss für die Verwendung von menschlichen Zellen gewonnen werden.

1. Dichtegradienten Isolierung von humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs)

1. 25 ml heparinisiertes Vollblut in eine 50-ml-Röhrchen mit einer 25 ml Pipette.
   1. Zellen verdünnt mit 25 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
2. 15 ml Ficoll-Paque-Dichtegradienten in ein neues 50 ml Röhre und beim Kippen der Röhre, sehr langsam und vorsichtig in 25 ml der verdünnten Zellsuspension über den Dichtegradienten hinzuzufügen, so dass es zu keiner Vermischung des Vollbluts mit der Dichtegradient, dh., keine Störung der Gradientengrenzfläche Blutdichte.
3. Zentrifuge der Suspension aus Schritt 1.2 bei 400 · g für 40 Minuten, um 30 in einem temperaturgesteuerten Schwenkbecherrotor ohne Bremse bei 20 ° C.
   Hinweis: Drei verschiedene Schichten sollte offensichtlich sein, nach der Zentrifugation: the oberen Schicht Plasma; der Boden klare Schicht die Ficoll-Paque-Dichtegradienten; und eine dünne, mittlere Zellschicht die PBMCs
4. Absaugen und entsorgen Sie die obere Schicht durch Absaugen mit einer Pasteurpipette, mit darauf, dass die Zwischenphasenschicht von mononuklearen Zellen (dh Lymphozyten, Monozyten und Thrombozyten) stören.
5. Sorgfältig sammeln diese mononukleare Zellschicht mit einer 10 ml Pipette in ein neues 50 ml Zentrifugenröhrchen.
6. Füllen Sie die Röhrchen mit 20 ml PBS, gut mischen und zentrifugieren bei 300 × g für 10 min bei 20 ° C. Entfernen Sie den Überstand vollständig nach dem Zentrifugieren.
7. Zellpellet in 20 ml PBS und Zentrifugation bei 200 × g für 10-15 Minuten bei 20 ° C. Entfernen Sie den Überstand vollständig nach dem Zentrifugieren.
   Anmerkung: Dieser Schritt entfernt die Blutplättchen-die unerwünschte-innerhalb der PBMCs sind; Dieser Schritt kann wiederholt werden, um eine vollständige Entfernung der Plättchen gewährleisten.
8. Wenn keine Auswahl bestimmter Bevölkerungsgruppen istgewünschten resuspendieren Zellpellet in Leukozyten-Vollmedium (10% fötales Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin und 1% Penicillin / Streptomycin in RPMI-1640-Medium) zur Kultivierung nach Durchführung einer Zellzahl ^{von 16 bis 1} ml zu suspendieren Medium pro 10 ⁷ PBMCs, bevor zu dem nächsten Schritt.

2. Magnetische Markierung von Leukozyten-Populationen (gehen Sie zu Schritt 4, wenn keine Auswahl von bestimmten Bevölkerungsgruppen ist erforderlich)

1. Zentrifuge PBMC-Suspension bei 300 · g für 10 min und Aspirat Stand vollständig.
2. Resuspendieren Zellpellet in 80 ul PBS pro 10 ⁷ Zellen insgesamt.
3. In 20 ul angegebenen magnetischen Kügelchen (dh CD14 magnetischen Beads zur Isolierung von Monozyten, CD4 magnetischen Beads zur Isolierung von T-Lymphozyten) pro 10 ⁷ Zellen insgesamt.
4. Gut mischen und inkubieren für 15 Minuten bei 2 bis 8 ° C im Kühlschrank.
5. Fügen Sie 1-2 ml PBS pro ¹⁰ 7 Zellen zu waschen und zentrifugierenbei 300 × g für 10 min.
6. Überstand wird abgesaugt und vollständig zu resuspendieren bis zu 10 ^{& sup8; Zellen} in 500 ul PBS.

3. Magnetische Auswahl von Leukozyten-Subpopulationen

Anmerkung: Eine Vielzahl von magnetischen Kügelchen Separatoren und Säulen zur Isolierung von spezifische Population von Leukozyten durch Zelloberflächenmarker von einer Anzahl von Herstellern erhältlich. Die Trennung kann durch positive Selektion, basierend auf eine oder wenige positive Marker oder durch negative Selektion nach Abreicherung von unerwünschten Populationen. Ein allgemeiner Ansatz zur Durchführung positiver Selektion mit einem Marker (dh CD4 für T-Helfer-Lymphozyten, Monozyten oder CD14 für) wird im Folgenden beschrieben.

1. Vorbereitung und prime Magnetabscheider einschließlich Trennsäule nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Bewerben Röhre die Probe von markierten PBMCs enthalten. Bieten zwei 15 ml-Zentrifugenröhrchen für die Sammlung des positiv markiert und unlabeled Zellfraktionen, den Anweisungen des Herstellers.
3. Zählzelle Nummer ^{15 und} Resuspendieren der positiv selektierten Leukozyten (dh CD4 ⁺ T-Lymphozyten oder CD14 ⁺ Zellen) in Leukozyten-Vollmedium mit 1 ml Medium pro ¹⁰ 7 Zellen.

