Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Özet

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Özet

Click kimyaları ilaç dağıtım, doku mühendisliği ve hücre kültürü de dahil olmak üzere çok sayıda biyomateryaller uygulamalarda kullanılmak üzere incelenmiştir. Bu Fotokimyasal tiol-en ve tiol-in reaksiyonlar gibi, özellikle, ışık kaynaklı Click reaksiyonları üzere, malzeme özellikleri üzerinde uzaysal kontrol verecek ve kullanıcı yönelik tesis kontrol yüksek derecede sistemlerin tasarlanmasına izin verilmesi. İmalat ve ışık ve bu tiol-X PhotoClick kimyaları sunduğu çok yönlülük sağladığı hassas kullanılarak hidrojel bazlı biyo materyallerin modifikasyonu, özellikle, iyi tanımlanmış, biomimetik mikroçevrelerde içindeki hücrelerin kültürü için, artan bir öneme sahiptir. Burada, hücreler ve bir tiol-en PhotoClick reaksiyona sokularak polimerize çok yönlü ve modüler yapı blokları kullanılarak hidrojel matrisinin içinde biyokimyasal işaretlerin daha sonra photopatterning arasında photoencapsulation için yöntemler tarif eder. Spesifik olarak, bir yaklaşım co sunulmuşturalliloksikarbonil gelen nstructing hidrojeller (Alloc) işlevselleştirilmiş peptid çapraz bağlar ve asma peptit parçaları ve hızlı bir lityum acylphosphinate foto ortaya koyucu ve uzun dalga boyu ultraviyole (UV) ışık cytocompatible dozlarının varlığında polimerize tiol işlevselleştirilmiş poli (etilen glikol) (PEG) içerebilir. Facile teknikler photopatterning görselleştirmek ve tarif edilmiştir ilave peptid konsantrasyonunu ölçmek için. Ayrıca, yöntemler, kapsülleme hücreleri için özel olarak insan mezenkimal kök hücreleri kurulmuş ve bunların canlılığı ve aktivitesinin belirlenmesinde vardır. Oluşumu ve tiol Alloc hidrojellerin başlangıç desen burada gösterilir birlikte, bu teknikler geniş bir şekilde paternli bir alt-tabakaların üretilmesi için diğer ışık ve radikal başlatılan madde sistemleri (örneğin, tiol-norbornen, tiol-akrilat), bir dizi tatbik edilebilir.

Giriş

Click kimyası giderek artan bir şekilde, seçici, etkili ve genellikle cytocompatible reaktiviteleri nedeniyle, ilaç verme, doku mühendisliği ve kontrollü hücre kültürü dahil çeşitli biyomedikal uygulamalar için malzeme tasarımında kullanılır. Tetiklemek için ışık kullanan ^1-3 PhotoClick kimyaları ya tepkimelerini başlatmaya (örneğin, azid-alkin, ⁴ tiol-en, ⁵ ve tetrazol-alken ⁶⁾ biyomalzeme oluşumu ya da değiştirilmesi için özel bir öneme sahiptir. Işıkla meydana hücrelerin varlığında biyomalzeme özelliklerinin kullanım yönelik denetimi için çok uygundur. Özellikle ^7,8 Bu reaksiyonlar yapmak yumuşak koşullar ne zaman ve kontrolü altında hızlı oranları, tiol-en PhotoClick kimyaları kullanılmıştır Resim sağlam mekanik özelliklere ^5,9 ve de dahil olmak üzere, ancak hücre tipleri, çeşitli kapsüllenmesi için hidrojel bazlı biyo-malzemeler üretmek içinAyrıca, bu kimyaları temel özelliklerini taklit eden biyokimyasal işaretlerin uzamsal desen kullanılmaktadır T hücre kültürü ve teslimi için söz ile, insan mezenkimal kök hücreler (hMSCs), fibroblastlar, kondrositler, ve pankreatik hücre ile sınırlıdır. ^10,11 ana hücre microenvironments ve yapışma, farklılaşması ve invazyon dahil olmak üzere uygun hücre-matris etkileşimlerini kolaylaştırmak. ^3,12

Yaygın cytocompatible sırasında hızlı, foto-tetiklenerek polimerizasyonu için akrilatlar ya da norbornenler ( 'en') ile fonksiyonelleştirilmiş polimerler ile reaksiyona sokulur. Işıkla tiol-en hidrojeller, sistein (tiyol) ihtiva eden peptidler oluşturulması için ^13, bu araç kutusunu genişletilmesi, biz sağlamayı amaçlayan minimal sentetik işlenmesini gerekli veya sentetik hücre dışı matrisler olarak geniş kullanıma yönelik piyasada mevcut olan yeni, çok yönlü ve erişilebilir yapı taşları ile hidrojel oluşumu için yöntemler.[Bozunmayan ya da hücre-bozunabilir çapraz bağlar için K (hücre yapışmasını [K (Alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] ya da iki teşvik etmek kolye bir integrin bağlayıcı gruplar: 14 Spesifik olarak, peptidler (Alloc) alliloksikarbonil modifiye edilmiştir lysines -korumalı Alloc) RGKGRKGK (Alloc) G ya da KK (Alloc) GGPQGIWGQGK (Alloc) K = Pep2Alloc sırasıyla]. Bu dizilerin ile koşulları dört kollu tiol ile modifiye edilmiş poli (etilen glikol) (PEG4SH) uzun dalga boylu UV ışığı (365 nm 'de 10 mW / ^cm2) ve cytocompatible dozları kullanılarak hızlı bir reaksiyon (1-5 dakika) için kurulan Foto-başlatıcı, lityum fenil-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). Elde edilen hidrojeller hafta içinde hücre kültürü koşulları altında kararlı idi. Hücre odaklı bozulması ve biçimlenme etkinleştirmek için, bir enzimatik-bölünebilir peptid jel çapraz bağları (yani, GPQGIWGQ), ¹⁵ ve model birincil hücrenin, insan mezenkimal kök hücrelerin (hMSCs) içinde kurulmuş, Durin kapsülleme ve sonra yüksek canlı kaldıBu matrisler içinde g kültürü. Dahası, peptidler mekansal bu malzemelerin içinde desenli edilmiş ve hMSCs yaşayabilir ve photopatterning koşulları altında metabolik olarak aktif kalır. Alternatif kolye peptid dizileri, burada gösterilmemiş olan (örneğin, IKVAV, YIGSR, GFOGER, vs.), ayrıca çevresindeki mikro ek hücre etkileşimleri incelemek için matrisler içine dahil edilebilir. Bu sonuçlar, bir çok hücre tipinde çeşitli çalışma üç boyutlu (3D), hücre kültürü ve teslim edilmesi için bu hidrojel bazlı malzeme uygulama ve doğrudan hücre-matris etkileşimleri için umut vericidir.

