JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

Özet

Yarrowia lipolytica bir, patojen olmayan dimorfik ve kesinlikle aerobik maya türüdür. kendine özgü fizyolojik özellikleri ve metabolik özellikleri nedeniyle, bu sıradışı maya sadece mantar farklılaşma temel doğası çalışma için iyi bir model değil, aynı zamanda biyokimyasal üretim ve kapsamlı genetik manipülasyonlar gerektiren çeşitli biyoteknolojik uygulamalar için umut verici bir mikrobik bir platformdur. Y'nin Ancak genetik manipülasyonlar lipolytica nedeniyle başta KU70 geni isnat edilebilir verimli ve istikrarlı bir genetik transformasyon sisteminin eksikliği yanı sıra homolog olmayan rekombinasyon çok yüksek oranlarda sınırlı olmuştur. Burada, verimli genetik transformasyonu için ve Y gen silinmesi için kolay ve hızlı bir protokol rapor lipolytica Po1g. Y dışsal DNA etkin transformasyonu için İlk olarak, bir protokol lipolytica Po1g kurulmuştur. Second, hedef genlerin daha silinmesi için geliştirilmiş çift çaprazlama homolog rekombinasyon oranı elde etmek için, KU70 gen 1 kb homoloji silah taşıyan bir bozulma kaset dönüştürerek tarafından silindi. Üçüncü olarak, KU70 geninin silindikten sonra gelişmiş gen silme verimliliğini göstermek için, biz tek tek KU70 nakavt platformu zorlanma aynı prosedürler kullanılarak alkol dehidrogenaz ve alkol oksidaz kodlayan 11 hedef genleri silindi. Kesin homolog rekombinasyon oranı silinmesi için en az% 0.5 önemli bir artış gözlenmiştir Po1g KU70 ö 11 hedef genlerin tek gen silinmesi için% 33 -71% ile Po1g içinde KU70 geninin. higromisin B direnç işareti, CRE / LoxP taşıma sistemi bir replikatif plazmit ve maya nakavt suşlarında seçim marker geni, sonunda targe birden fazla tur kolaylaştırmak için Cre rekombinazın ifadesinin uzaklaştırıldıted genetik manipülasyonlar. Ortaya çıkan tek gen silme mutantlar biyoyakıt ve biyokimyasal üretimde potansiyel uygulamalar var.

Giriş

Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, geleneksel olmayan bir maya farklı çevresel koşullar 1,2 değişikliklere yanıt olarak maya ya da misel şeklinde büyüyebilir. Böylece, bu iki şekilli maya mantar farklılaşma, morfolojilerinden ve taksonomi 3,4,5 çalışma için iyi bir model olarak kullanılabilir. Genellikle yaygın olarak organik asitler, polialkoller, aroma maddeleri, emülsiyon yapıcılar ve yüzey aktif maddeler 6,7,8,9 gibi gıda katkı maddelerinin çeşitli üretmek için kullanılan bir kasa (GRAS) maya türleri, olarak kabul edilir. Bu kadar hücre kuru ağırlığının 10% 70, zorunlu bir aerobe ve doğal olarak yüksek miktarlarda lipitleri biriken yeteneğine tanınmış yağlı maya, yani. Ayrıca besinlerin 11,12,13 atık kaynaklarının kalıntıların farklı türde de dahil olmak üzere, büyüme için karbon kaynakları geniş bir yelpazede yararlanabilirler. Bu eşsiz özelliklerin tümü Y. yapmak için çok cazip lipolyticaçeşitli biyoteknolojik uygulamalar.

Y'nin tüm genom sekansı, ancak lipolytica 14,15 yayınlandı, bu sıradışı maya genetik manipülasyon diğer maya türleri daha karmaşıktır. İlk olarak, bu maya türlerinin dönüşümü nedeniyle istikrarlı ve verimli bir genetik transformasyon sisteminin 16,17 olmaması çok daha az etkilidir. Doğal epizomal plazmid sistemi bu maya 18 bulunmuştur İkinci olarak, lineer ekspresyon kasetlerinin zahmetli genomik entegrasyon yaygın ilgili genlerin ekspresyonu için kullanılır. Bu maya doğru homolog rekombinasyon yoluyla verimliliği hedefleyen gen düşüktür ve çoğu entegrasyon olayları homolog olmayan sonunda katılmadan (NHEJ) 19 içinden gelmesi nedeniyle genetik knock-out ve knock-ins Üçüncü nesil sınırlıdır.

