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Resumo

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

Resumo

Yarrowia lipolytica é um não-patogênicos, dimorfismo e estritamente aeróbias espécies de leveduras. Devido às suas características fisiológicas distintas e características metabólicas, esta levedura não convencionais é não só um bom modelo para o estudo da natureza fundamental de diferenciação de fungos, mas é também uma plataforma microbiana promissora para a produção bioquímica e diversas aplicações biotecnológicas, os quais requerem extensivas manipulações genéticas. No entanto, as manipulações genéticas de Y. lipolytica ter sido limitado devido à falta de um sistema de transformação genética eficiente e estável, bem como muito elevadas taxas de recombinação não homóloga que pode ser atribuída principalmente ao gene Ku70. Aqui, descrevemos um protocolo fácil e rápido para a transformação genética eficiente e para a deleção do gene em Y. lipolytica Po1g. Em primeiro lugar, um protocolo para a transformação eficiente do ADN exógeno em Y. lipolytica Po1g foi estabelecida. SecoND, para atingir a taxa de recombinação homóloga de dupla permutação reforçada para posterior eliminação de genes alvo, o gene Ku70 foi eliminado por transformação de uma cassete de disrupção transportando 1 kb braços de homologia. Em terceiro lugar, para demonstrar a eficiência deleção do gene reforçada após a eliminação do gene Ku70, nós apagadas individualmente 11 genes alvo que codificam álcool desidrogenase e álcool oxidase utilizando os mesmos procedimentos sobre a tensão Ku70 plataforma nocaute. Observou-se que a taxa de recombinação homóloga precisa aumentou substancialmente de menos de 0,5% para eliminação do gene Ku70 em Po1g a 33% -71% para a deleção do gene único dos 11 genes-alvo em Po1g Ku70 Δ. Um plasmídeo replicativo que transporta o marcador de resistência a higromicina B e o sistema Cre / LoxP foi construído, e o gene marcador de selecção nas estirpes knockout de levedura foi finalmente removido por expressão da recombinase Cre para facilitar a múltiplas rondas de targeted manipulações genéticas. Os mutantes de deleção de um único gene resultantes têm potenciais aplicações em biocombustíveis e produção bioquímica.

Introdução

Ao contrário de Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, uma levedura convencional, pode crescer sob a forma de levedura ou micélio em resposta a alterações das condições ambientais 1,2. Assim, esta levedura dimorphic pode ser usado como um bom modelo para o estudo da diferenciação fúngica, a morfogénese e 3,4,5 taxonomia. É geralmente considerada como uma espécie de levedura seguros (GRAS), que é amplamente utilizado para produzir uma variedade de aditivos alimentares, tais como ácidos orgânicos, poli-álcoois, compostos de aroma, agentes emulsionantes e agentes tensioactivos 6,7,8,9. É um aeróbio obrigatório e uma levedura oleaginosa bem conhecido capaz de acumular lípidos naturalmente em altas quantidades, isto é, até 70% do peso seco da célula 10. Também pode utilizar uma vasta gama de fontes de carbono para o crescimento, incluindo diferentes tipos de resíduos nos recursos usados ​​como nutrientes 11,12,13. Todas estas características únicas fazem Y. lipolytica muito atraente paradiversas aplicações biotecnológicas.

Apesar de toda a sequência do genoma da Y. lipolytica foi publicada 14,15, manipulação genética desta levedura não convencional é mais complexa do que outras espécies de levedura. Em primeiro lugar, esta transformação de espécies de levedura é muito menos eficiente devido à ausência de um sistema de transformação genética 16,17 estável e eficiente. Em segundo lugar, a integração genómica laboriosa de cassetes de expressão lineares é normalmente usado para a expressão de genes de interesse que nenhum sistema de plasmídeo epissomal natural foi encontrado nesta levedura 18. Em terceiro lugar, geração de knock-out genéticos e knock-ins são limitados porque o gene alvo eficiência através de recombinação homóloga precisas neste levedura é baixa ea maioria dos eventos de integração ocorrer até o final não homóloga juntar (NHEJ) 19.