Burada yöntemler hücreleri photoencapsulate ve önerilen hidrojel sistemi içinde sonradan photopattern biyokimyasal ipuçları (Şekil 1) sunulmuştur. Gözlemlemek ve aynı zamanda bu photopatterns ölçmek için Teknikleri gösterilmiştir: özellikle, i) Ellman testinin nicel ve nitel kullanım modifikasyona belirlemek içindesenli yüzeyler ve floresan peptidler (AF488Pep1Alloc) ii) tamamlayıcı nitel kullanım içinde serbest tiyol tion üç boyutlu bu desenleri gözlemlemek. Bundan başka, deneyler, canlılığı (ölü / canlı canlılığı / sitotoksisite boyama) ve metabolik aktivitesini belirlemek için (MTS, 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-karboksimetoksifenil) -2- (4-sülfofenil) kullanıcılar hidrojel matris içinde farklı hücre hatları için photoencapsulation ve photopatterning koşullarının hücre proliferasyonu belirlemek, böylece -2H-tetrazolyum) sunulmaktadır. Protokol, basit bir ışık tabanlı PhotoClick hidrojel sistemi için gösterilmiştir birlikte, teknik hücrelerin varlığında photoencapsulation ve photopatterning için çok sayıda başka radikal olarak başlatılan hidrojel sistemlere uygulanabilir.

Protokol

Hidrojel Formasyonu için Materyallerin hazırlanması 1.

1. Standart katı faz peptid sentezi (SPPS) son grup modifikasyonu (PEG4SH) için üç aşamalı bir prosedürle teknikleri ve tiol-işlevselleştirilmiş bir polimer ile askının (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) ve çapraz bağlama peptidleri (Pep2Alloc) sentezler. ^14,16 Alternatif olarak, PEG4SH satın (M ticari olarak _n ~ 20 kDa), Pep1Alloc ve Pep2Alloc.
2. Davlumbaz (1.2.1-1.2.11) sentez adımları uygulayın. ^14,17 aşağıda açıklanan iki aşamalı reaksiyon ile foto başlatıcı (LAP) sentez ve kimyasal maddeleri kullanırken dikkatli kullanın (koruyucu eldiven, giysi ve gözlük takın) . LAP ticari olarak satın alınabilir.
   1. fırınında bütün cam malzeme (> 2 saat, 80 ° C).
   2. bir septum ile boş bir tek boyunlu yuvarlak dipli bir şişeye (100 mi) ve kapak, bir karıştırma çubuğu ilave edin.
   3. bir halka standı ve kelepçe ile bir manyetik karıştırma sıcak plaka üstünde balon sabitleyin.
   4. benseptum bir iğne (18 g) nsert hava alan dış ucunu bırakın. bir atıl gaz hattına bağlı olan ikinci iğne yerleştirin. Atıl gaz hattı (örneğin, argon veya azot) açıp 10-15 dakika boyunca balon temizleyin.
      NOT: Sistem sürekli reaksiyon boyunca inert gaz, argon ya da nitrojen ile temizlendi.
   5. iğnesi olan bir şırınga kullanılarak bir şişeye aktarın 1,5 g (~ 1.4 mi) dimetil phenylphosphonite (DİKKAT), septum ile delmek. heyecan plaka (orta hız) açın ve içeriği şişenin tarafı üzerine sıçrama yok dikkatli olun.
   6. septumu delmek için bir iğne ile bir şırınga kullanılarak, şişeye ihtiva dimetil phenylphosphonite 1.6 g (~ 1.46 mi) 2,4,6-trimetilbenzoil klorid (DİKKAT) damla damla ekleyin.
   7. ışıktan korumak ve argon ya da azot altında 18 saat süre ile karıştırılmaya folyo ile reaksiyon bölmesi kapatılır.
   8. Sonraki gün, bir şişenin yüksekliğini artırmak karıştırıcı üzerinde, bir yağ banyosu yerdikkatli bir şekilde yağ banyosu içine balon alt nd. Manyetik bir karıştırma muhafaza ederken 50 ° C'ye kadar bir banyo ve şişeyi ısıtın.
   9. 2-butanon, 50 ml 3.05 g lityum bromür çözülür. Yağ banyosunun üzerinden balon kaldırın ve kısa bir süre bir şişeye dökün septum kaldırarak, yuvarlak dipli bir şişeye, lityum bromür çözeltisi ilave edilir.
      1. : (Septum de argon hatları ve delik bir iğne giden bir iğne olacaktır DİKKAT) tekrar ısıtılmış yağ banyosu içine balon alt ve reaksiyon, 10 dakika boyunca ilerlemesine izin septum ile tekrar şişeyi sıkıca kapatın. Katı bir çökelti oluşturacak.
   10. 10 dakika sonra, argon kapatmak ısı şişeyi kaldırmak ve karışım ışığa duyarlı başlatıcı üretilmiştir olarak ışıktan korumak için folyo ile kaplı 4 saat (dinlenmeye bırakın. Havalandırma iğne yeri tutun.
   11. Bir cam frit hunisi içine ürünün dökülmesi veya uygun bir filtre kağıdı ile kaplı huni. R 2-bütanon 50 ml Durulama süzülen madde 3 defareaksiyona girmemiş lityum bromür silinmesi.
   12. Kuru (birinci sıra üzerine ve daha sonra vakum desikatörde) ve D ₂ O ¹ NMR ile ürünün analizinin yapılması 1.8-1.9 civarındadır (6H, s), 2.1-2.2 (3H, s), 6.7-6.8 (2H, s), 7.3-7.4 (2H, m), 7.4-7.5 (1 H, m), ve 7.5 karakteristik tepelere -7.7 (2H, m). ^14,17
