Génie génétique d'une levure Unconventional for Renewable Biofuel and Production Biochemical

Résumé

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

Résumé

Yarrowia lipolytica est une espèce de levure non pathogènes, dimorphes et strictement aérobies. En raison de ses caractéristiques physiologiques distinctifs et caractéristiques métaboliques, cette levure non conventionnelle est non seulement un bon modèle pour l'étude de la nature fondamentale de la différenciation fongique, mais est également une plate-forme microbienne prometteuse pour la production biochimique et diverses applications biotechnologiques, qui nécessitent de nombreuses manipulations génétiques. Cependant, les manipulations génétiques de Y. lipolytica ont été limités en raison de l'absence d'un système de transformation génétique efficace et stable, ainsi que des taux très élevés de recombinaison non homologue qui peut être principalement attribuée au gène KU70. Nous rapportons ici un protocole simple et rapide pour la transformation génétique efficace et pour la suppression du gène en Y. lipolytica Po1g. Tout d' abord, un protocole pour la transformation efficace de l' ADN exogène dans Y. lipolytica Po1g a été créé. Second, pour atteindre le double croisement taux de recombinaison homologue amélioré pour deletion supplémentaire de gènes cibles, le gène KU70 a été supprimée par la transformation d' une cassette de disruption 1 kb portant homologie bras. Troisièmement, mettre en évidence le gène suppression efficacité accrue après la suppression du gène KU70, nous avons supprimé individuellement 11 gènes cibles codant pour l' alcool déshydrogénase et l' alcool oxydase en utilisant les mêmes procédures sur la souche KU70 de plate - forme de KO. On a observé que le taux de recombinaison homologue précise sensiblement augmenté de moins de 0,5% pour la suppression du gène dans KU70 Po1g à 33% -71% pour la suppression d' un gène unique des 11 gènes cibles dans KU70 Po1g Δ. Un plasmide réplicatif portant le marqueur de résistance à l'hygromycine B et le système Cre / loxP a été construit et le gène marqueur de sélection dans les souches de levure knock-out a finalement été éliminé par l'expression de la recombinase Cre pour faciliter des cycles multiples de targemanipulations génétiques ted. Les mutants de délétion d'un gène unique résultant ont des applications potentielles dans les biocarburants et la production biochimique.

Introduction

Contrairement à Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, une levure non conventionnelle, peut se développer sous la forme de levure ou mycélium en réponse aux changements des conditions environnementales ^1,2. Ainsi, cette levure dimorphique peut être utilisé comme un bon modèle pour l'étude de la différenciation fongique, la morphogenèse et la taxonomie ^3,4,5. Il est généralement considéré comme un coffre - fort (GRAS) des espèces de levures, qui est largement utilisé pour produire une variété d'additifs alimentaires , tels que des acides organiques, des polyalcools, des composés aromatiques, des émulsifiants et des agents tensio - actifs ^6,7,8,9. Il est un aérobique de obligatoire et une levure oléagineuse bien connu capable d'accumuler naturellement les lipides à des quantités élevées, soit jusqu'à 70% de poids sec des cellules ^10. Elle peut aussi utiliser un large éventail de sources de carbone pour la croissance, y compris les différents types de résidus dans le gaspillage de ressources que les nutriments ^11,12,13. Toutes ces caractéristiques uniques font Y. lipolytica très attractif pour lesdiverses applications biotechnologiques.

Bien que la totalité de la séquence du génome de Y. lipolytica a été publiée ^14,15, manipulation génétique de cette levure non conventionnelle est plus complexe que d' autres espèces de levure. Tout d' abord, la transformation de cette espèce de levure est beaucoup moins efficace en raison de l'absence d'un système de transformation génétique ^16,17 stable et efficace. En second lieu , l' intégration génomique laborieuse des cassettes d'expression linéaires est couramment utilisé pour l'expression de gènes d'intérêt car aucun système de plasmide épisomique naturel a été trouvée dans cette levure ^18. Troisièmement, la génération de knock-outs génétiques et knock-ins sont limitées parce que le gène efficacité du ciblage par recombinaison homologue précis dans cette levure est faible et la plupart des événements d'intégration se produit à travers l' extrémité non homologue de jonction (NHEJ) ^19.

