신 재생 바이오 연료 및 생물 생산에 대한 자유로운 효모의 유전 공학

요약

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

초록

Yarrowia의 lipolytica는 비 병원성 동종 이형 엄격 호기성 효모 종입니다. 독특한 생리 기능과 신진 대사 특성으로 인해,이 틀에 얽매이지 않는 효모뿐만 아니라 곰팡이 차별화의 기본 성격의 연구를위한 좋은 모델뿐만 아니라 생화학 적 생산과 광범위한 유전자 조작을 필요로 다양한 생명 공학 응용을위한 유망한 미생물 플랫폼입니다. Y.의 그러나, 유전자 조작 lipolytica 인해 주로 KU70 유전자에 기인 할 수있는, 효율적이고 안정적으로 유전자 형질 전환 시스템의 부족뿐만 아니라 비 - 상 동성 재조합의 매우 높은 속도로 제한되었다. 여기, 우리는 효율적인 유전자 변환에와 Y 유전자 삭제 쉽고 빠른 프로토콜을보고 lipolytica PO1G. Y.로 외래 DNA의 효율적인 변환을위한 우선, 프로토콜 lipolytica PO1G가 설립되었다. 세코ND, 표적 유전자의 추가적인 삭제 향상된 이중 교차 상동 재조합 율을 달성하기 위해 유전자는 KU70 1킬로바이트 동성 암 반송 파쇄 카세트 바뀌는 삭제 하였다. 셋째, KU70 유전자의 삭제 후 향상된 유전자 결실 효율을 입증하기 위해, 우리는 개별적 KU70 녹아웃 플랫폼 균주에서 동일한 절차를 사용하여 알코올 탈수소 효소, 알코올 산화 효소를 코딩하는 11 표적 유전자를 삭제. 이것은 정확한 상동 재조합 속도가 삭제 0.5 % 미만에서 실질적으로 증가하는 것이 관찰 PO1G KU70 Δ 11에서 표적 유전자의 단일 유전자 결실에 대한 33 % -71 %의 PO1G에서 KU70 유전자. 하이 그로 마이신 B 내성 마커와 Cre 호텔 /에 loxP 시스템을 운반하는 복제 성 플라스미드를 구축하고, 효모 녹아웃 균주의 선별 마커 유전자는 결국 타지 여러 발사를 용이 Cre 호텔 재조합 효소의 발현에 의해 제거테드 유전자 조작. 그 결과 단일 유전자 삭제 돌연변이 생물 연료 및 생화학 생산에 응용 가능성이 있습니다.

서문

사카로 마이 세스 세레 비지에, Yarrowia의 lipolytica, 비 전통적인 효모와는 달리, 환경 조건의 ^{1, 2의} 변화에 대응하여 효모 또는 균사의 형태로 증가 할 수 있습니다. 따라서,이 동종 이형 누룩 곰팡이 분화, 형태 형성 및 분류 ^3,4,5- 연구를위한 좋은 모델로서 사용될 수있다. 이것은 일반적으로 널리 유기산, 폴리 알콜, 아로마 화합물, 유화제 및 계면 활성제로 ^-6,7,8,9- 식품 첨가물의 종류를 생성하기 위해 사용되는 안전한 (GRAS) 효모 종으로 간주된다. 이는 최대 ¹⁰ 세포 건조 중량의 70 %를하기 위해, 의무적의 aerobe 자연스럽게 다량으로 지질을 축적 할 수있는 공지의 유성 효모, 즉이다. 또한 영양소 ^11,12,13 같은 폐 자원 잔기의 종류를 포함한 성장 탄소원의 넓은 스펙트럼을 이용할 수있다. 이러한 독특한 기능은 모두 Y.을 매우 매력적인 lipolytica다양한 생명 공학 응용 프로그램.