3. Hidrojeller (Tablo 1) yapmak için hazır olmalıdır, her stok solüsyonu (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, LAP) hacim ve konsantrasyonunu hesaplamak için bir tablo kullanın. Tüm reaktif gruplar polimerizasyon sırasında tüketilen böylece olmayan desenli jelinin imal edilmesi için, bu [SH] = [alloc] sağlar. Jellerin photopatterning planlanıyorsa, Pep1Alloc daha sonra reaksiyon için stokiyometri göre jel oluşumu sırasında tiol fonksiyonel grupların aşırı miktarda (örneğin, 0.2-5 mM [SH]> [Alloc]) içerir.
   Not: jeller (5 dakika içinde) hızlı bir polimerizasyonun sağlanması için PEG4SH (% ağırlık) daha fazla ağırlıkça yüzde 5 içermelidir. Bununla birlikte, düşük ağırlık olarak% aralığıUygulama alt modüllerine (örn <0,5 kPa) ile hidrojellerin için ararsa s keşfedilmeyi olabilir; Polimerizasyon kontrol edildi ve bu düşük ağırlık olarak% bileşimler buna göre ayarlanmalıdır. Benzer şekilde, Pep1Alloc konsantrasyonu tiol işlevselleştirilmiş peptitler için literatürde rapor edildiği gibi farklı uygulamalar (örneğin, 0.2-5 mm) ayarlanabilir. ^18-21 LAP konsantrasyonu 0.067 ağırlıkça% (2.2 mm) veya daha az, tarif edildiği gibi, etrafında önerilmektedir yüksek konsantrasyonlarda hücre canlılığı azaltabilir.
4. Tablo 1'de hesaplamalara dayalı hücre kültürü için steril koşullar altında Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH ve LAP stok çözümleri hazırlayın.
   1. Pep1Alloc ve Pep2Alloc için, tek tek peptid sentezi ile ilgili Pep1Alloc ve Pep2Alloc toplam kütlesi ağırlığı ve% 1 penisilin / streptomisin (PS) ve 0.5 ug / ml fungizon (FZ) ihtiva eden steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde eritin. Hazırlanan stok solüsyonları aralık tipik konsantrasyonlarıpeptid 20-100 mg / ml arasında. Kullanılıncaya kadar -20 ° C'de yumuşak doku uygulamaları için ilgili nihai modüllerden (Young modülü ~ 0.5-5 kPa) ile jeller. ^22,23 kısım ve mağaza elde etmek için bu stokları karıştırın.
   2. PEG4SH, steril mikrosantrifüj tüpüne PEG4SH tartın ve PBS + PS + FZ içinde çözülür. 250-430 mg / ml arasında, bu stok çözeltisi aralığı tipik konsantrasyonları (ağırlık olarak% 20-30 PEG4SH).
   3. LAP, steril mikrosantrifüj tüpüne LAP ağırlığında ve 7.5 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar PBS + PS + FZ içinde çözülür.
      NOT: PEG4SH ve LAP taze çözümler hazırlanması tutarlı polimerizasyon süreleri sağlamak için her türlü kapsülleme veya jel deney için tavsiye edilir.
5. Hidrojeller Şekillendirme Steril Şırınga İpucu Kalıpları hazırlayın.
   1. Dikkatlice jilet kullanarak 1 ml şırınga kapalı ipuçları kesti ve daha sonra şırınga milleri pistonları çıkarın.
   2. 15 dakika An% 70 etanol içinde şırınga milleri ve pistonları BatmakSteril hücre kültürü kaputu d yer (30 dk) kuru. etanol aşırı damla şırınga şaft içinde kalırsa, onları dışarı itmek için dalgıç kullanmak.
6. Steril Cam hidrojel oluşturmaya Kalıpları Slide hazırlayın.
   1. Cam slaytlar (2 katları) ve kauçuk conta emmek (0.254 mm kalınlığında, şimler olarak kullanılan 2 küçük parçalara disklerle birlikte bir dikdörtgen dışarı yumrukladı veya kare kare şekli)% 70 etanol 15 dakika ve steril hücre kültürü kaputu yer kurutmak.
   2. Üreticinin talimatına göre, anti-yapışkan bir kaplama ile sterilize slaytlar Coat yarısı slayt yüzeyi (4 slaytlar varsa, örneğin, 2 kaydırak, anti-yapışkan ile kaplı olacak) için jel üstünde yapışmasını önlemek için. Bu cam slayt kalıbın üst olarak görev yapacak.
7. şırınga veya cam slayt kalıpları için lambayı kalibre edin.
   NOT: Bu deneyler için, harici bir filtre adaptörü montaj ve 365 nm dış filtre ile cıva ark lambası kullanıldı. diğer lambadiğerleri tarafından rapor edilen uzun dalga boyu UV ışığının uygun yoğunluklarda üreten s kullanılabilmektedir. ^24-27
   1. tüm örnekleri arasında nispeten eşit ışık yoğunluğunu sağlamak için sıvı dolu ışık kılavuzun sonuna kadar bir kolimatör lensi takın. Gerektiğinde, ilgi konusu örnekleri kapsayacak bir leke boyutuna ulaşmak için örnek (ler) den, ışık kılavuzunun mesafeyi ayarlamak.
   2. Bir mikrosantrifüj tüp tutucu bir kesim şırınga kalıp yerleştirin (dikey konumda şırınga kalıp tutmak için). Numuneler yapılacak şırınga ucu hizasında radiometer tutun ve 365 nm'de 10 mW / ^cm2 ışık yoğunluğunu elde etmek için çekim (% açık) ayarlayın. daha sonra kullanmak için ayarlanmış ayarları kaydedin.
   3. Steril bir yüzeyin üst kısmına cam slayt kalıp yerleştirin (örneğin, bir biyogüvenlik kabini içinde bir pipet kutusunun üst). Cam slayt kalıp yükseklikte radiometer dedektörü tutun ve 10 m ışık yoğunluğu elde etmek için çekim (% açık) ayarlamak365 nm 'de W / ^cm2. daha sonra kullanmak için ayarlanmış ayarları kaydedin.