Bu çalışmada, Y için optimize edilmiş bir transformasyon protokolü rapor lipolytica kolay, hızlı, verimli ve tekrarlanabilir Po1g suşu. Hassas homolog rekombinasyon frekansını artırmak için, NHEJ yolunun önemli bir enzimi kodlayan KU70 geni silinmiş. Optimize edilmiş dönüşüm protokolü kullanılarak ve 1 kb Y. KU70 geni homoloji bölgeleri kuşatan içeren doğrusal bir nakavt kaset dönüştürerek lipolytica Po1g başarıyla silindi. Bu gen silinmesi metodoloji sağlamlığı daha sonra Po1g KU70 Δ suşu alkol dehidrogenaz ve alkol oksidazı genlerini hedef alan ile gösterilmiştir. Bu KU70 delesyon suşu doğal tipte Po1g soyunun daha hedefleme homolog rekombinasyon aracılığıyla gen bir ölçüde daha yüksek bir verimlilik sergilemiş olduğu gözlemlenmiştir. Buna ek olarak, higromisin B direnç taşıyan bir yineleme Cre ifade plazmid işaretleyici kurtarma gerçekleştirmek için inşa edilmiştir. işaretleyici kurtarma th hedef genin birden fazla mermi kolaylaştırırE gen silinmesi Elde edilen mutantlar. Gen silme yanı sıra, burada tarif edilen genetik transformasyonu ve gen silinmesi için protokol özel bir lokus genlerin eklemek için, ve Y alana özgü mutasyonların katılması için uygulanabilir lipolytica genomu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Y 1. Üretim lipolytica KU70 Silme Gerilme