Y.의 전체 게놈 서열 비록 lipolytica가 ^{14, 15을} 게시되었습니다,이 틀에 얽매이지 않는 효모의 유전자 조작은 다른 효모 종보다 더 복잡합니다. 첫째, 효모 종의 변화로 인해 안정하고 효율적인 유전자 변환 시스템 ^{(16, 17)의} 부재에 훨씬 덜 효율적이다. 에피 솜 본연 플라스미드 시스템이 효모 ^(18)에서 발견되지 않은 둘째, 선형 발현 카세트의 게놈 통합 힘든 공통 관심 유전자의 발현에 사용된다. 이 효모에 정확한 상동 재조합을 통해 효율성을 대상으로 유전자가 낮은 대부분의 통합 이벤트가 비상 동 말단 연결 (NHEJ) ^(19)를 통해 발생하기 때문에 유전자 노크 아웃 및 노크 인의 셋째, 세대가 제한됩니다.

본 연구에서는 Y.에 최적화 된 변환 프로토콜 신고 lipolytica , 쉽고 빠르게, 효율적이고 재현 PO1G 변형,. 정확한 동성 재조합 빈도를 향상시키기 위해, 우리는 NHEJ 경로에서 중요한 효소를 코딩하는 유전자를 KU70 삭제. 최적화 된 변환 프로토콜을 사용하고, 1킬로바이트의 Y. KU70의 유전자를 상동 영역을 포함하는 선형 측면 녹아웃 카세트를 변환하여 lipolytica PO1G가 성공적으로 삭제되었습니다. 이 유전자 삭제 방법의 견고성은 다음 PO1G KU70 Δ 변형 알코올 탈수소 효소와 알코올 산화 효소 유전자를 대상으로 입증되었다. 그것은 KU70 결실 균주는 야생형 균주 PO1G보다도 타겟팅 동성 재조합을 매개 유전자의 상당히 높은 효율을 발휘하는 것이 확인되었다. 또한, 하이 그로 마이신 B 내성의 마커를 운반하는 복제 성 Cre 호텔 발현 플라스미드는 마커 복구를 수행하도록 구성 하였다. 마커 구조는 일에 대상 유전자의 여러 라운드를 용이하게전자는 유전자 결실 돌연변이를 획득했습니다. 유전자 삭제 게다가, 여기에 설명 된 유전자 변형 및 유전자 삭제를위한 우리의 프로토콜은 특정 유전자좌에 유전자를 삽입하고, Y.로 사이트 별 돌연변이를 소개하고 적용 할 수 있습니다 lipolytica 게놈.