2. Hidrojel Oluşumu ve photopatterning

1. Sigara desenli hidrojellerinin hazırlanışı.
   Not: hidrojeller hücre kültürü uygulamalarında kullanılacak ise protokol Bu noktada, takip eden tüm adımlar steril kabin veya kaputu steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
   1. Tablo hesaplama (Tablo 1 örneğe bakın) göre PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP ve PBS + PS + FZ stok çözümleri karıştırın. çözeltinin karıştırılması garanti edilmesi için kuvvetli bir şekilde elde edilen jel ön-madde çözeltisi Pipet.
   2. steril, kesme şırınga ucuna jel habercisi çözeltisi (PEG / Pep / LAP / PBS) 10-20 ul pipetleme şırınga uçları kalıp kalın hidrojeller hazırlayın. şırınga başına tek bir jel yapmak, yaklaşık 0.5-1.5 mm kalınlığında hacmi ve şırınga çapına göre.
      NOT: Büyük hacimler keşfedilmeyi dayalı olabilirüst sınır boyunca Pep1Alloc için difüzyon sınırlamaları dayanarak var olabilir istenen jel boyutu photopatterning ve / veya besin / kapsüllü hücrelerden / 'e atıklar hücre kültürü sırasında.
   3. olmayan kaplanmış cam slayt kenarlarında lastik conta (0.254 mm kalınlığında) koyarak cam slayt kalıplarda ince hidrojeller hazırlayın. Pipet 5-10 ul jel öncü çözeltisi olmayan kaplanmış cam slayt üzerine (tek ya da birden çok, 5-10 ul jeller, tek bir slayt üzerine çözeltinin bir ya da daha fazla nokta pipetleme ile yapılabilir) ve anti-yapışkan ile kaplanmış cam slayt yer jel çözeltisi üzerine (daha büyük jeller, cam slayt boyutuna kadar, nihai uygulamaya bağlı olarak yapılabilir). stabilize etmek için küçük bağlayıcı klipleri ile cam slaytlar sabitleyin.
   4. Lamba altında yer kalıpları ve lamba yoğunluğu ayarlayın (örneğin,% obtüratör açık) adım 1.7.2 yılında ölçümlere dayalı şırınga ucu kalıp veya cam slayt kalıplar için jel yüzeyinde 10 mW / cm ² ulaşmak vesırasıyla, 1.7.3.
   5. Jellerin Tam polimerizasyonu sağlamak için 1 ila 5 dakika boyunca ışık uygulanır. içerisinde modülleri ile tamamen polimerize hidrojeller oluşturmak için daha düşük PEG4SH içeriğine (5-8 ağırlıkça% 3-5 dakika) jeller yüksek PEG4SH içeriğine (8 ağırlık% ya da daha fazla, 1 dakika) ve daha uzun olan jeller için daha kısa bir polimerizasyon süresi kullanın yumuşak dokuların aralığı (0.5-5 kPa).
   6. steril kap içine steril bir işlenmemiş 48 oyuklu plaka içine şırınga ucu kalıplardan yer jeller ve yer cam slaytlar.
   7. Hücre kültürü ortamı veya uygun tampon ile 3 x 15 dakika durulayın (örneğin, PBS + PS + FZ, Ellman reaksiyon tamponu), aşağıda ayrıntılı olarak planlanan deneyler dayalı.
2. Desenli Hidrojeller hazırlanması.
   1. Pep1Alloc daha sonra reaksiyon için serbest tioller (0,2-5 mM) bırakarak, tablo hesaplamaya göre PEG4SH, Pep2Alloc, LAP ve PBS + PS + FZ stok çözümleri karıştırın. çözeltinin karıştırılması garanti edilmesi için kuvvetli bir şekilde ön-madde çözeltisi Pipet.
   2. 2.1.6 adımları 2.1.2 ortaya koydu gibi kalın ve ince hidrojeller hazırlayın.
      NOT: Önceki photopatterning büyüme ortamında jeller koymayın. Free tiyoller büyüme ortamında türleri tarafından tüketilebilir (örneğin, disülfid tiol içeren proteinler ile formasyonu) ve ek işlem adımları olmadan jel model oluşturmanın izin vermez (örneğin, disülfid bağlarının indirgenmesi).
   3. Pep1Alloc çözeltilerini hazırlamak (nihai konsantrasyon ~ 3-20 mg / ml) ve 2.2 mM LAP.
   4. Pep1Alloc / tur çözeltisi ile önceden oluşturulmuş jeller Kapak ve 37 ° C de 1 saat süreyle inkübe edin.
   5. Aşırı Pep1Alloc / LAP çözüm çıkarın. jeller şırınga ucu kalıplanmıştır için, dikkatli bir desen için steril cam slayt enkübe edildiği 48 oyuklu plaka jeller aktarmak için bir ıspatula ile yapılır.
   6. syringe- ve cam slayt kalıplanmış jellerin üzerine doğrudan istenen deseni ile bir fotomaske yerleştirin. Maskenin baskılı bölümü optimum Patt için jel dokunur emin olunern sadakat (yani maske doğru okudunuz ve aşağı emülsiyon tarafı olmalıdır). lamba altında yer örnekleri ve cam slaytlar (adım 1.7.3) için kullanılan lamba ayarları ile 1 dakika boyunca ışın tedavisi.
   7. desenlendirme sonra yer steril, 48-kuyu olmayan doku kültürü tedavi plaka içine jeller şırınga kalıplı ve yer cam steril tabak içine cam slaytlar yapışık jelleri slayt-kalıplı.
   8. Hücre kültürü ortamı veya uygun tampon ile 3 x 15 dakika durulayın (örneğin, PBS + PS + FZ, Ellman reaksiyon tamponu) planlı deneylere dayalı.