4. CFSE-Färbung von Leukozyten für die Beurteilung der Proliferation

Anmerkung: CFSE wurde weithin bei immunologischen Untersuchungen verwendet wird, sowohl in vivo und in vitro Studien. Unser Protokoll wurde für in vitro-Studie von MSC / PBMC (oder andere von Leukozyten) Wechselwirkungen optimiert. Während die allgemeinen Schritte bei der Durchführung CFSE in vitro-Markierung beteiligt sind ähnlich kann es Unterschiede in der spezifischen Dosis und Zeitpunkt des Protokolls ¹⁴ sein. Dies kann aufgrund einer Reihe von Faktoren, zum Beispiel ein bestimmter Zelltyp, Zellzahlen werden verwendet, die wahrscheinlich Einfluss auf die Intensität des CFSE Fluoreszenzsignal.

1. Verdünne die CFSE-Stammlösung (10 mM) in PBS auf die gewünschte Einsatzkonzentration von 10 uM (CFSE-Arbeitslösung). Herstellung von 10 ⁷ Zellen (dh PBMCs oder T-Zellen), zur Beschriftung mit CFSE-Arbeitslösung.
2. Zentrifuge bei 300 × g für 10 Minuten, um ein Zellpellet zu erhalten, und den Überstand aspirieren.
3. Resuspendieren der Zellen vorsichtig in 1 ml vorgewärmtes (37 ° C) CFSE-Arbeitslösung und Inkubieren der Zellen für 10 min bei 37 ° C.
4. Abzuwaschen überschüssiges CFSE, verdünnte die Zellsuspension mit 10-fach (nach Volumen) von vorgekühlten (4 ° C) RPMI-Medium mit 10% FBS. Sedimentieren die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min und den Überstand verwerfen. Zweimal Waschen des Zellpellets in dieser Weise.
5. Re-Pelletierung der Zellen durch Zentrifugation und zählen Zellzahl ^15. Resuspendieren ¹⁰ 7 Zellen (entweder PBMCs oder T-Zellen) in 1 ml frischem vorgewärmtem Leukozyten Komplettmedium.

5. Co-Kultur von MSCs mit Leukozyten und Aktivierung von Leukozyten

1. Vorwärmen MSC Vollmedium (10% FBS (zur optimalen MSC Wachstum vorgetestet), 1% L-Glutamin und 1% Penicillin / Streptomycin in DMEM-low Glucose-Medium) bis 37 ° C für nicht mehr als 30 min.
2. Samen MSCs bei 50.000 Zellen in 1 ml MSC Komplettmedium in Platten mit 24 Vertiefungen (MSC Dichte: 25000 Zellen ^/ cm 2) für die Befestigung O / N in einem Inkubator bei 37ºC, so dass für den Stammzellen zu 80% Konfluenz erreichen.
3. Absaugen Medium und basierend auf seeded MSC Nummern, fügen CFSE-markierte PBMC (vorher markierten-bitte-Protokoll Schritt 4 oben beachten) zu kultivierten MSCs (ausgesät am Vortag in 24-Well-Platten) in 1 ml von Leukozyten-Komplettmedium bei einer 01.10 (Zellverhältnis) Co-Kultur-Verhältnis von MSCs zu PBMCs.
4. Füge das Mitogen Phytohämagglutinin (PHA), eine nicht-spezifische Leukozyten-Aktivator, auf eine Endkonzentration von 10 ug / ml in einem Gesamtvolumen von 1 ml Leukozyten Vollmedium pro Vertiefung.
   1. AlternativEly, für die Aktivierung von T-Lymphozyten zu stimulieren spezifisch: Verwenden α-CD3 / 28 Mikroperlen und zu der Zwei-Zellen-Co-Kultur einen Wulst zu T-Lymphozyten-Verhältnis von 1: 1 zu erhalten.
5. Für Negativkontrolle Platte 500.000 PBMCs / Vertiefung (oder einer spezifischen Effektor Leukozytenpopulation; Zelldichte: 250.000 Leukozyten ^/ cm 2) in einer 24-Well-Platte mit nur 1 ml Leukozyten-Komplettmedium; Positivkontrolle, zusätzlich zu der gleichen Anzahl von PBMC / Vertiefung Plattieren, fügen PHA zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml.
6. Am 3. und 5. Tag der Kokultur Experiment beurteilt Proliferation von CFSE-markierte Leukozyten (in Rundbodenröhrchen gegeben) durch durchflusszytometrische Analyse ¹⁷ mit 488 nm Anregungs- und Emissionsfiltern für Fluorescein geeignet.
   Anmerkung: Die intrazelluläre Cytokin-Färbung für die durchflusszytometrische Analyse kann auch auf diese CFSE-markierten Leukozyten an dieser Stelle durchgeführt wird, um Änderungen bei der Leukozyten-Cytokin-Expressionsprofil wie mo beurteilenvon MSCs dulated. Da CFSE ist mit einem Filter für die entsprechenden Fluorescein bewertet, die Antikörper ausgewählt werden, um zu beurteilen verschiedene Cytokine müssen andere als Fluorescein oder ähnliches Spektrum Fluorochrome konjugiert werden (dh, Phycoerythrin, Peridinin Chlorophyll-Protein-Komplex (PerCP)).