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프로토콜

Y.의 1 세대 lipolytica KU70 삭제 스트레인

1. 붕괴 카세트의 건설
   주 : 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 사용 된 모든 프라이머는 표 1 참조.
   1. 는 Leu2 발현 카세트를 증폭하기위한 PCR 프라이머 디자인 ^(20)는 Y.부터 (표 1 참조) 각각과, 긴 역방향 프라이머 (표 1 # 2) lipolytica 발현 벡터 및 5 '및 3'에에 loxP 부위를 도입 긴 정방향 프라이머 (표 1의 1)과는 Leu2 카세트 끝. 복제 프로세스의 다음 단계에 대한 추가 제한 사이트를 소개하고, 프라이머 # 1에서 빵 HI 제한 사이트를 추가 할 수 있습니다.
   2. 표 2에 설명 된대로 높은 충실도 DNA 폴리머 라제를 사용하여 PCR을 수행한다.
   3. PCR의의 purificatio를 사용에 loxP-프로모터는 Leu2 - 터미네이터에 loxP 카세트 PCR 생성물을 정제하여제조업체의 지침에 따라 n 개의 키트. 제조업체의 지침 ^(21)에 따라 정제 된 PCR 제품에 3'-A의 돌출을 추가합니다. 사용 T4 DNA 리가 아제는 표 3에 따라 플라스미드 T-는 Leu2를 얻을 수있는 TA 클로닝 벡터에 A-꼬리 PCR 제품을 결찰합니다.
   4. PCR은 프라이머 Y.에서의 # 3 / # 4를 사용 KU70 유전자 1킬로바이트 5 '상류 서열을 증폭 lipolytica PO1G 표 2에 따라 게놈 DNA ^22. 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제 하였다.
      1. 더블. 표 4에 따라 골목 II의 BamHI 및 효소 정제 된 PCR 생성물 및 T-는 Leu2 플라스미드 모두 소화 제조사의 지침에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. 정제를 결찰하는 T4 DNA 리가 제를 사용하여 골목 II로 PCR 생성물을 분해 / T-는 Leu2의 빵 HI 부위를을 수득표 3에 따라 플라스미드 T-LEU2-5E.
   5. PCR은 프라이머 Y.에서의 # 5 / # 6을 사용 KU70 유전자 1킬로바이트 3 '하류 서열을 증폭 lipolytica PO1G 표 2에 따라 게놈 DNA ^22. 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제 하였다. 두 번 정제 된 PCR 제품 및 표 4에 따라 없음 I 및 이니까 I 효소와 T-LEU2-5E 플라스미드를 모두 소화.
      1. 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제. 이어서, 정제를 결찰하고 없음 I / 이니까 표 3에 따라 T4 DNA 리가 아제를 사용하여 플라스미드 T-KO를 수득 T-LEU2-5E의 I 사이트로 PCR 생성물을 소화.
   6. 붕괴 카세트를 생산하기 위해 표 4에 따라 골목 II 및 이니까 I 효소로 플라스미드 T-KO 다이제스트 (그림 1 ). 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 DNA 단편을 정제 하였다.
2. 유능한 세포의 준비와 Y의 변환 lipolytica PO1G 변형
   1. 관할 세포의 준비