Neste estudo, nós relatamos um protocolo de transformação otimizada para o Y. lipolytica estirpe Po1g, que é fácil, rápido, eficaz e reprodutível. Para aumentar a frequência de recombinação homóloga preciso, que suprimido o gene Ku70, que codifica uma enzima chave na via NHEJ. Usando o protocolo de transformação optimizado e transformando uma cassete nocaute linear contendo regiões de homologia flanqueadoras de 1 kb, do gene da Ku70 Y. lipolytica Po1g foi excluído com sucesso. A robustez desta metodologia deleção do gene foi então demonstrado pela segmentação álcool desidrogenase e genes de álcool oxidase na estirpe Po1g Ku70 Δ. Observou-se que a estirpe de eliminação Ku70 exibiram uma eficiência consideravelmente mais elevada de genes mediada por recombinação homóloga segmentação do que a da estirpe de tipo selvagem Po1g. Além disso, um plasmídeo de expressão de Cre replicativa que transporta o marcador de resistência à higromicina B foi construída para efectuar recuperação do marcador. A recuperação do marcador facilita várias rodadas de gene alvo in the obtidos os mutantes de deleção do gene. Além deleção do gene, o nosso protocolo para a transformação genética e a deleção do gene aqui descrita pode ser aplicada para inserir genes para loci específicos, e para introduzir mutações específicas do local em Y. genoma lipolytica.

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Protocolo

1. Geração do Y. lipolytica Ku70 Supressão Strain

  1. Construção da cassete de disrupção
    Nota: Ver Tabela 1 para todos os iniciadores utilizados na reacção em cadeia da polimerase (PCR) amplificações.
    1. 20 conceber iniciadores para amplificar por PCR a cassete de expressão LEU2 (ver Tabela 1) a partir de um Y. vector de expressão lipolytica e introduzir sítios loxP em 5 'e 3' da cassete de LEU2 com um iniciador para a frente longo (# 1; Tabela 1) e um iniciador inverso de comprimento (# 2; Tabela 1), respectivamente. Para introduzir um sítio de restrição adicional para os passos subsequentes do processo de clonagem, adicionar um sítio de restrição BamHI no iniciador # 1.
    2. Executar PCR utilizando uma ADN polimerase de alta fidelidade, conforme detalhado na Tabela 2.
    3. Purificar o produto PCR LoxP-promotor-LEU2-terminator-LoxP cassete usando um purificatio PCRN kit de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar saliências 3'-A para o produto de PCR purificado de acordo com as instruções do fabricante 21. A utilização de ADN-ligase de T4 para ligar o produto de PCR de cauda A num vector de clonagem TA para produzir o plasmídeo de T-LEU2 conforme indicado na Tabela 3.
    4. Amplificar por PCR de 1 kb a sequência 5 'a montante do gene Ku70 utilizando os iniciadores # 3 / # 4 do Y. lipolytica Po1g ADN genómico de 22 conforme indicado na Tabela 2. Purifica-se o produto de PCR utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Digestão dupla tanto o produto de PCR purificado e plasmídeo T-LEU2 com enzimas Sac II e Bam Hl conforme indicado na Tabela 4. Purifica-se a mistura de digestão usando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Use DNA ligase de T4 para ligar o purificado e digerido produto de PCR para o SacII / locais Bam HI de t-LEU2 para se obter oplasmídeo T-LEU2-5E conforme Tabela 3.
    5. Amplificar por PCR a 1 kb 'sequência a jusante 3' do gene utilizando iniciadores Ku70 # 5 / # 6 do Y. lipolytica Po1g ADN genómico de 22 conforme indicado na Tabela 2. Purifica-se o produto de PCR utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Duplo digerir tanto o produto PCR purificado e plasmídeo T-LEU2-5E com Not I e Nde I enzimas conforme tabela 4.