  1. bozulma kasetinin İnşaatı
    Not: polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonda kullanılan tüm primerler için Tablo 1'e bakınız.
    1. LEU2 ekspresyon kaseti PCR kuvvetlendirmek için tasarım primerleri 20 Y'den (Tablo 1 e bakınız) sırasıyla ve uzun ters primer (Tablo 1 # 2); lipolytica ifade vektörü 5 've 3' olarak LoxP yerleri sokacak uzun ileri primer (Tablo 1 # 1), LEU2 kasetinin sona erer. Klonlama işlemi sonraki adım için ilave bir sınırlama mevkisinin katılması için, primer # 1 'de, bir BamHI sınırlandırma bölgesi ekleyin.
    2. Tablo 2'de ayrıntılı olarak yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı kullanılarak PCR gerçekleştirin.
    3. PCR purificatio kullanılarak loxp-promoteri-LEU2-terminatör-loxP kaseti PCR ürünü saflaştırmaküreticinin talimatlarına uygun olarak N kiti. Üreticinin talimatlarına uygun olarak 21 saflaştınlmış PCR ürününe 3'-A çıkıntıları ekleyin. Kullanım T4 DNA ligazı, Tablo 3'de belirtilen plazmid T-LEU2 vermek üzere, bir TA klonlama vektörüne A kuyruklu PCR ürünü bağlanması için.
    4. PCR Y. astarları 3. / 4. kullanarak KU70 geninin 1 kb 5 'yukarı serisini yükseltmek lipolytica Po1g Tablo 2'deki gibi genomik DNA, 22., üreticinin talimatlarına uygun olarak bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak.
      1. Çift. Tablo 4 uyarınca Sac II ile BamHI enzimleri ile saflaştınlmış PCR ürünü ve T-LEU2 plazmid hem özet üretici talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak Sindirim karışımı saflaştırılır. Saflaştırılmış bağlanması için T4 DNA ligaz kullanma ve Sac II ile sindirilmiş PCR ürünü / T LEU2 Bam HI bölgelerine vermek üzereTablo 3'de belirtilen plazmid T-LEU2-5E.
    5. PCR Y. astarları # 5 / # 6 kullanarak KU70 geninin 1 kb 3 'aşağı serisini yükseltmek lipolytica Po1g Tablo 2'deki gibi genomik DNA, 22., üreticinin talimatlarına uygun olarak bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak. Çift saflaştırılmış PCR ürünü ve Tablo 4'te göre değil ben ve Nde enzimlerle T-LEU2-5E plazmid hem sindirmek.
      1. üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak Sindirim karışımı saflaştırılır. Daha sonra, saflaştırılmış bağlanır ve Not I / nde Tablo 3'de belirtilen, T4 DNA ligazı kullanılarak plazmid T-KO vermek üzere t-LEU2-5E I sitelerine PCR ürünü ile sindirilmiş.
    6. Bozulma kasetini üretmek için Tablo 4'de gereğince Sac II ve nde I enzimleri ile plazmid T-KO sindirimi (Şekil 1 ). üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak sindirilmiş DNA fragmanlarının saflaştınlır.
  2. Yetkili Hücre hazırlama ve Y dönüşümü lipolytica Po1g suşu
    1. Yetkili Hücre hazırlama
      1. Y. bir koloni aşılamak YPD ortamı 10 ml (% 1 maya özütü,% 2 pepton,% 2 glukoz ve 50 mM sitrat tamponu, pH 4.0) 100 ml'lik bir şişe içinde bir taze maya ekstresi-pepton-dekstroz (YPD) plakadan lipolytica Po1g soyu. Doyum noktasına kadar 20 saat (bir spektrofotometre kullanılarak ölçülen OD yaklaşık 15 600,) 225 rpm'de 30 ° C çalkalama inkübatöründe inkübe edin.
      2. Oda sıcaklığında 5000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjlenerek pelet hücreleri. 20 ml Tris-EDTA (TE) tampon çözeltisi (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5) ile hücrelerin yıkayın ve aşama 1.2.1.2 tarif edildiği gibi hücreler pelet. (Asetik asit ile pH değeri 6.0), 0.1 M lityum asetat, 1 ml hücrelerin tekrar ve oda Tempe 10 dakika süre ile inküberature.
      3. Steril 1.5 ml tüpler kompetan hücreler (100 ul) kısım. hemen altındaki dönüştürme adımları geçin ya da uzun süreli depolama için -80 ° C'da bir son% 25 konsantrasyonunda (h / h) ve saklamak için gliserol ekleyin.
    2. dönüşüm
      1. Yavaşça yetkin hücre 100 ul ile denatüre somon sperm DNA (10 mg / ml) ve saflaştırılmış bozulması kasetinin 1-5 ug, 10 ul karıştırın ve 15 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
      2. (0.1 M lityum asetat pH 6.0 içinde çözülmüş)% 40 polietilen glikol (PEG) -4000 700 ul eklenir, iyice karıştırılır ve 60 dakika boyunca 225 rpm'de 30 ° C çalkalama inkübatöründe inkübe edin.
        Not: yerine (tipik olarak geleneksel maya transformasyonu kullanılmaktadır) PEG-3350, 4000 ortalama molekül ağırlığına sahip PEG kullanılması önemlidir.
      3. Isı 60 dakika için 39 ° C su banyosu içinde tüp yerleştirmek sureti ile transformasyon karışımı şok.
      4. 1 ml YPD ortamı ilave edin ve30 ° C'de 2 saat ve 225 rpm'de için geri. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 9.000 x g santrifüj, süpernatant kaldırmak ve TE tamponu 1 ml pelletini.
      5. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 9.000 x g'de santrifüj ile hücreler repellet ve supernatant atın. TE tamponu, 100 | il pelletini ve seçici plakaları (örneğin, lösin-eksikli plakalar) üzerine plaka ve 2-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
      6. 10 tek koloniler 4 Pick up ve YPD orta 2 ml ayrı aşılamak. 225 rpm'de 30 ° C'de ve çalkalama gece boyunca inkübatör içinde inkübe edin. Sırasıyla primer # 55 / # 56, iki set ve # 56 / # 57 kullanılarak Tablo 5'teki gibi transformantların 22 genomik DNA, PCR analizi ile pozitif kolonileri tanımlamak.
        Not: Ben pYLEX1 vektörü Y dönüştürülür doğrusallaştırılmış sayısını sayarak transformasyon etkinliğini belirlemek amacıyla lipolytica Po1g kompetan hücrelerug plazmid başına koloni oluşturan birim (CFU) DNA 23 kullanılır.