Dans cette étude, nous présentons un protocole de transformation optimisée pour Y. lipolytica souche Po1g, ce qui est facile, rapide, efficace et reproductible. Pour améliorer la fréquence de recombinaison homologue précise, nous avons supprimé le gène KU70, qui code pour une enzyme clé dans la voie NHEJ. En utilisant le protocole de transformation optimisée et la transformation d' une cassette de knock-out linéaire contenant flanquant régions d'homologie de 1 kb du gène de la KU70 Y. lipolytica Po1g a été supprimé. La robustesse de cette méthode de suppression du gène a ensuite été démontrée en ciblant l' alcool déshydrogénase et les gènes de l' alcool oxydase dans la souche Po1g KU70 Δ. On a observé que la souche de deletion KU70 présentait une efficacité nettement plus élevée du gène de la recombinaison médiée par ciblage homologue à celle de la souche Po1g de type sauvage. En outre, une expression réplicatif Cre plasmide portant le marqueur de résistance à l'hygromycine B a été construit pour réaliser le marqueur de sauvetage. Le sauvetage de marqueur facilite plusieurs tours de ciblage de gènes dans ee a obtenu des mutants de deletion de gène. En plus de la suppression des gènes, notre protocole pour la transformation génétique et la suppression du gène décrit ici peut être utilisé pour insérer des gènes à des loci spécifiques et d'introduire des mutations spécifiques au site en Y. lipolytica génome.

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Protocole

1. Génération de Y. lipolytica KU70 délétion Strain

1. La construction de la cassette de disruption
   Note: Voir le tableau 1 pour toutes les amorces utilisées dans la réaction en chaîne par polymérase (PCR) amplifications.
   1. Conception des amorces ²⁰ pour amplifier par PCR la cassette d'expression LEU2 (voir le tableau 1) à partir d' un Y. Vecteur d'expression lipolytica et d' introduire des sites LoxP dans le sens 5 'et 3' de la cassette LEU2 avec une longue amorce avant (# 1; tableau 1) et une longue amorce inverse (# 2; tableau 1), respectivement. Pour introduire un site de restriction supplémentaire pour les étapes ultérieures du processus de clonage, ajouter un site de restriction Bam HI dans l' amorce # 1.
   2. Faire la PCR en utilisant un ADN polymérase haute fidélité comme détaillé dans le tableau 2.
   3. Purifier le produit PCR LoxP-promoteur-LEU2-terminator-LoxP la cassette en utilisant un purificatio PCRn Kit selon les instructions du fabricant. Ajouter des surplombs 3 'A et le produit de PCR purifié selon les instructions du fabricant ^21. Utiliser l' ADN T4 ligase pour ligaturer le produit A-tailed PCR dans un vecteur de clonage TA pour donner le plasmide T-LEU2 selon le tableau 3.
   4. Amplifier par PCR le 1 kb séquence 5 ' en amont du gène en utilisant des amorces KU70 # 3 / # 4 du Y. Po1g lipolytica de l' ADN génomique ²² selon le tableau 2. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant.
      1. Double digérer à la fois le produit de PCR purifié et T-LEU2 plasmidique avec les enzymes Sac II et Bam HI selon le Tableau 4. Purifier le mélange de digestion en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. En utilisant l' ADN ligase T4 pour ligaturer le produit purifié et digéré par PCR au Sac II / Bam HI de sites de T-LEU2 pour donner leplasmide T-LEU2-5E selon le tableau 3.
   5. Amplifier par PCR la séquence de 1 kb 3 ' en aval du gène en utilisant des amorces KU70 # 5 / # 6 de Y. Po1g lipolytica de l' ADN génomique ²² selon le tableau 2. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Double digérer à la fois le produit purifié PCR et le plasmide T-LEU2-5E avec Not I et Nde enzymes I selon le Tableau 4.
      1. On purifie le mélange de digestion en utilisant un kit de purification de PCR selon les instructions du fabricant. Ensuite, ligaturer purifié et digéré produit PCR à l'Not I / Nde Les sites que je de T-LEU2-5E pour donner le plasmide T-KO en utilisant l' ADN ligase T4 selon le Tableau 3.
   6. Digest le plasmide T-KO avec Sac II et Nde enzymes I selon le tableau 4 pour produire la cassette de rupture (Figure 1 ). Purifier les fragments d'ADN digérés en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant.
2. Préparation de cellules compétentes et la transformation de Y. souche lipolytica Po1g
   1. Préparation de cellules compétentes
      1. Inoculer une colonie de Y. la souche lipolytica Po1g à partir d' une plaque de levure fraîche d' extrait-peptone-dextrose (YPD) dans 10 ml de milieu YPD (1% d' extrait de levure, 2% de peptone, 2% de glucose et 50 mM de tampon citrate pH 4,0) dans un flacon de 100 ml. Incuber dans un incubateur agitateur à 30 ° C à 225 tpm pendant 20 heures jusqu'à saturation (une _DO600 d'environ 15, mesurée en utilisant un spectrophotomètre).
      2. Sédimenter les cellules par centrifugation pendant 5 min à 5000 x g à température ambiante. Laver les cellules avec 20 ml de Tris-EDTA (TE) du tampon (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5), et le culot les cellules comme décrit dans l'étape 1.2.1.2. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 0,1 M d'acétate de lithium (pH 6,0, ajusté avec de l'acide acétique) et incuber pendant 10 min à la chambre temrature.
      3. Aliquoter les cellules compétentes (100 pi) dans 1,5 ml des tubes stériles. Procéder aux étapes de transformation immédiatement au-dessous, ou ajouter du glycérol à une concentration finale de 25% (v / v) et conserver à -80 ° C pour une conservation à long terme.
   2. Transformation
      1. mélanger doucement à 10 ul de l'ADN dénaturé de sperme de saumon (10 mg / ml) et de 1 à 5 ug de la cassette de disruption purifié avec 100 pl de cellules compétentes et on incube à 30 ° C pendant 15 min.
      2. Ajouter 700 ul de 40% de polyéthylène glycol (PEG) -4000 (dissous dans 0,1 M de lithium acétate pH 6,0), bien mélanger et incuber dans un incubateur agitateur à 30 ° C à 225 rpm pendant 60 min.
         Remarque: il est important d'utiliser le PEG avec un poids moléculaire moyen de 4000, au lieu de PEG 3350 (généralement utilisé dans la transformation de la levure classique).
      3. Choc thermique du mélange de transformation en plaçant le tube dans un bain d'eau à 39 ° C pendant 60 min.
      4. Ajouter 1 ml de milieu YPD etrécupérer pendant 2 heures à 30 ° C et 225 rpm. Centrifuger à 9000 g pendant 1 min à température ambiante, éliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon TE.
      5. Repellet les cellules par centrifugation à 9000 g pendant 1 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Remettre en suspension le culot dans 100 pl de tampon TE et on plaque sur des plaques sélectives (par exemple, des plaques déficientes en leucine) et incuber à 30 ° C pendant 2-3 jours.
      6. Choisir entre 4 et 10 colonies individuelles et séparément dans inoculer 2 ml de milieu YPD. Incuber une nuit dans un incubateur en secouant à 30 ° C à 225 tours par minute. Identifier les colonies positives par analyse par PCR de l' ADN génomique provenant de ²² transformants selon le tableau 5 en utilisant deux ensembles d'amorces # 55 / # 56 et # 56 / # 57, respectivement.
         Note: Le Not I linéarisé pYLEX1 vecteur est transformé en Y. lipolytica Po1g cellules compétentes afin de déterminer l'efficacité de transformation en comptant le nombreunités formant des colonies (ufc) par ug d' ADN plasmidique ²³ utilisé.

2. Marqueur Rescue

1. La construction du plasmide d'expression de Cre
   1. Construction de pYLEX1-CRE et pYLEX1-HPH
      1. Conception des amorces ²⁰ pour amplifier par PCR les cadres de cre et hph de lecture ouverts. Ajouter une adénine nucléotide supplémentaire en amont des codons de départ dans les amorces sens # 82 et # 84, et d' insérer des sites de restriction Kpnl en aval des codons d'arrêt dans les amorces inverses # 83 et # 85 amplifier par PCR les trames de cre de lecture ouverts et hph de pSH69 (numéro d' accession HQ412578) ²⁴ selon le tableau 2.
      2. Purifier les deux cre et des fragments hph en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Digest à la fois les cre et hph fragments purifiés avec Kpn I enzyme selon Table 4. Double digérer le plasmide pYLEX1 avec des enzymes Pml I et Kpn I selon le Tableau 4. Purifier le mélange de digestion en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant.
      3. Utilisez l' ADN ligase T4 selon le tableau 3 pour ligaturer les cre et hph fragments purifiés et digérés vers des sites Pml I / Kpn I du Y. vecteur d'expression de lipolytica, donnant pYLEX1-CRE et pYLEX1-HPH, respectivement.
   2. Construction de pSL16-CRE-HPH
      1. Amplifier par PCR la cassette promoteur-gène-terminateur de cre partir pYLEX1-CRE en utilisant des amorces # 86 / # 87 flanquant les Sal I / Pst I sites de restriction conformément au Tableau 2. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant .
         1. Double digérer à la fois le produit de PCR purifié et pSL16-CEN1-1 (227) plasmide ²⁵ avec Sal I etPst I enzymes selon le Tableau 4. Purifier le mélange de digestion en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Ensuite, ligaturer le produit de PCR purifié et digéré dans pSL16-CEN1-1 (227) au niveau des sites correspondant à créer pSL16-CRE en utilisant l' ADN ligase T4 selon le tableau 3.
      2. Amplifier par PCR la cassette promoteur-gène-terminateur de hph de pYLEX1-HHP en utilisant des amorces # 88 / # 89 flanquant les sites de restriction Xho I / Bgl II selon le tableau 2. On purifie le produit PCR en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant .
         1. Double digérer à la fois le produit purifié PCR et pSL16-CRE plasmidique avec les enzymes Xho I et Bgl II selon le Tableau 4. Purifier le mélange de digestion en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Ensuite, ligaturer le produit de PCR purifié et digéré dans pSL16-CRE au correspondantsites pour générer pSL16-CRE-HPH en utilisant l' ADN ligase T4 selon le Tableau 3.
            Remarque: Le Cre expression plasmide résultant, pSL16-CRE-HPH, abrite un marqueur hygromycine B sélectionnable et est un vecteur centromérique et la réplication épisomique (Figure 2).
      3. Vérifiez toutes les constructions par digestion avec des enzymes de restriction appropriées (par exemple, Sal I / Pst I, pour exciser l'insert du vecteur) selon le Tableau 4.
2. Cre recombinase-médiée sauvetage du marqueur
   1. Transformer pSL16-CRE-HPS dans des cellules compétentes de la souche knockout KU70 suivant le protocole de transformation décrit dans la section 1.2 ci - dessus. Plate transformé cellules sur YPD, plus hygromycine B (YPDH) plaques (contenant 400 ug / ml d'hygromycine B), et incuber à 30 ° C pendant 2-3 jours.
   2. Effectuer colonie PCR selon le tableau 5 en utilisant des amorces # 84 / # 85 pour identifier positifcolonies contenant pSL16-CRE-HPH plasmidique après transformation.
      Note: L'amorce sens n ° 84 et l'amorce inverse # 85 sont situés à l' intérieur de la région codante du gène hph (tableau 1). Seuls les clones positifs de générer un produit de PCR spécifique dans la réaction PCR.
   3. Choisissez un clone positif et inoculer dans 2 ml de milieu YPDH, et incuber dans un incubateur agitateur à 30 ° C à 225 tours par minute pendant une nuit à la saturation. Mesurer la densité optique de la cellule ₆₀₀ avec un spectrophotomètre. Récolter les cellules à une DO ₆₀₀ de ~ 15. Centrifuger à 5000 xg pendant 5 min à température ambiante, et laver une fois avec 2 ml d'eau stérile.
   4. Re-inoculer des cellules dans 2 ml de milieu YPD avec une première DO ₆₀₀ de 0,1 et permettent aux cellules de se développer dans un incubateur agitateur à 30 ° C à 225 tours par minute pendant la nuit. Streak la culture cellulaire pendant la nuit sur ​​des plaques de YPD pour isoler des colonies isolées ^23. Les colonies de la plaque de réplication ONTO YPD, YPDH et les plaques de ²³ déficientes en leucine .
      Note: Les colonies qui ont perdu à la fois le marqueur LEU2 et pSL16-CRE-HPH plasmide ne peut se développer sur des plaques de YPD (Figure 3).

3. Suppression de l'alcool déshydrogénase et de l'alcool oxydase Genes

1. Effectuer une recherche sur Y. base de données du génome de lipolytica utilisant le Local Alignment Search Tool de base (BLAST) pour identifier les gènes candidats pour la suppression ^26. Entrer la séquence de la protéine de S. cerevisiae alcool déshydrogénase I dans l' outil de recherche BLAST (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
   Remarque: L'outil de recherche BLAST retourne séquences les protéines les plus semblables dans le Y. la base de données du génome lipolytica.
2. Construire les cassettes de délétion par PCR avec des amorces # 7 à # 56 (tableau 1), et effectuer une digestion de restriction de l' enzyme et les réactions de ligature en utilisant les mêmes méthodes que celles décrites à la section 1.1 ci - dessus.
3. Préparationsont des cellules compétentes de la souche knockout KU70, effectuer des transformations et d' effectuer une PCR pour identifier les colonies positives avec des amorces # 55, # 58 à # 81 (tableau 1) en suivant le protocole décrit dans la section 1.2 ci - dessus.
   Note: A titre d'exemple, la procédure de suppression du gène YALI0E17787g est décrite dans les figures 4 et 5. Les effets de 1 kb et 2 kb région homologue sur le taux de recombinaison homologue sont rapportés.

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Résultats

Y. linéarisé Vecteur d'expression lipolytica a été inséré dans la plate - forme d'arrimage pBR dans le génome de Y. lipolytica souche Po1g en effectuant une simple recombinaison de croisement ^27. En utilisant la procédure rapide de transformation chimique établie dans cette étude, le Y. linéarisé vecteur d'expression lipolytica a été transformé avec succès dans la souche Po1g de type sauvage à une effica...

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Discussion

Notre objectif pour cette étude est de permettre la génération rapide et efficace de KO de gènes ciblés dans le Y. lipolytica souche Po1g. Plusieurs considérations doivent être abordées pour atteindre cet objectif. Tout d'abord, une grande efficacité de transformation est nécessaire. Ainsi, un protocole de transformation chimique efficace et commode pour le Y. souche lipolytica Po1g a été décrite dans cette étude. L'utilisation de PEG-4000 est un facteur critique...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Oligonucleotide primers	Integrated DNA Technologies		25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g	Yeastern Biotech		leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1	Yeastern Biotech	FYY203-5MG	Y. lipolytica expression vector
E. coli TOP10	Invitrogen		For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector	Promega	A3600	TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	For plasmid isolation
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282	Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity DNA polymerase	Bio-Rad	172-5302	High-fidelity DNA polymerase
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriction enzyme
BglII	New England Biolabs	R0144L	Restriction enzyme
KpnI	New England Biolabs	R0142S	Restriction enzyme
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Restriction enzyme
NotI	New England Biolabs	R0189L	Restriction enzyme
PmlI	New England Biolabs	R0532S	Restriction enzyme
PstI	New England Biolabs	R0140S	Restriction enzyme
SacII	New England Biolabs	R0157S	Restriction enzyme
SalI	New England Biolabs	R0138S	Restriction enzyme
XhoI	New England Biolabs	R0146L	Restriction enzyme
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L
Taq DNA polymerase	Bio-Rad	M0267L
Ampicillin	Gibco-Life Technologies	11593-027	Antibiotics
Hygromycin B	PAA	P21-014	Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder	Thermo Scientific	SM0312	1 kb DNA ladder
PEG4000	Sigma	95904-F
Tris	Promega	H5135
EDTA	Bio-Rad	161-0729
Salmon Sperm DNA	Invitrogen	15-632-011
Lithium Acetate	Sigma
Acetic acid	Sigma
Glass beads (425-600 µm)	Sigma	G8772
RNAse A	Thermo Scientific	EN0531
DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611
Bacto Yeast Extract	BD	212750
Bacto Peptone	BD	211677
D-Glucose	1st Base	BIO-1101
YNB without amino acids	Sigma	Y0626
DO Supplement-Leu	Clontech	630414
Glycerol	Sigma	G5516
Difco LB Broth	BD	244620
Difco LB Agar	BD	244520
Bacto Agar	BD	214010
Equipment
PCR machine	Biorad	T100 Thermal Cycler
Water bath	Memmert	WNB 14
Stationary/Shaking Incubator	Yihder	LM-570RD
Thermo-shaker	Allsheng	MS-100
Micro centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer plus
Gel imager	GE	Amersham Imager 600