      1. Purifica-se a mistura de digestão usando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, ligar o purificado e digerido produto de PCR ao Not I / Nde locais I da T-LEU2-5E para produzir o plasmídeo T-KO usando DNA ligase de T4 de acordo com a Tabela 3.
    6. Digerir o plasmídeo T-KO com Sac II e Nde I enzimas de acordo com a Tabela 4 para produzir o cassete de disrupção (Figura 1 ). Purifica-se os fragmentos de ADN digeridos utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Preparação de células competentes e transformação de Y. estirpe lipolytica Po1g
    1. preparação de células competentes
      1. Inocular uma colônia de Y. estirpe lipolytica Po1g a partir de uma placa fresca de extracto de levedura-peptona-dextrose (YPD) em 10 ml de meio YPD (1% de extracto de levedura, 2% de peptona, 2% de dextrose e 50 mM de tampão de citrato de pH 4,0) em um balão de 100 ml. Incubar numa incubadora com agitação a 30 ° C a 225 rpm durante 20 horas até à saturação (uma DO600 de cerca de 15, medido usando um espectrofotómetro).
      2. Agregar as células por centrifugação durante 5 min a 5000 xg à temperatura ambiente. Lavam-se as células com 20 ml de tampão Tris-EDTA (TE) de tampão (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5), e sedimentar as células tal como descrito no passo 1.2.1.2. Ressuspender as células em 1 ml de acetato de lítio 0,1 M (pH 6,0, ajustado com ácido acético), e incubar durante 10 minutos a tempe quartorature.
      3. Alíquota as células competentes (100 uL) em tubos de 1,5 ml estéreis. Avance para os passos de transformação imediatamente a seguir, ou adicionar glicerol a uma concentração final de 25% (v / v) e armazenar a -80 ° C para armazenamento a longo prazo.
    2. Transformação
      1. Misturar suavemente 10 ul de ADN de esperma de salmão desnaturado (10 mg / ml) e 1-5 ug de a cassete de disrupção purificada juntamente com 100 ul de células competentes, e incuba-se a 30 ° C durante 15 min.
      2. Adicionar 700 ul de polietileno glicol a 40% (PEG) -4000 (dissolvido em 0,1 M de lítio de acetato, pH 6,0), misturar bem e incubar numa incubadora com agitação a 30 ° C a 225 rpm durante 60 min.
        Nota: É importante a utilização de PEG com um peso molecular médio de 4000, em vez de PEG-3350 (tipicamente utilizado na transformação de levedura convencional).
      3. Choque térmico a mistura de transformação, colocando o tubo num banho de água a 39 ° C durante 60 min.
      4. Adicionar 1 ml de meio YPD erecuperar durante 2 horas a 30 ° C e 225 rpm. Centrifugar a 9.000 xg durante 1 min à temperatura ambiente, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão TE.
      5. Repellet as células por centrifugação a 9000 xg durante 1 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão TE e placa sobre placas selectivas (por exemplo, placas de leucina-deficiente), e incuba-se a 30 ° C durante 2-3 dias.
      6. Escolha de 4 a 10 colónias individuais e inocular separadamente em 2 ml de meio YPD. Incubar durante a noite numa incubadora de agitação de 30 ° C a 225 rpm. Identificar as colónias positivas por análise de PCR de ADN genómico a partir dos transformantes 22 conforme indicado na Tabela 5, utilizando dois conjuntos de iniciadores # 55 / # 56, e # 56 / # 57, respectivamente.
        Nota: O Not I linearizado pYLEX1 vector é transformado em Y. lipolytica Po1g células competentes, a fim de determinar a eficiência de transformação através da contagem do númerode unidades formadoras de colónias (CFU) por ug de ADN plasmídeo utilizado 23.