2. Marker Kurtarma

  1. Cre sentezleme plasmidinin yapımı
    1. pYLEX1-CRE ve pYLEX1-Eden Hastaneler İnşaat
      1. Tasarım primerleri 20 Cre ve Eden Hastaneler açık okuma çerçevelerini PCR kuvvetlendirmek için. Ileri primer # 82 ve # 84 başlangıç ​​kodonunun üst akışında bir ekstra bir adenin nükleotid ekleyin ve PCR CRE açık okuma çerçevelerini amplifiye ters primerler # 83 ve # 85, durdurma kodonunun aşağı Kpn I kısıtlama bölgelerinin sokulması ve Tablo 2'deki gibi pSH69 (erişim numarası HQ412578) 24 dan hph.
      2. Cre ve üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak HPH parçaları hem saflaştınlır. Digest hem ben Tabl başına enzim Kpn ile saflaştırılmış CRE ve hph fragmanlarıE 4.. Tablo 4 uyarınca Pml I ve Kpn I enzimleri ile pYLEX1 plazmid sindirimi Çift üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak Sindirim karışımı saflaştırılır.
      3. Y. Pml I / Kpn I sitelerine saflaştırılmış ve sindirilmiş CRE ve hph parçalarını birbirine bağlamak için Tablo 3'de göre T4 DNA ligaz kullanın sırasıyla pYLEX1-CRE ve pYLEX1-hph elde lipolytica ifade vektörü.
    2. pSL16-CRE-Eden Hastaneler İnşaat
      1. PCR primerleri, 86. kullanılarak pYLEX1-CRE gelen CRE promotör-gen-sonlandırıcı kaseti amplifiye / 87. Tablo 2'deki gibi Sal I / Pst I sınırlandırma bölgeleri çevreleyen. Üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak .
        1. Çift Sal I ile saflaştırılan PCR ürünü ve pSL16-CEN1-1 (227) plazmid 25 hem özetPst Tablo 4'te göre ben enzimleri. Üreticinin talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak sindirim karışımı arındırın. Daha sonra, Tablo 3'de belirtilen, T4 DNA ligazı kullanılarak pSL16-CRE oluşturmak için karşılık gelen bölgelerde pSL16-CEN1-1 (227) saflaştırılmış ve sindirilmiş PCR ürünü ligate.
      2. PCR primerleri kullanılarak pYLEX1-Eden Hastaneler gelen Eden Hastaneler promotör-gen-sonlandırıcı kaseti amplifiye # 88 / # 89. Tablo 2'deki gibi Xho I / Bgl II kısıtlama alanlarını yandan kuşatan, üretici talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak .
        1. Çift. Saflaştınlmış PCR ürünü ve Tablo 4 uyarınca Xho I ve Bgl II enzimleri ile pSL16-CRE plazmid hem özet üretici talimatlarına göre bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak Sindirim karışımı saflaştırılır. Daha sonra, karşılık gelen en pSL16-CRE saflaştırılmış ve sindirilmiş PCR ürünü ligateYer Tablo 3'de belirtilen, T4 DNA ligazı kullanılarak pSL16-CRE-hph üretir.
          Not: Elde edilen Cre sentezleme plasmidi, pSL16-CRE-HPH, seçilebilir bir higromisin B işaretleyici taşımaktadır ve bir sentromer ve epizomal kopyalayan vektörü (Şekil 2).
      3. Tablo 4 uyarınca uygun kısıtlama enzimleri (örneğin, Sal I / Pst I, vektöründen inserti kesip çıkarmak için) ile sindirme ile bütün bileşenleri kontrol edin.
  2. Cre rekombinaz aracılık ettiği işaretçi kurtarma
    1. Yukarıdaki Bölüm 1.2'de açıklanan dönüşüm protokolü aşağıdaki KU70 nakavt suşu yetkili hücrelerine pSL16-CRE-HPH Transform. YPD artı higromisin B üzerine Plaka dönüştürülmüş hücreler (YPDH) plakaları (400 ug / ml higromisin B ihtiva eden) ve 2-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
    2. Tablo 5'te göre koloni PCR gerçekleştirin primerler kullanılarak # 84 / # 85 pozitif tespit etmekdönüşümden sonra pSL16-CRE-HPH plazmidi içeren koloniler.
      Not: ileri primer 84. ve revers primer 85. hph geni (Tablo 1) kodlama bölgesi içinde yer alır. Sadece pozitif klonlar PCR reaksiyonunda spesifik bir PCR ürünü üretir.
    3. Pozitif klon almak ve YPDH orta 2 ml inoküle ve doygunluk gece boyunca 225 rpm'de 30 ° C çalkalama inkübatöründe inkübe edin. Spektrofotometre ile hücre OD 600 ölçün. ~ 15 bir OD 600 hücreleri Hasat. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj ve steril su, 2 ml ile bir kez yıkanır.
    4. Bir ilk OD 0.1 600 YPD ortamı 2 ml hücreleri yeniden inoküle ve hücreler, gece boyunca 225 rpm'de 30 ° C çalkalama inkübatöründe büyümeye olanak sağlar. Streak YPD plakalar üzerine bir gecede hücre kültürü tek koloniler 23 izole etmek. Replika plaka YPD, YPDH üzerine koloniler ve lösin eksik plakalar 23 Yukarı.
      Not: (Şekil 3), hem LEU2 işaretleyici kaybetmiş ve pSL16-CRE-STEH plazmid sadece YPD plakalar üzerinde büyüyebilir Koloni.