      1. Y.의 식민지 접종 YPD 배지 10 ㎖ (1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 % 덱스 트 로즈, 50 mM의 시트르산 염 완충액 pH 4.0) 100 mL의 플라스크에서 신선한 효모 추출물 - 펩톤 - 덱 스트로스 (YPD) 플레이트에서 lipolytica PO1G 균주. 포화 될 때까지 20 시간 (분광 광도계를 이용하여 측정 한 OD 약 15의 _600)를 위해 225 rpm에서 30 ° C 진탕 인큐베이터에서 인큐베이션.
      2. 실온에서 5,000 × g으로 5 분간 원심 분리하여 세포를 펠렛. 20 ml의 트리스 EDTA (TE) 버퍼 (10 mM 트리스, 1 mM의 EDTA, pH를 7.5)로 세포를 씻어 단계 1.2.1.2에 설명 된대로 세포 펠렛. (아세트산으로 pH를 6.0으로 조정) 0.1 M 리튬 아세테이트 1 ml의 세포를 재현 탁하고, 실내 템페에서 10 분 동안 배양rature.
      3. 멸균 1.5 ml의 튜브에 관할 세포 (100 μl를) 나누어지는. 바로 아래의 변형 단계로 진행, 또는 장기간 저장을 위해 -80 ℃에서 최종 농도가 25 % (v / v)의 저장에 글리세롤을 추가한다.
   2. 변환
      1. 부드럽게 적격 세포 100 ㎕와 함께 변성 연어 정자 DNA (10 ㎎ / ㎖) 및 정제 붕괴 카세트 1-5 μg의 10 μL를 혼합하고, 15 분 동안 30 ℃에서 배양한다.
      2. (0.1 M 리튬 아세테이트의 pH 6.0에 용해) 40 % 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) -4000 700 μl를 추가, 잘 혼합하고 60 분 동안 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 배양한다.
         주 : 대신에 (일반적으로 종래의 효모의 형질 전환에 사용 된)의 PEG-3350, 4000의 평균 분자량 PEG를 사용하는 것이 중요하다.
      3. 가열은 60 분 동안 39 ° C의 물을 용기에 튜브를 배치하여 전환 혼합물 충격.
      4. 1 ml의를 YPD 매체를 추가하고30 ° C에서 2 시간, 225 rpm으로 대한 복구 할 수 있습니다. 실온에서 1 분 동안 9000 × g으로 원심 분리기, 상등액을 제거하고 TE 완충액 1 ml 중에 펠렛을 재현 탁.
      5. 실온에서 1 분 동안 9000 × g으로 원심 분리하여 세포를 Repellet하고 상층 액을 제거한다. TE 완충액 100 ㎕에 펠렛을 재현 탁하고 선택적 플레이트 (예를 들어, 류신 - 결핍 플레이트) 위에 플레이트 2-3 일 동안 30 ° C에서 배양한다.
      6. 10 단일 콜로니 4를 선택하고 YPD 배지 2 ㎖에 개별적으로 접종. 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 하룻밤 품어. 각각의 프라이머 # 55 / # 56의 두 세트, 그리고 # 56 / # 57을 사용하여 표 5에 따라 형질 전환 ^{(22)로부터} 게놈 DNA의 PCR 분석에 의해 긍정적 인 식민지를 확인합니다.
         참고 : 없음 나는 pYLEX1 벡터 (Y)로 변환된다 선형화 수를 카운트하여 변환 효율을 결정하기 위해 lipolytica PO1G는 적격 세포μg의 플라스미드 당 집락 형성 단위 (CFU)의 DNA는 ^{23을 사용했다.}