2. recuperação do marcador

  1. Construção do plasmídeo de expressão de Cre
    1. Construção de pYLEX1-CRE e pYLEX1-HPH
      1. 20 conceber iniciadores para amplificar por PCR os enquadramentos de leitura abertos de CRE e HPH. Adicionar um nucleótido adenina adicional a montante dos códons de iniciação nos primers para a frente # 82 e # 84, e insira os locais de restrição Kpn I a jusante dos códons de parada nos iniciadores reversos # 83 e # 85. PCR amplificar as grelhas de leitura aberta de cre e HPH de pSH69 (número de acesso HQ412578) 24 conforme Tabela 2.
      2. Purifica-se ambos os fragmentos HPH utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante e CRE. Digest ambos os fragmentos CRE e HPH purificado com Kpnl enzima, como por Table 4. dupla digestão do plasmídeo com as enzimas de pYLEX1 Pml I e Kpn I, como por Tabela 4. Purifica-se a mistura de digestão usando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante.
      3. Use DNA ligase de T4 de acordo com a Tabela 3 para ligar as cre e HPH fragmentos purificados e digeridos para sites Pml I / Kpn I do Y. lipolytica vector de expressão, originando pYLEX1-CRE e pYLEX1-HPH, respectivamente.
    2. Construção de pSL16-CRE-HPH
      1. Amplificar por PCR a cassete promotor-gene-terminador de CRE a partir pYLEX1-CRE utilizando os iniciadores # 86 / # 87 flanqueando os locais de restrição Sal I / Pst I como na Tabela 2. Purifica-se o produto de PCR utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante .
        1. Digestão dupla tanto o produto de PCR purificado e pSL16-CEN1-1 (227) 25 plasmídeo com Sall eEnzimas Pst I como na Tabela 4. Purifica-se a mistura de digestão usando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, ligar o produto de PCR purificado e digerido em pSL16-CEN1-1 (227) nos locais correspondentes para criar pSL16-CRE utilizando ligase de DNA de T4 de acordo com a Tabela 3.
      2. Amplificar por PCR a cassete promotor-gene-terminador de HPH de pYLEX1-HPH utilizando os iniciadores # 88 / # 89 flanqueando os locais de restrição Xho I / Bgl II conforme indicado na Tabela 2. Purifica-se o produto de PCR utilizando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante .
        1. Digestão dupla tanto o produto de PCR purificado e plasmídeo pSL16-CRE com enzimas Xho I e Bgl II conforme a Tabela 4. Purifica-se a mistura de digestão usando um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, ligar o produto de PCR purificado e digerido em pSL16 por CRE na correspondentesites para gerar pSL16-CRE-HPH utilizando ligase de DNA de T4 de acordo com a Tabela 3.
          Nota: O plasmídeo resultante expressão de Cre, pSL16-CRE-HPH, abriga um marcador seleccionável de higromicina B e é um vector epissomal centromérica e replicando (Figura 2).
      3. Verificar todas as construções por digestão com enzimas de restrição apropriadas (por exemplo, Sal I / Pst I, para excisar o inserto do vector) conforme indicado na Tabela 4.
  2. Cre resgate de marcador mediada por recombinase
    1. Transformar pSL16-CRE-HPH em células competentes da estirpe knockout Ku70 seguindo o protocolo de transformação descrito no ponto 1.2 acima. Placa transformadas células nas YPD mais higromicina B (YPDH) placas (contendo 400 ug / ml de higromicina B), e incuba-se a 30 ° C durante 2-3 dias.
    2. Realizam colônia PCR conforme a Tabela 5, utilizando os iniciadores # 84 / # 85 para identificar positivacolónias contendo o plasmídeo pSL16-CRE-HPH após transformação.
      Nota: A frente iniciador # 84 e o iniciador reverso # 85 estão localizados dentro da região de codificação do gene HPH (Tabela 1). Apenas os clones positivos gerar um produto de PCR específico na reacção de PCR.
    3. Escolher um clone positivo e inocular em 2 ml de meio YPDH, e incubar numa incubadora com agitação a 30 ° C a 225 rpm durante a noite até à saturação. Medir a OD de células 600 com um espectrofotômetro. Colher as células a uma DO 600 de ~ 15. Centrifugar a 5.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e lava-se uma vez com 2 ml de água estéril.
    4. As células re-inocular em 2 ml de meio YPD com uma DO 600 de 0,1 inicial e permitir que as células a crescer num incubador com agitação a 30 ° C a 225 rpm durante a noite. Espalhar a cultura de células durante a noite em placas de YPD para isolar colónias individuais 23. Colónias placa réplica Onto YPD, YPDH e placas de leucina com deficiência de 23 .
      Nota: As colónias que perderam o marcador LEU2 e ambos pSL16-CRE-HPH plasmídeo só pode crescer em placas de YPD (Figura 3).

3. Supressão de álcool-desidrogenase e álcool oxidase Genes

  1. Realizar uma pesquisa sobre o Y. banco de dados de genoma lipolytica utilizando o local Alignment Tool Pesquisa Básica (BLAST) para identificar os genes candidatos para exclusão 26. Entrada a sequência da proteína de S. cerevisiae álcool desidrogenase I em ferramenta de pesquisa BLAST (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
    Nota: A ferramenta de pesquisa BLAST retorna as sequências proteicas mais similares na Y. banco de dados de genoma lipolytica.
  2. Construir as cassetes de eliminação por PCR com os iniciadores # 7 # 56 (Tabela 1), e realizar a digestão de restrição enzimática e reacções de ligação, utilizando os mesmos métodos, como descrito na secção 1.1 acima.
  3. Preparaçãosão células competentes da estirpe knockout Ku70, realizar transformações e realizar PCR para identificar as colónias positivas com iniciadores # 55, # 58 e # 81 (Tabela 1), seguindo o protocolo descrito no ponto 1.2 acima.
    Observação: Como um exemplo, o procedimento para a deleção do gene YALI0E17787g é descrito nas Figuras 4 e 5. Os efeitos de 1 kb e 2 kb de comprimento região homóloga na taxa de recombinação homóloga são relatados.