Alkol Dehidrogenaz ve Alkol Oksidaz Genleri 3. Silme

  1. Y üzerinde bir arama yapın silme 26 gen adaylarını belirlemek için Temel Yerel Hizalama Arama Aracı (BLAST) kullanarak lipolytica genom veritabanı. Giriş S. protein dizisidir ŞOK arama aracı haline cerevisiae alkol dehidrojenaz I (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
    Not: BLAST arama aracı Y en benzer protein dizileri döndürür lipolytica genom veritabanı.
  2. 56. (Tablo 1) primerleri 7. PCR ile yok etme kasetleri Construct ve kısıtlayıcı enzim dijestiyonu ve yukarıdaki bölüm 1.1'de açıklandığı gibi aynı usuller kullanılarak ligasyon reaksiyonları gerçekleştirmek.
  3. HazırlıkKU70 nakavt suşu yetkili hücreleri vardır dönüşümleri gerçekleştirmek ve yukarıdaki bölüm 1.2'de açıklanan protokol takip ederek 81. (Tablo 1) 55. astar, # 58 ile pozitif koloniler tanımlamak için PCR gerçekleştirin.
    Not: Bir örnek olarak, YALI0E17787g gen silme işlemi, Şekiller 4 ve 5'te tarif edilir. homolog rekombinasyon oranı 1 kb ve 2 kb uzunluğunda homolog bölgenin etkileri bildirilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Lineerleştirilmiş Y. lipolytica ifade vektörü Y genomunda pBR yerleştirme platformu yerleştirildi Tek bir geçit rekombinasyona 27 gerçekleştirerek lipolytica Po1g süzün. Bu çalışmada kurulan hızlı kimyasal dönüşüm prosedürü, doğrusallaştırılmış Y. kullanarak lipolytica ifade vektörü başarıyla> 100 CFU / ug DNA bir transformasyon verimi yabani tip Po1g suşuna transforme edildi. 1 kb homolog diziler...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışma için Amacımız Y. hedefli gen tırnakları hızlı ve etkin üretimini sağlamaktır Bunu başarmak için lipolytica Po1g suşu. Çeşitli düşünceler ele alınması gerekmektedir. İlk olarak, yüksek bir dönüşüm etkinliği gerekir. Y için Böylece, etkili ve uygun bir kimyasal dönüşümü protokolü lipolytica Po1g suşu Bu çalışmada tanımlanmıştır. PEG-4000 kullanımı, bu soyun başarılı bir transformasyonu için önemli bir faktördür. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