2. 마커 구조

1. Cre 호텔 발현 플라스미드의 구축
   1. pYLEX1-CRE와 pYLEX1-HPH의 건설
      1. 디자인 프라이머 ^(20)는 CRE와 HPH의 오픈 리딩 프레임을 증폭 PCR합니다. 포워드 프라이머 # 82, # 84에 시작 코돈의 상류 추가 아데닌 뉴클레오티드를 추가하고, PCR은 CRE의 오픈 리딩 프레임을 증폭 역방향 프라이머 # 83, # 85을에서 정지 코돈의 하류 KPN I 제한 사이트를 삽입하고 표 2에 따라 pSH69 (수탁 번호 HQ412578) ^{(24)로부터} HPH.
      2. CRE 제조업체의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용 HPH 단편 모두 정제. 다이제스트 모두 내가 TABL에 따라 효소 KPN과 정제 된 CRE와 HPH 조각예 4.. 표 4에 따라 PML KPN I 및 I 효소로 pYLEX1 플라스미드 다이제스트 두배 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다.
      3. Y.의 PML I / KPN I 사이트에 정제 및 소화 CRE와 HPH 조각을 결찰 표 3 당으로 T4 DNA 리가 아제를 사용하여 각각 pYLEX1-CRE와 pYLEX1-HPH를 산출 lipolytica 발현 벡터.
   2. pSL16-CRE-HPH의 건설
      1. PCR 프라이머의 # 86을 사용 pYLEX1-CRE에서 CRE의 프로모터 유전자 터미네이터 카세트를 증폭 / # 87 표 2에 따라, 샐 I / pst 파일 I 제한 부위를 플 랭킹. 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제하여 .
         1. 두 살 난과 함께 정제 된 PCR 제품 및 pSL16-CEN1-1 (227) 플라스미드 ^(25)을 모두 소화PST 표 4에 따라 I 효소. 제조자의 지시에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. 이어서, 표 3에 따라 T4 DNA 리가 아제를 사용 pSL16-CRE을 만드는 대응하는 부위에서 pSL16-CEN1-1 (227)로 분해하고 정제 PCR 생성물을 결찰.
      2. PCR 프라이머를 사용 pYLEX1-HPH에서 HPH의 프로모터 유전자 터미네이터 카세트를 증폭 # 88 / # 89. 표 2에 따라,을 XhoI /을 BglII 제한 부위를 플 랭킹 제조자의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 생성물을 정제하여 .
         1. 더블. 정제 된 PCR 생성물 및 표 4에 따라,와을 XhoI을 BglII 효소 pSL16-CRE 플라스미드 모두 소화 제조사의 지침에 따라 같은 PCR 정제 키트를 사용하여 분해 된 혼합물을 정제 하였다. 그리고, 대응에 pSL16-CRE로 정제 절단 PCR 생성물을 결찰위치는 표 3에 따라 T4 DNA 리가 아제를 사용 pSL16-CRE-HPH를 생성한다.
            참고 : 결과 Cre 호텔 발현 플라스미드, pSL16-CRE-HPH는, 선택 가능한 하이 그로 마이신 B 마커를 항구 및 센트로 미어와 에피 좀 복제 벡터 (그림 2)입니다.
      3. 표 4에 따라 적절한 제한 효소 (예를 들어, 샐 I / 태평양 표준시 나는, 벡터에서 삽입을 절제하는)와 소화에 의해 모든 구조를 확인합니다.
2. CRE 재조합 효소 매개 마커 구조
   1. 위의 섹션 1.2에 설명 된 변환 프로토콜 다음 KU70 녹아웃 균주의 유능한 세포로 pSL16-CRE-HPH 변환. YPD 플러스 하이 그로 마이신 B 상에 플레이트 형질 전환 세포 (YPDH) 플레이트 (400 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신 B를 포함), 그리고 2 ~ 3 일 동안 30 ° C에서 품어.
   2. 표 5에 따라 식민지 PCR을 수행하여 프라이머 # 84 / # 85 긍정적 인 식별변환 후 pSL16-CRE-HPH 플라스미드를 함유하는 콜로니.
      주 : # 84 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 # 85 HPH 유전자 (표 1)의 코딩 영역의 내부에 위치한다. 양성 클론 만이 PCR 반응에서 특정 PCR 생성물을 생성한다.
   3. 긍정적 인 복제를 선택하고 YPDH 매체 2 ㎖에 접종하고, 포화 밤새 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 배양한다. 분광 광도계로 OD 셀 _(600)을 측정한다. ~ (15)의 OD _600에서 세포를 수확. 실온에서 5 분 동안 5000 × g으로 원심 분리하고, 멸균 수 2 ㎖로 한번 세척 하였다.
   4. 초기 OD 0.1 ₆₀₀ YPD 배지 2 ㎖로 세포를 재 접종하고, 세포를 밤새 225 rpm에서 30 ° C 진탕 배양기에서 성장을 허용한다. 킬 YPD 플레이트 상에 하룻밤 세포 배양은 단일 콜로니 ^(23)를 분리합니다. 복제 판 YPD, YPDH 위에 식민지, 그리고 류신 결핍 판 ⁽²³⁾ 입니다.
      참고 : (그림 3) 모두는 Leu2 마커를 잃고 pSL16-CRE-HPH 플라스미드는 YPD 플레이트에서 성장할 수 식민지를.

알코올 탈수소 효소와 알코올 산화 효소 유전자의 3. 삭제

1. Y.에서 검색을 수행 삭제 ²⁶ 유전자 후보들을 식별하는 기본 로컬 맞춤 검색 도구 (BLAST)를 사용 lipolytica 게놈 데이터베이스. 입력 S. 단백질 서열 BLAST 검색 도구로 cerevisiae의 알코올 탈수소 효소 I을 (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
   주 : BLAST 검색 도구가 Y. 가장 유사한 단백질 서열을 반환 lipolytica 게놈 데이터베이스.
2. # 56 (표 1)에 프라이머 번호 7 PCR로 결실 카세트를 구축하고, 제한 효소 절단 및 상기 섹션 1.1에 기재된 바와 같이 동일한 방법을 이용하여 라이 게이션 반응을 수행한다.
3. 예습KU70 녹아웃 균주의 유능한 세포는있다 변환을 수행하고 위의 섹션 1.2에 설명 된 프로토콜에 따라 # 81 (표 1)에 # 55 프라이머, # 58 긍정적 인 식민지를 식별하기 위해 PCR을 수행합니다.
   참고 예로서, YALI0E17787g 유전자의 삭제를위한 절차는도 4 및 5에 기재되어있다. 상동 재조합 속도에 1킬로바이트 및 2킬로바이트 긴 상동 지역의 효과를보고있다.