6. Variation: Effektor Unterdrückung Assay Magnetic Bead wählten, MSC-induzierte immunmodulatorische Leukozyten auf aktivierten CFSE-markierten Effektor ^CD4 + T-Zellen

1. Samen MSCs an 250.000 Zellen in 3 ml MSC komplettem Medium in 6-well Platten (MSC Dichte: 25000 Zellen ^/ cm 2) für die Befestigung O / N in einem Inkubator bei 37ºC, so dass für den Stammzellen zu 80% Konfluenz erreichen. Mindestens 3 Platten mit 6 Vertiefungen sind erforderlich, um genügend MSC-co-kultivierten PBMCs Subpopulation Auswahl gewährleisten.
2. Aspirat Medium, und fügen PBMCs gemäß Schritt 1, aber in 6-Well-Platten mit 2,5 ^× 10 6 Zellen / Vertiefung (Zelldichte getrennt: 250,000 leukocytes ^/ cm 2) mit 3 ml Komplettmedium Leukozyten. Co-Kultur für 48-72 Stunden in einem 37 ° C Inkubator.
3. Magnetic-Bead-wählen Sie spezifische Population von MSC-induzierte immunmodulatorische Leukozyten (dh ^CD14 + Zellen) gemäß §§ 2-3.
   Anmerkungen: Die intrazelluläre Cytokin-Färbung für die durchflusszytometrische Analyse kann an diesem Punkt durchgeführt, um Änderungen der Leukozyten-Cytokin-Expressionsprofil, das heißt, die Expression von beurteilen Interleukin-10, wie durch MSCs moduliert.
4. In ADD CFSE-markierten allogenen CD4 ^{+ -T-Zellen} in Platten mit 24 Vertiefungen nach Abschnitten 2-4 generiert 1 ml von Leukozyten-Komplettmedium (T Zelldichte: 250.000 Zellen ^/ cm 2) zu Wulst wählten MSC-induzierten Leukozyten in verschiedenen Verhältnissen dh, 1:10, 1: 5, 1: 2 und 1: 1 (der Zellen) führt Verhältnissen.
5. CD4 ⁺ T-Zellen zu stimulieren, fügen α-CD3 / 28 konjugierten Mikrokügelchen zu einem Wulst-zu-Zell-Verhältnis von 1: 1 zu erhalten.
6. Für eine negative Kontrolle, Platte 500.000 CD4 ⁺ T-Zellen / Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen (T Zelldichte: 250.000 Zellen ^/ cm 2) mit nur 1 ml Leukozyten Komplettmedium; Positivkontrolle, zusätzlich zu der gleichen Anzahl von CD4 ⁺ T-Zellen / Vertiefung Plattieren, fügen α-CD3 / 28 konjugierten Mikrokügelchen zu einem Wulst-zu-Zell-Verhältnis von 1: 1 zu erhalten.
7. ^Am 3. Tag der Co-Kultur, zu bewerten Proliferation von CFSE-markierten CD4 ⁺ T-Zellen (in Rundbodenröhrchen gegeben) durch durchflusszytometrische Analyse ¹⁶ mit 488 nm Anregungs- und Emissionsfiltern für Fluorescein geeignet.

Ergebnisse

Figur 1 zeigt die Gesamtschema des Experiments, und Figur 2 zeigt das Aussehen der verschiedenen Zellkulturbedingungen, wie durch Phasenkontrastmikroskopie sichtbar invertiert. MSCs sind adhärente Zellen mit Fibroblasten, spindelförmige Morphologie, wobei PBMCs und Leukozyten sind kleine, runde, nichthaftende Zellen. Diese zwei morphologisch unterschiedliche Zelltypen ist deutlich in der Co-Kultur gesehen werden. Am Ende des Tests, wenn die PBMCs (oder leuckotyes) für durchflusszytometrische abgesaugt an...

Diskussion

Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells^18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application.

One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00 AG	Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)	Life Technologies	V12883	Cellular label for detection of cell division
Phytoagglutinin (PHA)	Sigma	L8902	Activation of human PBMCs
Dynabeads Human T-Activator CD3/28	Life Technologies	111.32D	Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells, etc.
autoMACS™ Separator	Miltenyi Biotec	autoMACS™ Separator	Magnetic based cell separator
autoMACS® Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101	separation columns
CD14 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs
CD4 microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-045-101	For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875	Human PBMC/leukocyte culture medium
DMEM, Low glucose, pyruvate	Life Technologies	11885	Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium
L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Supplementation for MSC complete medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium
Fetal bovine serum (FBS)	1) Hyclone, for MSC culture                   2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	Pre-test lots for support of MSC in vitro culture
24-well cell culture plate	Corning	COR3524	Co-culture plate
50 ml centrifuge tube	Corning	430291	Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS
15 ml centrifuge tube	Corning	430766	Collection of the labeled and unlabeled cell fractions
Round-bottom tubes	BD Falcon	352008	Collection of cells for flow cytometric analysis