3. görselleştirme ve photopatterning Niceleme

1. Ellman Testi Photopatterned Hidrojeller olarak miktarlarının Ücretsiz tiyoller Algılama ve.
   1. Ellman reaksiyon tamponu, sistein çalışma çözeltisi, standartlara ve aşağıda tarif edildiği gibi Ellman reaktifi hazırlayın.
      1. Ellman Reaksiyon Tamponu için 2.4 gr sodyum fosfat dibazik (Na ₂ HPO çözülür4) ve 74.4 ila 200 mg mi dihidroksi _H2O (0.1 M Na ₂ HPO _4, 1 mM EDTA) içinde etilendiamintetraasetik asit (EDTA). Sodyum hidroksit (NaOH) ya da fosforik asit ₍₃ konumundaki H atomu PO ₄₎ solüsyonları ile 7.5-8 pH ayarlayın.
      2. Sistein Çalışma Çözüm için 15 ml reaksiyon tamponu (2 mM sistein) içinde 5.27 mg sistein çözülür.
      3. Sistein standartları, 2, 1.5, 1.25, 1, 0.75, 0.5, 0.25, 0 mM sistein bir son konsantrasyona kadar, reaksiyon tampon maddesi içinde sistein çalışma çözeltisi seyreltilir.
      4. Ellman maddesi için, 1 ml reaksiyon tamponu içinde 4 mg, Ellman maddesi çözülür. Sonikasyon tamamen Ellman reaktifi çözmek için.
   2. Ellman tahlili (Şekil 2) ile jeller serbest tiol konsantrasyonunu ölçmek.
      NOT: 'Zayıf' 5 ul hidrojeller, cam slaytlar arasında kalıp, aşağıdaki prosedüre açıklanan ve Ellman ayıracı t hızlı yayılmasına imkan tavsiye edilmektedirjel hrough (yani, ayıraç kalın jelleri boyunca yayılabilmesi uzun bir zaman alır).
      1. Şişme oranının hacimsel dayalı 'ince' 5 ul jeller (V _S) şişmiş jel hacmi belirlemek, Q.
         1. şırınga kalıpları kullanarak üç 20 ul 'kalın' jeller olun. Ellman reaksiyon tamponu Place jeller 24 saat ve daha sonra (denge şişmiş kitle, M _S) tartın. Jeller liyofilize ve daha sonra (kuru kitle, M _D) tartın.
         2. Q oranı ²⁸ şişme hacimsel hesaplamak kalın jeller için ölçülen kütlelerle = 1 + ρ _polimer / ρ _{bir çözücü} (M _S / M _D-1) ρ _polimeri = 1.07 g / ^cm3 PEG için, ²⁹ ρ _çözücü = 1.0 g / ^cm3 PBS / _H2O için
         3. jel teorik kuru kütle Ellman Testi (burada kullanılmak üzere hesaplamak, 5 ul 'ince' jeller u tipik olarakSED), ayrı ayrı bileşenlerin kitleleri PEG4SH, Pep1Alloc ve Pep2Alloc (M _D = M _PEG4SH + M _Pep1Alloc + M _Pep2Alloc) toplanmasıyla. M _PEG4SH hesaplanmıştır Örneğin, ağırlık olarak% 10 PEG4SH ihtiva eden bir 5 ul jel, yaklaşık 0.000535 g PEG içeren = 0.005 ^cm3 x 1.07 g / cm ³ x 0.10. Pep1Alloc ve Pep2Alloc kütleleri, bu sulu çözeltiler için ρ ≈ 1.0 g / ^cm3 olduğu kabul edilerek çözelti içinde ağırlıkça% göre benzer bir şekilde (değerler çizelgede bakınız) hesaplanabilir.
            NOT: Jeller da kurutulmuş ve yerine teorik kuru kütleye hesaplama tartılır olabilir. Ancak, sürekli ince, 5 ul jellerin kuru kütlesini ölçmek için zor olabilir.
         4. Tahmin edilen kuru kütle ve 'kalın' jeller, (adım 3.1.2.1.1 denklem) 'ince' jel için öngörülen şişmiş kitle M _S hesaplamak belirlenen Q değeri temelinde. Bu ρ ≈ 1.0 g / cm 'varsayalım ^{3, M _S ≈ V _S. Kantitatif Ellman deneyi gerçekleştirmek için bu hesaplanmış V _S kullanın.
            Not: Yukarıdaki yöntem, özellikler ince 5 ul jeller gibi şişmiş jel V _s belirlemek için tavsiye edilir tartmak için transferi güçtür.}
      2. Bölüm 2.2 (5 ul hacim) de tarif edildiği gibi desen için ince hidrojeller oluştururlar. Spesifik olarak, fazla serbest tiyollerle jeller ve ışık tüm jel ortaya sel açık bir lamel ile Pep1Alloc bu örneklerin "desen" yarısı olmak (örneğin, fazla tiol ile toplam 6 jeller: 3 modifiye edilmemiş olmayan'patterned 've 3' ) 'desenli.
         NOT: Bu tahlil için, jeller bir photomask olmadan ışığa maruz sel olan 'desenli'. Bu yöntem, tüm jel örnek tüketilen serbest tiol sayısı tespit etmek ve peptit ile modifiye edilebilir ne kadar etkin serbest tioller göstermek için kullanılır. Bu bilgilerden,bir fotomaske ile desenlendirme sırasında tüketilen serbest tiol sayısı jel kalınlığı ve kalıp alanına (ışığa maruz bölgeler) göre tahmin edilebilir.
      3. Talep 'desenli' ve 48-çukurlu bir levhanın kuyularında 'jeller olmayan'patterned ve ortaya şişen jel ve denge üzerinden, reaksiyona girmemiş türlerin difüzyonunu izin vermek için Ellman reaksiyon tamponu ile 3 x 15 dakika durulayın.
      4. V _s reaksiyonu ile tampon 20 ul çoklu böylece durulanır jeller için ekstra Ellman reaksiyon tamponu ekleyin. Örneğin tahmin V _S 15 ul ise, 5 ul reaksiyon tamponu (20 ul) ekleyin ve tahmin edilen V _S 30 ul ise, 10 ul reaksiyon tamponu (40 ul) ilave edilir.
      5. Bir önceki adımda (yani, önceki basamakta _Vs olsaydı + ekstra Reaksiyon B'de kullanılan hacmine bağlı olarak 20 ul adedi, 96 oyuklu plakanın bireysel çukurlar halinde sistein standartları (içermeyen jeller) PipetUffer = 40 ul), ayrı ayrı boş kuyulara her standardın 40 ul ekleyin.
      6. Reaksiyon tampon maddesi (: örneğin, 20 ul ya da kademesi 3.1.2.5 40 uL, 367.2 uL, 183.6, 180 ul reaksiyon tamponu + 3.6 ul Ellman reaktifi birçok) 'de, Ellman maddesi ile seyreltilir.
      7. standartları ve numuneleri içeren çukurlara seyreltilmiş Ellman maddesi ekleyin. 20 ul numuneler için, her bir göze 183.6 ul çözelti ilave edin. (Buna göre örnek boyutuna göre veya ölçek) 40 ul numuneler için seyreltilmiş Ellman reaktifi çift Bu miktar.
      8. (TNB inkübe ya 1 saat ve (oda sıcaklığında) 30 dakika boyunca bir karıştırıcıda yer veya çözelti renk, görsel muayene ile jellerin rengi aynı oluncaya kadar san 2-nitro-5-tiobenzoat dianyonun yeterli yayılmasını sağlamak için jelden serbest tiyollerle Ellman maddesi reaksiyonu yoluyla elde edilen ^2-).
      9. örneklerde ve S'den çözeltisi 100 ul alırtandards ve 96 gözlü bir levhanın gözleri içine koyun.
      10. Bir plaka okuyucusu üzerinde 405 nm'de absorbansı okumak.
      11. verileri işlemek için, standart bir eğri (adım 3.1.1.3 örnekler) (konsantrasyonuna karşı absorbans) arsa ve doğrusal fonksiyonu uygun. doğrusal fonksiyon, 'sulandırılmış jel' solüsyonu (jel + reaksiyon tamponu) serbest tiyol konsantrasyonu kullanılarak absorbans okumaları dayanarak hesaplanabilir. Son olarak, dikkate reaksiyon tampon maddesi ile 'seyreltme edilerek reaksiyon tampon maddesi olmayan jellerde serbest tiyol konsantrasyonunu belirler. (15 ul jel 5 ul reaksiyon tampon maddesi ile seyreltildi, eğer, örneğin, 20/15 ile çarpmak).
   3. Ellman reaktifi (Şekil 3A) ile photopatterns görüntülenmesi.
      1. 1 saat Ellman reaksiyon tamponu Pep1Alloc desenli ince hidrojeller bekletin.
      2. hafifçe bir doku ile hidrojel kenarlarında silerek aşırı reaksiyon tamponu çıkarın.
      3. şirketinden jel yüzeyi üzerindeki Pipet Ellman reaktifi. Hemen bir renkli kamera ile hafif 10X mikroskop ya da stereomikroskop görüntü.
         Not: görselleştirme kalıpları jel boyunca yayılır olmayan desenli bölgede tioller ile reaksiyona sokulması üzerine, Ellman maddesi yarılmasıyla üretilir san TNB ^2- iyon olarak 5 dakika içinde yok olur, çünkü jeller hemen yansıması olması gerekir. Olmayan desenli bölgeler çıplak gözle hafifçe sarı görünür; daha iyi çözünürlük ve daha küçük desenler, büyütme (örneğin, mikroskop kullanımı) için gereklidir.
2. Floresan peptidleri ile Photopatterns (Şekil 3B) görüntülenmesi.
   1. Daha yüksek çözünürlüğe sahip ya da üç-boyutlu desenleri görselleştirmek için, adım 2.2 jeller bir AF488-modifiye Pep1Alloc (veya benzeri floresan peptid) photopattern.
   2. Bir floresan mikroskop görüntüsü. Bir konfokal mikroskop z-st almak için buraya kullanılabilirack desen y, x- görülebilir, böylece jel görüntüleri ve z-düzlemler.
      Not: floresan ile, jeller AF488 florofor ve maksimum flüoresans dengesini sağlamak için ışıktan korunmalıdır. (4 ° C'de folyo ile sarılmış bir kapta mağazadan) ışıktan koruyarak eğer floresan peptid oldukça stabil olduğu jeller hemen görüntülü gerekmez.