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결과

선형화 된 Y. lipolytica 발현 벡터 Y.의 게놈에 PBR 도킹 플랫폼에 삽입 하나의 크로스 오버 재조합 ^(27)를 수행하여 lipolytica PO1G 변형. 본 연구에서 확립 급속 화학 변환 절차, Y. 선형화를 사용하여 lipolytica 발현 벡터 성공적> 100 CFU / μg의 DNA의 변환 효율 야생형 PO1G 균주에 형질 전환 하였다. 1킬로바이트 상동 서열에 의해 형벌 녹아?...

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토론

이 연구에 대한 우리의 목적은 Y.에서 대상 유전자 녹아웃의 신속하고 효율적인 생성을 활성화하는 것입니다 이를 위해 lipolytica PO1G 균주. 몇몇 고려 해결 될 필요가있다. 먼저, 높은 변환 효율이 요구된다. Y.에 대한 따라서, 효율적이고 편리한 화학 변환 프로토콜 lipolytica PO1G 균주는 본 연구에서 설명했다. PEG-4000의 사용은이 균주의 성공적인 전환을위한 중요한 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Oligonucleotide primers	Integrated DNA Technologies		25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g	Yeastern Biotech		leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1	Yeastern Biotech	FYY203-5MG	Y. lipolytica expression vector
E. coli TOP10	Invitrogen		For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector	Promega	A3600	TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	For plasmid isolation
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282	Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity DNA polymerase	Bio-Rad	172-5302	High-fidelity DNA polymerase
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriction enzyme
BglII	New England Biolabs	R0144L	Restriction enzyme
KpnI	New England Biolabs	R0142S	Restriction enzyme
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Restriction enzyme
NotI	New England Biolabs	R0189L	Restriction enzyme
PmlI	New England Biolabs	R0532S	Restriction enzyme
PstI	New England Biolabs	R0140S	Restriction enzyme
SacII	New England Biolabs	R0157S	Restriction enzyme
SalI	New England Biolabs	R0138S	Restriction enzyme
XhoI	New England Biolabs	R0146L	Restriction enzyme
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L
Taq DNA polymerase	Bio-Rad	M0267L
Ampicillin	Gibco-Life Technologies	11593-027	Antibiotics
Hygromycin B	PAA	P21-014	Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder	Thermo Scientific	SM0312	1 kb DNA ladder
PEG4000	Sigma	95904-F
Tris	Promega	H5135
EDTA	Bio-Rad	161-0729
Salmon Sperm DNA	Invitrogen	15-632-011
Lithium Acetate	Sigma
Acetic acid	Sigma
Glass beads (425-600 µm)	Sigma	G8772
RNAse A	Thermo Scientific	EN0531
DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611
Bacto Yeast Extract	BD	212750
Bacto Peptone	BD	211677
D-Glucose	1st Base	BIO-1101
YNB without amino acids	Sigma	Y0626
DO Supplement-Leu	Clontech	630414
Glycerol	Sigma	G5516
Difco LB Broth	BD	244620
Difco LB Agar	BD	244520
Bacto Agar	BD	214010
Equipment
PCR machine	Biorad	T100 Thermal Cycler
Water bath	Memmert	WNB 14
Stationary/Shaking Incubator	Yihder	LM-570RD
Thermo-shaker	Allsheng	MS-100
Micro centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer plus
Gel imager	GE	Amersham Imager 600