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Resultados

A Y. linearizado vector de expressão lipolytica foi inserido na plataforma de encaixe pBR no genoma de Y. lipolytica cepa Po1g através da realização de um único recombinação de crossover 27. Ao utilizar o processo de transformação química rápida estabelecido neste estudo, a Y. linearizado vector de expressão lipolytica foi transformado com sucesso para a estirpe de tipo selvagem Po1g a uma eficiência de transformação ...

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Discussão

O nosso objectivo para este estudo é permitir a geração rápida e eficiente de nocaute de genes alvo do Y. lipolytica Po1g tensão. Várias considerações devem ser abordadas para conseguir isso. Em primeiro lugar, uma elevada eficiência de transformação é necessária. Assim, um protocolo de transformação química eficiente e conveniente para o Y. lipolytica Po1g estirpe foi descrito no presente estudo. O uso de PEG-4000 é um fator crítico para a transformação bem sucedida desta ...

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Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

Agradecemos o apoio financeiro da Agência Nacional de Meio Ambiente de Singapura (ETRP 1.201.102), o Programa de Pesquisa Competitiva da Fundação Nacional de Pesquisa de Singapura (NRF-CRP5-2009-03), a Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa de Cingapura ( 1324004108), a global Programa de P & D do Projeto, o Ministério da Economia do Conhecimento, a República da Coreia (N0000677), a Agência de Redução de defesa contra ameaças (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) e da Biologia sintética Iniciativa da Universidade Nacional de Cingapura ( PRPD / 943/09/14).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent/Material
Oligonucleotide primersIntegrated DNA Technologies25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1gYeastern Biotechleucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1Yeastern BiotechFYY203-5MGY. lipolytica expression vector
E. coli TOP10InvitrogenFor cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector PromegaA3600TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106For plasmid isolation
Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System		PromegaA9282Extract DNA fragments from agarose gels
and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity
DNA polymerase		Bio-Rad172-5302High-fidelity DNA polymerase
BamHI New England BiolabsR0136SRestriction enzyme
BglII New England BiolabsR0144LRestriction enzyme
KpnINew England BiolabsR0142SRestriction enzyme
NdeI New England BiolabsR0111SRestriction enzyme
NotINew England BiolabsR0189LRestriction enzyme
PmlINew England BiolabsR0532SRestriction enzyme
PstI New England BiolabsR0140SRestriction enzyme
SacIINew England BiolabsR0157SRestriction enzyme
SalINew England BiolabsR0138SRestriction enzyme
XhoINew England BiolabsR0146LRestriction enzyme
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202L
Taq DNA polymerase Bio-RadM0267L
AmpicillinGibco-Life Technologies11593-027Antibiotics
Hygromycin BPAAP21-014Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladderThermo ScientificSM03121 kb DNA ladder
PEG4000Sigma95904-F
TrisPromegaH5135
EDTABio-Rad161-0729
Salmon Sperm DNAInvitrogen15-632-011
Lithium AcetateSigma
Acetic acidSigma
Glass beads (425-600 µm)SigmaG8772
RNAse AThermo ScientificEN0531
DNA Loading DyeThermo ScientificR0611
Bacto Yeast ExtractBD212750
Bacto PeptoneBD211677
D-Glucose1st BaseBIO-1101
YNB without amino acidsSigmaY0626
DO Supplement-LeuClontech630414
GlycerolSigmaG5516
Difco LB BrothBD244620
Difco LB AgarBD244520
Bacto AgarBD214010
Equipment
PCR machineBioradT100 Thermal Cycler
Water bathMemmertWNB 14
Stationary/Shaking IncubatorYihderLM-570RD
Thermo-shakerAllshengMS-100
Micro centrifugeEppendorf5424R
CentrifugeEppendorf5810R
SpectrophotometerEppendorf BioPhotometer plus
Gel imagerGEAmersham Imager 600

Referências

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