Hidrojeller ve photopatterning 4. Hücre Kapsülleme

1. Toplama ve Encapsulation için Hücreleri hazırlanması.
   1. Standart steril memeli hücre kültürü prosedürleri takiben, trypsinize ve plakaları ilgi hücreleri toplamak. Dekolmanı oluştuktan sonra büyüme ortamı ile tripsin söndürün (T-75 balonuna, 5 mi tripsin, örneğin, toplam 15 ml 5 ml ortam ile plaka durulama 5 ml ortam ile söndürün).
      Not: tripsinizasyon kez hücre tipleri arasında değişebilir, fakat tipik olarak 5 ve 15 dakika arasında oluşabilir. Alternatif hücre dekolmanıt ajanlar (örneğin, Versene) arzu edildiği takdirde hücreleri toplamak için kullanılabilir.
   2. Toplu hücresi süspansiyonu (90-110 xg 5 dakika) santrifüj sırasında hemasitometre ya da diğer hücre sayım cihazı kullanılarak tripsinize Hücre süspansiyonunun alikotlan (a en az 100 ya da üreticinin protokolü) hücreler sayılır. İlk tripsinize hücre süspansiyonu çok sulandırmak ise minimal PBS hacmi veya büyüme ortamı ve yeniden sayısında santrifüj sonra hücre pelet yeniden askıya.
   3. (Polimerizasyondan önce) jeli çözeltisi ile karıştırıldığında 5,000 hücre / ul olacak şekilde mikrosantrifüj tüpleri içine her jel durumu için PBS minimal hacimde hücreleri ve kısım kısımları yeniden askıya.
      Not: Tipik Hücre numuneleri, 300.000-500.000 hücre içeren ve 5000 hücre / ul 3-5 x 20 ul jeller için kullanılabilir jeli / hücre süspansiyonu 60-100 ul yapmak için yeterlidir. Daha yüksek ya da daha düşük hücre yoğunlukları hücre-hücre miktarına bağlı olarak, kapsülleme için kullanılabilirgenel hücre-matris iletişim sırasıyla istenen ve her bir uygulama için belirlenmelidir.
   4. Santrifüj Hücre / PBS tam bölünen miktarları (90-110 xg 5 dakika).
   5. Dikkatle doğru kapsülleme önce mikrosantrifüj tüp hücre pelet PBS aspire.
      Not: hücre kesme kuvvetlerine karşı duyarlı ise, ikinci merkezkaçlama aşamasının (ör hemositometre) sayımı ve daha sonra her bir jel bir durum için gerekli olan kısımlara tripsinize hücre süspansiyonu (tripsin + medya + hücreleri) aliquotting elimine edilebilir. Bu süspansiyonun tam bölenleri (90-110 xg, 5 dakika) bir kez santrifüje tabi tutulur ve tripsin + ortam kapsüllenmesi için bir hücre pelletini bırakarak aspire edilir.
2. Olmayan desenli Hidrojeller kapsül oluşturan hücreler.
   1. Hemen PBS aspire sonra / ul 5.000 hücre nihai bir konsantrasyona kadar-tablonun hesaplanan PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, tur ve PBS + PS + FZ pelet hücreleri askıya.
   2. Kalıp ve descr hidrojeller polimerizeadımda IBED 2.1.6 2.1.2.
      NOT: cam slayt kalıpları hücreleri kapsülleme zaman hücre ölümüne neden olabilir jeli, kesme önlemek için üst slayt sonrası polimerizasyonu çıkartırken, bakım alınmalıdır. kalıptan jel kaldırılması ile yardımcı olmak için, kayar kalıp daha kolay üst kızağın kaldırma hale conta ve hidrojel ıslak polimerizasyondan sonra, steril PBS veya yetiştirme ortamına yerleştirilmiş olabilir. hep birlikte bu kesme önlemek için bir yöntem olup, şırınga kalıpların kullanılmasıdır.
   3. büyüme ortamında durulayın jeller 3 x 10 dk girmemiş türler ve aşırı LAP kaldırmak için.
   4. Daha fazla analiz için istenen bir zaman noktasına kadar _CO2 37 ° C'de büyüme ortamı içinde jeller inkübe ve% 5. Orta her 48 saat veya uygulama (özel hücre tipine ve orta örneğin, tipik besleme aralık) için belirlenen doldurun.
3. Hücrelerin in mevcudiyetinde ve photopatterning Kapsüllenen.
   1. Hemen PBS aspire sonra,/ Ul 5.000 hücre nihai bir konsantrasyona kadar-tablonun hesaplanan PEG4SH, Pep2Alloc, tur ve PBS + PS + FZ pelet hücreleri askıya. Pep1Alloc daha sonra reaksiyon için serbest tiyoller (örneğin, 2 mM), uygun bir konsantrasyon bırakın.
   2. adımlara 2.2.8 2.2.2 açıklandığı gibi kalıp, polimerize ve desen hidroj.
   3. reaksiyona girmemiş türler ve aşırı LAP kaldırmak için desenlendirme sonra büyüme ortamında durulayın jeller 3 x 10 dk.
   4. Daha fazla analiz için istenen bir zaman noktasına kadar _CO2 37 ° C'de büyüme ortamı içinde jeller inkübe ve% 5. Ortam maddesi her 48 saat veya uygulama için belirlendiği doldurun.

5. Kapsüllü Hücreleri canlılık ve Metabolik Etkinliğinin Belirlenmesi

1. Encapsulated Hücre Canlılık (Şekil 4A) belirlemek için / Canlı Ölü Sitotoksisite Testi gerçekleştirin.
   1. g orta difüzyonunu izin vermek için PBS ile 3 x 15 dak jellerden büyüme ortamı çıkarın ve durulamaels.
   2. Çözülme canlı / ölü sitotoksisite deneyi çözümleri (etidyum homodimer-1 ve kalsein AM).
   3. 1 ml steril PBS 4 mM Calcein AM çözeltilerinin 2 mM etidyum homodimer-1 ve 0.5 ul 2 ul ekle. Vortex sıyırınız.
   4. 48 oyuklu plakalar, her şırınga kalıp jel 300 ul lekeleme solüsyonu ilave ya da steril bir tabak içinde, bir cam slayt üzerinde jel yüzeyini kaplamak için yeterli ve 45 dakika boyunca inkübe edin.
   5. Fazla boyama çözüm çıkarın ve jeller (PBS ile 3 x 15 dk) aşırı boya kaldırmak için durulayın.
   6. 10X ve 488/525 nm Ex / Em bir konfokal mikroskop (z-yığın görüntüleri) veya z-yığın özelliği olan bir epi-floresan mikroskop Görüntü. Z-yığınları çıkıntı ve canlı (hücre vücuda yeşil) ve ölü (kırmızı çekirdekler) görüntüleme yazılımı ile hücrelerin sayısının sayılmasıyla yaşayan hücrelerin sayısını belirlemek.
2. (Hücre aktivitesi sonrası kapsülleme belirlemek için figu metabolik aktivite deneyi gerçekleştirmek) 4B yeniden.
   1. 24 saat taze büyüme ortamı ile besleme kapsüllenmiş hücrelerin tahlil önce.
      NOT: birkaç ekstra kuyular kontrol (arka plan okumaları) olarak (hayır hücreleri yok jeller veya jel içeren) orta ekleyin.
   2. ilgi zaman noktasında, MTS reaktifi çözeltisi çözülme.
      Not: Zaman içinde, metabolik aktivitesini belirlemek için, bir ilk zaman noktası (12-24 saat sonra-enkapsülasyon) sonraki zaman noktalarında karşılaştırma için bir referans olarak önerilir.
   3. Her iyi (100 ul büyüme ortamı başına 20 ul) MTS reaktif ekleyin.
   4. Üreticinin talimatlarına göre, 37 ° C de 1-4 saat ve% 5 _CO2 için inkübe edin.
      Not: hücre MTS azaltabilir ve jelin üzerinden formazan ürününün yayılmasına imkan için inkübasyon süreleri yeterlidir. Sonuç olarak, bu tür şırınga ucu jelleri gibi daha kalın jeller yeterli MTS azaltılması ve difüzyon için uzun inkübasyon süreleri (~ 4 saat) gerekebilir.
   5. indirgenmiş MTS / Orta 100 ul pipetBir plaka okuyucusu üzerinde 490 nm'de bir 96-kuyu plaka absorbansı temiz kuyu içine.
   6. başlangıç ​​çizgisi absorbans değerlerini oluşturmak için Örnek absorbans değerlerinden hücreleri olmadan yuvalar için arka plan absorbans çıkarın.

Sonuçlar

Kurulum ve prosedür, Şekil 1 'de gösterilmektedir hücreleri ve kapsüllenmiş hücreler içeren, daha sonra photopattern jeller photoencapsulate etmek ve hazır solüsyonlarının hazırlanması için bir örneği, bir ağırlıkça% 10 jel Tablo 1' de verilmektedir oluşturulması için. Tablo 1 kullanarak, monomerlerin miktarı (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) ve hidrojeller polimerize etmek için gerekli olan bir ışık başlatan (LAP) hesaplanır. Bu hesaplamalara dayanarak, PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc ve LAP stok çözeltileri hazırlanır ve ve şekillendirme ve sırasıyla (Şekil 1A) jeller, photopatterning için Pep1Alloc olmadan karıştırılır. Daha sonra, hücreler plakalardan toplanmıştır, sayılır ve kapsülleme (Şekil 1B) için uygun miktarlarda santrifüjlenir. Hücre peleti jel çözeltisi (PBS içinde peptit / polimer / LAP) içinde tekrar süspanse edilir ve hücre / monomer karışımları cam ya da şırınga mol aktarılırds. Hücreler, ışık uygulanması üzerine hidrojel içinde (Şekil 1C) (10 mW / 365 nm'de ^cm2 1-5 dakika) kapsüllenir. (Şekil 1D) photopatterning için, jeller polimerize matrise peptid ve başlatıcı dağılmasını sağlayan, 1 saat ve 30 dakika için 30 dakika boyunca Pep1Alloc ve tur ile ıslatılır. Bu peptid-yüklü jeller istenilen desen ile, fotoğraf maskeleri ile kaplı ve matris içinde serbest tioller peptidleri konjüge etmek için hafif (1 dakika) bir ikinci doz maruz kalmaktadır. Kolye bariyerler, sadece kovalent uygun hücre-matris etkileşimlerini kolaylaştırmak ve in vitro olarak, hücre fonksiyonu ve kaderi tarama doğru ana hücre mikro anahtar mekanik ve biyokimyasal özelliklerini taklit eden, ışığa maruz kalan bölgelerdeki jel ile bağlantılıdır.

Ellman tahlili photopatte içinde jel modifikasyonu ve peptid birleşme ölçmek için basit ve ucuz bir yöntem sağlarrned yüzeyler. Desenli olmayan desenli jeller (yani, ya da peptid değişiklik yapılmadan jeller) Ellman reaksiyon tamponu polimerizasyon sonrası ıslatılır. Daha sonra, sistein standartları ve tampon maddesi içinde ıslatılmış jeller 48 oyuklu plakalara konuldu ve Ellman maddesi (sol Şekil 2A) ile birlikte inkübe edilir. 1 saat 30 dakika sonra, numunelerin alikoları, bir 96-çukurlu plaka, tek tek oyuklara yerleştirilir ve emme 405 nm'de kaydedilmiştir. Sistein standartlardan bir kalibrasyon eğrisi (Şekil 2A, sağ) (absorbans doğrusal uyum, konsantrasyon vs) çizilmiştir ve jeller serbest tiyol miktarı kendi seyreltme faktörü dayalı tespit edilebilir. 10 ağırlıkça% jeli çeşitli polimerleştirme ve photopatterning koşulları için bu serbest tiyol konsantrasyonları Şekil 2B'de gösterilmiştir. (Mavi çubuk, I = 1 dak ve II = 5 dk) Pep1Alloc olmadan 1 veya 5 dakika süreyle polimerize jeller t belirten istatistiksel olarak benzer serbest tiyol konsantrasyonlarışapka hızlı bir tepki oluşur ve katılaşma 1 dakika (iki kuyruklu t-testi, p> 0.05) içinde tamamlanır. Böylece, ışık ek maruz (2-5 dakika) işlevsel grupların daha da dönüştürme ile sonuçlanmaz. Pep1Alloc olmayan 1 dakika için polimerize Jeller 30 ve 90 dakika süre ile (3 mg / ml) ve LAP (2.2 mM) (yeşil çubuklar, II = 30 dakika, IV = 90 dakika) Pep1Alloc ile ıslatılmış ve ışık bir ikinci doz maruz bırakıldı 1 dakika karıştırıldı. serbest tioller azalma (1 dakika durumuna göre% 60-80), bu koşullar altında kolye ipuçları ile jellerin etkin modifikasyon gösterir. daha yüksek modifikasyon isteniyorsa, Pep1Alloc çözeltisi artan konsantrasyonları Peptid çözeltileri dönüşüm sınırlayabilir seyreltik fazla serbest tioller Pep1Alloc erişilebilirliği olarak kullanılabilir; Örneğin, / ml Pep1Alloc 20 mg'a kadar konsantrasyonlarda serbest tiol>% 90 dönüşüm üreten bulmuşlardır.