Biz minnetle Singapur (ETRP 1201102) Ulusal Çevre Ajansı finansman desteği kabul, Singapur Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK-CRP5-2009-03), Singapur Bilim, Teknoloji ve Araştırma Ajansı Rekabet Araştırmaları Programı ( 1324004108), Küresel Ar-Ge Proje Programı, Bilgi Ekonomisi Bakanlığı, Kore Cumhuriyeti (N0000677), Savunma Tehdit Azaltma Dairesi (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) ve Sentetik Biyoloji Singapur Ulusal Üniversitesi Girişimi ( DPRT / 943/09/14).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent/Material
Oligonucleotide primersIntegrated DNA Technologies25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1gYeastern Biotechleucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1Yeastern BiotechFYY203-5MGY. lipolytica expression vector
E. coli TOP10InvitrogenFor cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector PromegaA3600TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106For plasmid isolation
Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System		PromegaA9282Extract DNA fragments from agarose gels
and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity
DNA polymerase		Bio-Rad172-5302High-fidelity DNA polymerase
BamHI New England BiolabsR0136SRestriction enzyme
BglII New England BiolabsR0144LRestriction enzyme
KpnINew England BiolabsR0142SRestriction enzyme
NdeI New England BiolabsR0111SRestriction enzyme
NotINew England BiolabsR0189LRestriction enzyme
PmlINew England BiolabsR0532SRestriction enzyme
PstI New England BiolabsR0140SRestriction enzyme
SacIINew England BiolabsR0157SRestriction enzyme
SalINew England BiolabsR0138SRestriction enzyme
XhoINew England BiolabsR0146LRestriction enzyme
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202L
Taq DNA polymerase Bio-RadM0267L
AmpicillinGibco-Life Technologies11593-027Antibiotics
Hygromycin BPAAP21-014Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladderThermo ScientificSM03121 kb DNA ladder
PEG4000Sigma95904-F
TrisPromegaH5135
EDTABio-Rad161-0729
Salmon Sperm DNAInvitrogen15-632-011
Lithium AcetateSigma
Acetic acidSigma
Glass beads (425-600 µm)SigmaG8772
RNAse AThermo ScientificEN0531
DNA Loading DyeThermo ScientificR0611
Bacto Yeast ExtractBD212750
Bacto PeptoneBD211677
D-Glucose1st BaseBIO-1101
YNB without amino acidsSigmaY0626
DO Supplement-LeuClontech630414
GlycerolSigmaG5516
Difco LB BrothBD244620
Difco LB AgarBD244520
Bacto AgarBD214010
Equipment
PCR machineBioradT100 Thermal Cycler
Water bathMemmertWNB 14
Stationary/Shaking IncubatorYihderLM-570RD
Thermo-shakerAllshengMS-100
Micro centrifugeEppendorf5424R
CentrifugeEppendorf5810R
SpectrophotometerEppendorf BioPhotometer plus
Gel imagerGEAmersham Imager 600

Referanslar

  1. Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
  2. Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
  3. Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790(2013).
  4. Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
  5. Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
  6. Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
  7. Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
  8. Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
  9. Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
  10. Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
  11. Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
  12. Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
  13. Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
  14. Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
  15. Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
  16. Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
  17. Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
  18. Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
  19. Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
  20. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).
  21. Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
  22. JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
  23. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).
  24. Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
  25. Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
  26. McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
  27. Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
  28. Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 115Biyom hendislikSayS rad mayaYarrowia lipolytica KU70 Gengenetik transformasyongen silmegenetik manip lasyonhomolog rekombinasyoni aretleyici kurtarma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır