Genetic Engineering eines Unconventional Hefe für Erneuerbare Biokraftstoff- und Biochemie Produktion

Zusammenfassung

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

Zusammenfassung

Yarrowia lipolytica ist ein nicht-pathogen, dimorphic und streng aeroben Hefe - Arten. Aufgrund seiner besonderen physiologischen Eigenschaften und metabolischen Eigenschaften, diese unkonventionelle Hefe ist nicht nur ein gutes Modell für die Untersuchung der grundlegenden Natur der Pilz-Differenzierung, sondern auch eine vielversprechende mikrobielle Plattform für biochemische Produktion und verschiedene biotechnologische Anwendungen, die umfangreiche genetische Manipulationen erfordern. Allerdings genetische Manipulationen von Y. lipolytica sind begrenzt aufgrund des Fehlens einer effizienten und stabilen genetischen Transformationssystems sowie sehr hohe Raten von nicht-homologe Rekombination , die vor allem auf die KU70 - Gen zugeschrieben werden. Hier berichten wir über ein einfaches und schnelles Protokoll für die effiziente genetische Transformation und für die Gen - Deletion in Y. lipolytica Po1g. Zuerst wird ein Protokoll für die effiziente Transformation von exogener DNA in Y. lipolytica Po1g gegründet wurde. Second, die verbesserte Doppel-crossover homologe Rekombinationsrate für weitere Deletion von Zielgenen zu erreichen, wurde das KU70 - Gens durch Transformieren einer Unterbrechungskassette tragenden 1 kb Homologiearme gelöscht. Drittens die verstärkte Gen - Deletion Effizienz nach dem Löschen des KU70 - Gens zu zeigen, löschten wir einzeln 11 Zielgene kodieren , Alkoholdehydrogenase und Alkohol - Oxidase die gleichen Verfahren auf der KU70 - Knockout - Plattform Stamm verwenden. Es wurde beobachtet, dass die Rate der präzisen homologe Rekombination im wesentlichen von weniger als 0,5% für die Löschung erhöht des KU70 - Gens in Po1g auf 33% -71% für das einzelne Gen - Deletion der 11 Zielgene in Po1g KU70 Δ. Eine replikative Plasmid, das das Hygromycin B-Resistenzmarker und das Cre / loxP-Systems trug konstruiert, und das Selektionsmarker-Gen in der Hefe knockout Stämme wurde schließlich durch die Expression von Cre-Rekombinase entfernt, um mehrere Runden targe erleichternted genetische Manipulationen. Die sich daraus ergebenden Einzel Gen-Deletionsmutanten haben potentielle Anwendungen in der Biokraftstoff- und Biochemie Produktion.

Einleitung

Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, eine unkonventionelle Hefe kann in Form von Hefe oder Mycel in Reaktion auf Änderungen der Umgebungsbedingungen ^1,2 wachsen. Somit ist diese dimorphic Hefe kann für die Untersuchung der Pilzdifferenzierung, Morphogenese und Taxonomie ^3,4,5 als gutes Modell verwendet werden. Es wird allgemein als sicher (GRAS) Hefearten angesehen, die allgemein verwendet wird , eine Vielzahl von Lebensmittelzusatzstoffen, wie organische Säuren zu produzieren, Polyalkoholen, Aromastoffen, Emulgatoren und oberflächenaktive Mittel ^6,7,8,9. Es ist ein obligat aerob und eine bekannte ölige Hefe fähig ist natürlich Lipide bei hohen Mengen, dh bis zu 70% des Zelltrockengewicht ¹⁰ ansammeln. Es kann auch ein breites Spektrum von Kohlenstoffquellen für das Wachstum, einschließlich verschiedener Arten von Rückständen in Abfallressourcen als Nährstoffe ^11,12,13 nutzen. All diese einzigartigen Eigenschaften machen Y. lipolytica sehr attraktiv fürverschiedene biotechnologische Anwendungen.

Obwohl die gesamte Genomsequenz des Y. lipolytica hat ^14,15, genetische Manipulation dieser unkonventionellen Hefe veröffentlicht worden ist komplexer als andere Hefearten. Erstens Transformation dieser Hefearten ist viel weniger effizient aufgrund des Fehlens eines stabilen und effizienten genetischen Transformationssystem ^16,17. Zweitens mühselige genomische Integration von linearen Expressionskassetten für die Expression von Genen von Interesse allgemein verwendet , da kein natürlicher episomal Plasmid System in dieser Hefe ¹⁸ gefunden. Drittens Generation von genetischen Knock-Outs und Knock-Ins begrenzt, da das Gen Effizienz durch genaue homologe Rekombination in dieser Hefe - Targeting ist gering , und die meisten Integrationsereignisse auftreten , durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) ^19.

In dieser Studie berichten wir einen optimierten Transformationsprotokoll für die Y. lipolytica Po1g Stamm, der einfach, schnell, effizient und reproduzierbar ist. Um die Frequenz von präzisen homologe Rekombination steigern, wir löschte das KU70 - Gen, das ein Schlüsselenzym in dem NHEJ Stoffwechselweg kodiert. Durch die optimierte Transformationsprotokoll verwendet und eine lineare Knockout - Kassette transformiert enthält flankierenden Homologiebereiche von 1 kb, das KU70 Gen des Y. lipolytica Po1g wurde erfolgreich gelöscht. Die Robustheit dieser Gen - Deletion Methodik wurde dann durch gezielte Alkoholdehydrogenase und Alkohol - Oxidase - Gene in der Po1g KU70 Δ Stamm demonstriert. Es wurde beobachtet , dass die KU70 Deletionsstamms eine wesentlich höhere Effizienz der homologen Rekombination vermittelten Gen zeigten Targeting als die des Wildtyp - Po1g Stamm. Zusätzlich wurde eine replikative Cre Expressionsplasmid den Hygromycin B-Resistenzmarker trägt, konstruiert marker rescue auszuführen. Die Markerrettung erleichtert mehrere Runden von Gen in th Targetinge Gen-Deletionsmutanten erhalten. Neben Gen - Deletion, unser Protokoll für die genetische Transformation und Gen - Deletion hier beschrieben sind, können auf Gene auf bestimmte Loci einfügen angewendet werden, und die ortsspezifische Mutationen in den Y. einführen lipolytica - Genoms.

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Protokoll

1. Erzeugung des Y. lipolytica KU70 Deletionsstamms

1. Der Bau der Disruptionskassette
   Anmerkung: Siehe Tabelle 1 für alle Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR) Amplifikationen verwendet.
   1. Design Primer ²⁰ der PCR die LEU2 Expressionskassette amplifizieren (siehe Tabelle 1) von einer Y. lipolytica Expressionsvektor und LoxP - Stellen in den 5'- und 3' - Enden der LEU2 Kassette mit einem langen Vorwärtsprimer (# 1; Tabelle 1) einzuführen , und einem langen Rückwärtsprimer (# 2; Tabelle 1), respectively. Um eine zusätzliche Restriktionsstelle für nachfolgende Schritte des Klonprozess einzuführen, fügen Sie eine Einschränkung Bam HALLO Website in Primer # 1.
   2. Führen PCR unter Verwendung eines High-fidelity DNA - Polymerase , wie in Tabelle 2 aufgeführt.
   3. Reinige das PCR-Produkt LoxP--Promotor-LEU2-Terminator-loxP Kassette ein PCR-purificatio mitn-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Hinzufügen , 3'-A - Überhänge an den gereinigten PCR - Produkt gemäß den Anweisungen des Herstellers ^21. Verwendung von T4 - DNA - Ligase die A-tailed PCR - Produkt in einen TA - Klonierungsvektor abzubinden das Plasmid T-LEU2 gemäß Tabelle 3 zu ergeben.
   4. PCR das 1 kb 5' - stromaufwärts - Sequenz der Primer # 3 / # 4 von der Y. Verwendung KU70 Gen amplifizieren lipolytica Po1g genomische DNA ²² gemäß Tabelle 2. Man reinige das PCR - Produkt einer PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
      1. Doppel verdauen sowohl das gereinigte PCR - Produkt und T-LEU2 - Plasmid mit Sac II und Bam HALLO Enzyme gemäß Tabelle 4. Reinige den Verdauungsgemisch ein PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . Verwenden Sie T4 - DNA - Ligase das gereinigte und verdaute PCR - Produkt der Sac II / Bam HALLO - Stellen von T-LEU2 abzubinden die zu ergebenPlasmid T-LEU2-5E gemäß Tabelle 3.
   5. PCR das 1 kb 3 'Downstream - Sequenz der Primer # 5 / # 6 von der Y. Verwendung KU70 Gen amplifizieren lipolytica Po1g genomische DNA ²² gemäß Tabelle 2. Man reinige das PCR - Produkt einer PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Doppel verdauen sowohl das gereinigte PCR - Produkt und T-LEU2-5E Plasmid mit Not I und Nde I - Enzyme gemäß Tabelle 4.
      1. Man reinigt den Verdauungsmischung ein PCR-Reinigungs-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Dann abzubinden das gereinigte und verdaute PCR - Produkt der Not I / Nde I - Stellen von T-LEU2-5E 3 das Plasmid T-KO unter Verwendung von T4 - DNA - Ligase gemäß Tabelle zu erhalten.
   6. Digest das Plasmid T-KO mit Sac II und Nde I - Enzyme gemäß Tabelle 4 die Disruptionskassette zu erzeugen (Abbildung 1 ). Reinige die verdauten DNA-Fragmente unter Verwendung eines PCR-Reinigungs-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Kompetente Zellpräparation und Transformation von Y. lipolytica Po1g Stamm
   1. Kompetente Zellpräparation
      1. Impfen eine Kolonie von Y. lipolytica Po1g Stamm aus einem frischen Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YPD) Platte in 10 ml YPD - Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Dextrose und 50 mM Citrat - Puffer pH 4,0) in einem 100 ml Kolben. Inkubieren in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 UpM für 20 Stunden bis zur Sättigung (eine OD ₆₀₀ von etwa 15, unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen).
      2. Pelletieren Sie die Zellen durch 5 min bei 5000 xg bei Raumtemperatur zentrifugiert. Waschen der Zellen mit 20 ml Tris-EDTA (TE) -Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) und pelletieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.2.1.2 beschrieben. Resuspendieren der Zellen in 1 ml 0,1 M Lithiumacetat (pH 6,0, eingestellt mit Essigsäure) und Inkubation bei Raum tempe für 10 minrature.
      3. Aliquot der kompetenten Zellen (100 ul) in sterile 1,5 ml-Röhrchen. Fahren Sie mit den Transformationsschritte unten sofort, oder fügen Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 25% (v / v) und bei -80 ° C für die Langzeitlagerung.
   2. Transformation
      1. vorsichtig mischen 10 ul denaturiertes Lachssperma-DNA (10 mg / ml) und 1-5 ug der gereinigten Unterbrechungskassette zusammen mit 100 ul kompetenter Zellen und Inkubieren bei 30 ° C für 15 min.
      2. In 700 ul 40% Polyethylenglykol (PEG) -4000 (gelöst in 0,1 M Lithiumacetat pH 6,0), gut mischen und Inkubation in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 rpm für 60 min.
         Hinweis: Es ist wichtig, zu verwenden PEG mit einem mittleren Molekulargewicht von 4000, anstelle von PEG-3350 (typischerweise bei der Transformation von herkömmlichen Hefe verwendet).
      3. Hitzeschock Das Transformationsgemisch durch das Rohr in einem 39 ° C Wasserbad für 60 min platziert.
      4. 1 ml YPD-Medium undbei 30 ° C und 225 Upm für 2 Stunden erholen. Zentrifuge bei 9.000 × g für 1 min bei Raumtemperatur, entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 1 ml TE-Puffer.
      5. Repellet die Zellen durch Zentrifugation bei 9.000 × g für 1 min bei Raumtemperatur und der Überstand verworfen. Resuspendieren des Pellets in 100 ul Puffer TE und Platte auf selektiven Platten (zB Leucin-defizienten Platten), und Inkubation für 2-3 Tage bei 30 ° C.
      6. Pick 4 bis 10 Einzelkolonien und inokulieren getrennt in 2 ml YPD-Medium. Inkubieren über Nacht in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 Umdrehungen pro Minute. Identifizierung positiver Kolonien durch PCR - Analyse der genomischen DNA aus den Trans ²² gemäß Tabelle 5 unter Verwendung von zwei Sätzen von Primern # 55 / # 56 und # 56 / # 57, respectively.
         Hinweis: Die nicht linearisiert ich pYLEX1 Vektor in Y. umgewandelt wird lipolytica Po1g kompetente Zellen , um die Transformationseffizienz zu bestimmen , indem die Zahl Zählenkoloniebildenden Einheiten (cfu) pro & mgr; g Plasmid - DNA verwendet ^23.

2. Marker-Rettung

1. Der Bau des Cre-Expressionsplasmid
   1. Der Bau der pYLEX1-CRE und pYLEX1-HPH
      1. Design - Primer ²⁰ der PCR , die offene Leserahmen von cre und hph verstärken. Fügen Sie ein zusätzliches Adeninnukleotid vor den Start - Codons in den Forward - Primer # 82 und 84 #, und fügen Sie KpnI Restriktionsstellen stromabwärts der Stop - Codons in den Reverse - Primern # 83 und # 85 PCR die offene Leserahmen von cre verstärken und hph von pSH69 (Zugangsnummer HQ412578) ²⁴ gemäß Tabelle 2.
      2. Reinige sowohl cre und hph - Fragmente eine PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Digest sowohl die gereinigten cre und hph Fragmente mit KpnI wie pro Tabl Enzyme 4. Verdoppeln Sie die pYLEX1 Plasmid mit Pml I und Kpn I Enzyme verdauen gemäß Tabelle 4. Man reinigt den Verdauungsmischung ein PCR - Reinigungs - Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird .
      3. Verwenden Sie T4 - DNA - Ligase gemäß Tabelle 3 die gereinigten und verdaut cre und hph Fragmente PML I / KpnI - Stellen des Y. abzubinden lipolytica Expressionsvektor, wodurch man pYLEX1-CRE und pYLEX1-HPH sind.
   2. Der Bau der pSL16-CRE-HPH
      1. PCR amplifizieren den Promotor-Gen-Terminator - Kassette des cre von pYLEX1-CRE Primern 86 # / # 87 flankieren die Sal I / Pst I - Restriktionsstellen gemäß Tabelle 2. Das PCR - Produkt einer PCR Purification Kit Reinige Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers .
         1. Doppel verdauen sowohl das gereinigte PCR - Produkt und pSL16-CEN1-1 (227) Plasmid ²⁵ mit Sal I undPst I - Enzyme gemäß Tabelle 4. Man reinigt den Verdauungsmischung ein PCR - Reinigungs - Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . Dann ligieren das gereinigte und verdauten PCR - Produkts in pSL16-CEN1-1 (227) an den entsprechenden Stellen pSL16-CRE unter Verwendung von T4 DNA - Ligase gemäß Tabelle 3 zu schaffen.
      2. PCR amplifizieren den Promotor-Gen-Terminator - Kassette von hph von pYLEX1-HPH Primern # 88 / # 89 flankieren die Xho I / Bgl II - Restriktionsstellen gemäß Tabelle 2. Man reinige das PCR - Produkt einer PCR - Purification - Kit nach den Anweisungen des Herstellers .
         1. Doppel verdauen sowohl das gereinigte PCR - Produkt und pSL16-CRE Plasmids mit Xho I und Bgl II - Enzyme gemäß Tabelle 4. Reinige den Verdauungsgemisch ein PCR Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . Dann ligieren das gereinigte und verdauten PCR-Produkts in pSL16-CRE an dem entsprechendenWebsites pSL16-CRE-HPH unter Verwendung von T4 - DNA - Ligase gemäß Tabelle 3 zu erzeugen.
            Anmerkung: Die resultierende Cre Expressionsplasmids pSL16-CRE-HPH, einen selektierbaren Hygromycin B Marker trägt und eine Zentromer und episomal replizierender Vektor (Abbildung 2).
      3. Stellen Sie sicher , alle Konstrukte durch Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen (zB Sal I / Pst I, den Einsatz aus dem Vektor auszuschneiden) gemäß Tabelle 4.
2. Cre-Rekombinase-vermittelte Markerrettung
   1. Verwandeln pSL16-CRE-HPH in kompetente Zellen des KU70 - Knockout - Stamm nach dem Transformationsprotokoll in Punkt 1.2 beschriebenen. Platte transformierten Zellen auf YPD und Hygromycin B (YPDH) -Platten (enthaltend 400 ug / ml Hygromycin B), und Inkubieren bei 30 ° C für 2-3 Tage.
   2. Führen Kolonie - PCR gemäß Tabelle 5 unter Verwendung der Primer # 84 / # 85 zu identifizieren positiveKolonien pSL16-CRE-HPH-Plasmid nach der Transformation enthält.
      Anmerkung: Der Vorwärts - Primer # 84 und der Rückwärts - Primer # 85 sind innerhalb der kodierenden Region des hph - Gens befindet (Tabelle 1). Nur positive Klone, die ein spezifisches PCR-Produkt in der PCR-Reaktion zu erzeugen.
   3. Wählen Sie einen positiven Klon und impfen in 2 ml YPDH Medium und Inkubation in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 rpm über Nacht bis zur Sättigung. Messen Sie die Zelle OD ₆₀₀ mit einem Spektralphotometer. Ernte der Zellen bei einer OD ₆₀₀ von ~ 15. Zentrifuge bei 5.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur und wäscht einmal mit 2 ml sterilem Wasser.
   4. Re-inokulieren Zellen in 2 ml YPD - Medium mit einer anfänglichen OD ₆₀₀ von 0,1 und lassen die Zellen über Nacht in einem 30 ° C Schüttelinkubator bei 225 Upm wachsen. Streak die über Nacht Zellkultur auf YPD - Platten einzelne Kolonien ²³ zu isolieren. Replica Platte Kolonien auf YPD, YPDH und Leucin-defizienten Platten ²³ .
      Hinweis: Die Kolonien , die sowohl LEU2 - Marker und pSL16-CRE-HPH Plasmid , das nur auf YPD - Platten (Abbildung 3) verloren haben , wachsen können.

3. Löschen von Alkoholdehydrogenase und Alkohol-Oxidase-Gene

1. Führen Sie eine Suche auf dem Y. lipolytica Genomdatenbank des Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) mit Hilfe der Gen - Kandidaten für die ²⁶ Löschung zu identifizieren. Geben Sie die Proteinsequenz von S. cerevisiae Alkoholdehydrogenase I in BLAST - Suchwerkzeug (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa).
   Hinweis: Die BLAST - Suchwerkzeug die ähnlichsten Proteinsequenzen in der Y. zurück lipolytica Genomdatenbank.
2. Konstruiere die Löschkassetten durch PCR mit den Primern # 7 und # 56 (Tabelle 1), und führen Restriktionsenzym - Verdau und Ligationsreaktionen unter Verwendung der gleichen Verfahren wie oben in 1.1 beschrieben.
3. PrepNach dem Protokoll in Punkt 1.2 beschriebenen positiven Kolonien # 55, # 58 bis 81 # mit Primern zu identifizieren (Tabelle 1) sind kompetente Zellen des KU70 - Knockout - Stamm, Umwandlungen durchführen und PCR durchführen.
   Anmerkung: Als Beispiel wird das Verfahren für die YALI0E17787g Gendeletion ist in den 4 und 5 beschrieben. Die Wirkungen von 1 kb und 2 kb lange homologe Region auf homologe Rekombination Rate berichtet.

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Ergebnisse

Die linearisierte Y. lipolytica - Expressionsvektor wurde in das Genom von Y. in die pBR Andockplattform eingefügt lipolytica Po1g Stamm von ²⁷ eine einzige Crossover - Rekombination durchführen. Durch die schnelle chemische Transformationsverfahren unter Verwendung der in dieser Studie festgestellt, die linearisierte Y. lipolytica - Expressionsvektor wurde in den Wildtyp - Po1g Stamm bei einer Transformationseffizienz von> 100 KBE / ug...

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Diskussion

Unser Ziel für diese Studie ist eine schnelle und effiziente Erzeugung von gezielten Gen-Knockout in der Y zu ermöglichen lipolytica Po1g Stamm. Mehrere Überlegungen müssen angegangen werden , um dies zu erreichen. Zunächst wird eine hohe Transformationseffizienz erforderlich. Somit ist eine effiziente und bequeme chemischen Transformationsprotokoll für die Y. lipolytica Po1g Stamm wurde in dieser Studie beschrieben. Die Verwendung von PEG-4000 ist ein kritischer Faktor für die...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Oligonucleotide primers	Integrated DNA Technologies		25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g	Yeastern Biotech		leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1	Yeastern Biotech	FYY203-5MG	Y. lipolytica expression vector
E. coli TOP10	Invitrogen		For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector	Promega	A3600	TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	For plasmid isolation
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282	Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity DNA polymerase	Bio-Rad	172-5302	High-fidelity DNA polymerase
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriction enzyme
BglII	New England Biolabs	R0144L	Restriction enzyme
KpnI	New England Biolabs	R0142S	Restriction enzyme
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Restriction enzyme
NotI	New England Biolabs	R0189L	Restriction enzyme
PmlI	New England Biolabs	R0532S	Restriction enzyme
PstI	New England Biolabs	R0140S	Restriction enzyme
SacII	New England Biolabs	R0157S	Restriction enzyme
SalI	New England Biolabs	R0138S	Restriction enzyme
XhoI	New England Biolabs	R0146L	Restriction enzyme
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L
Taq DNA polymerase	Bio-Rad	M0267L
Ampicillin	Gibco-Life Technologies	11593-027	Antibiotics
Hygromycin B	PAA	P21-014	Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder	Thermo Scientific	SM0312	1 kb DNA ladder
PEG4000	Sigma	95904-F
Tris	Promega	H5135
EDTA	Bio-Rad	161-0729
Salmon Sperm DNA	Invitrogen	15-632-011
Lithium Acetate	Sigma
Acetic acid	Sigma
Glass beads (425-600 µm)	Sigma	G8772
RNAse A	Thermo Scientific	EN0531
DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611
Bacto Yeast Extract	BD	212750
Bacto Peptone	BD	211677
D-Glucose	1st Base	BIO-1101
YNB without amino acids	Sigma	Y0626
DO Supplement-Leu	Clontech	630414
Glycerol	Sigma	G5516
Difco LB Broth	BD	244620
Difco LB Agar	BD	244520
Bacto Agar	BD	214010
Equipment
PCR machine	Biorad	T100 Thermal Cycler
Water bath	Memmert	WNB 14
Stationary/Shaking Incubator	Yihder	LM-570RD
Thermo-shaker	Allsheng	MS-100
Micro centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer plus
Gel imager	GE	Amersham Imager 600