Benzersiz peptidlerin desenleri hidrojel ilave olabilirhızla Ellman maddesi (5 dakika altında Şekil 3A) ile görüntülenebilir. Ancak, desen görselleştirme süresi (fazla 5 dakika) jeli içinden sarı TNB ^2- dianyonun difüzyon nedeniyle üzerinde kaybolur. Görüntüleme çözünürlüğünü arttırmak ve üç boyutlu (x-, y, ve z uçaklar) ve hücrelerin varlığında kalıplarını gözlemlemek için floresan peptit ilavesi (AF488Pep1Alloc) kullanılabilir. Şekil 3B x- olarak, y ve konfokal mikroskop ile çekilen görüntü yığınlarının z-projeksiyonları desen çözünürlüğü (mikron ölçeği) gösteren gösterilir.

Yaklaşık (94 ± 2) ve% parçalanabilir jeller (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) içinde kapsüllenmiş hMSCs (94 ± 1)% kırmızı çekirdekler (birkaç ölü hücreler, sırasıyla, 1 ve 6 gün kapsülleme sonra canlı (yeşil hücre gövdeleri) kalır ) gözlendi (Şekil 4A). Dahası, hMSC sonrası Kapsülleme 6 gün (en görülmektedir yayılan Rong> Şekil 4A, içerlek), hücreler bozulmasina ve integrin bağlayıcı RGDS ile modifiye bu MMP-bozunur matrisler ile etkileşim olduğunu belirten. Bozunmayan jeller (Pep2Alloc = RGKGRK) kapsüllenmiş hücreler üzerinde yapılan metabolik aktivite deneyleri 1 ve 3 gün sonra kapsülleme (Şekil 4B) hücre canlılığının bir ikinci ölçü sağlar ve hücreler, test edilen çeşitli photoencapsulation ve photopatterning koşulları için aktif kalması göstermektedir Ellman tahlili (Şekil 2B). Özellikle, Pep1Alloc + LAP (koşullar III ve IV) ve ilk kapsülleme (koşullar I ve II) ile 30 dakika karıştırıldı ve 90 dakika inkubasyon arasındaki metabolik aktivitesi önemli bir farklılık prosedürü photopatterning uygulamalarında için uygun olduğunu gösteren, orada kapsüllü hücrelerin varlığı (t-testi, p> 0.05 iki uçlu).

2fig1.jpg "/>
Şekil 1:. Hidrojeller içindeki hücreler kapsüllenmesi ve daha sonra biyokimya ipucu ile photopatterning Kur (A) Makromerlerin ve ışık başlatan stok çözeltileri hazırlanır ve karma (PEG4SH = omurga Pep2Alloc = çapraz bağlama, Pep1Alloc = kolye yapıştırma parçası (RGDS), LAP = foto-başlatıcı ). (B) hücreler kapsülleme için toplanır. (C), hücreler (sırasıyla PEG4SH / Pep2Alloc / örtü ya da PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP) olmayan veya integrin-bağlama peptidleri olan makromer çözeltiler karıştırılır ve ışığa maruz kaldığında kapsüllenir. Jel oluşumu sırasında fazla tiol grupları ihtiva eden (D) jeller (burada, 2 mM fazla tiyol ile oluşturulan PEG4SH / Pep2Alloc / tur,), örneğin, tek bir Alloc grubunun (Pep1Alloc ile işlevselleştirilmiş peptidlerin daha sonra ilave biyokimyasal ipuçları ile desenli olabilir, RGDS, IKVAV, vs.), hücre yapışmasını arttıranjel belirli bölgeleri içinde. Burada, floresan etiketli RGDS jellerin desenleme gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2:. Kantitatif Ellman tahlili Kurulum ve sonuçlar desenli hidrojellerinin modifikasyonu değerlendirmek için (A) jelleri ve sistein standartları Ellman maddesi ile 48 oyuklu plakalar içinde inkübe edilir. Doğrusal bir standart eğri jel örneklerinin sistein konsantrasyonunu belirlemek için çizilir. II = 5 dakika polimerizasyonu;, III = 30 dakika inkübasyon Pep1Alloc ile (B) aşırı serbest tioller bir asılı: Alloc-peptid (i = 1 dakika polimerizasyon ile desen üzerine jel oluşumu sırasında hidrojeller için dahil edilir ve tüketilen IV = 90 dakika inkübasyon, wi inci Pep1Alloc; III ve IV hem) polimerize ve 1 dakika boyunca hafif desenli. Gösterilen veriler (3 n =) standart hatayı gösteren hata barları ile ortalama göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. Ellman tahlili ve fluoresan görüntüler photopatterned hidrojeller görselleştirmek için (A) Ellman reaktifi hızlı x- desenleri (satır) ve y-düzlemi (sarı = desensiz bölgesi, Skala çubuğu = 1 mm) tespit etmek için kullanılabilir. (B) Floresan peptidler y, x- desenleri gözlemlemek için kullanılan ve olabilir z-uçakları (yeşil = desenli bölge; 200 mikron ölçek çubuğu, 10X su daldırma hedefi; Ex / Em 488/525 nm).large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

. Şekil 4: Canlılık ve bozulmaya photopatterned hidrojellerin içindeki hücrelerin metabolik aktivitesi (A) Örnek konfokal z yığın (z-projeksiyon, 10X su daldırma objektif) canlı bir (yeşil, Ex / Em 488/525 nm) ve ölü hMSCs (kırmızı; Ex / Em 543/580 nm) hidrojeller içinde kapsüllü 24 saat sonrası kapsülleme (Ölçek çubuğu = 200 mikron). 6 gün kapsül (ilave görüntü, Ölçek çubuğu = 50 um) sonra bu hidrojellerin içinde yayıldı hücreler. (I, II = 5 dakika polimerizasyon i = 1 dakika polimerizasyon) ve örnekleme koşulları (III = Pep1Alloc 30 dakika inkübasyon (B) hücreler, 1 ve 3 gün (sırasıyla koyu ve açık çubuklar) çeşitli polimerizasyon için sonrası kapsülleme, metabolik olarak aktif olan , IV = 90 dakika Kuluçkan Pep1Alloc ile; her ikisi de) polimerize ve 1 dakika boyunca hafif desenli. Gösterilen veriler (3 n =) standart hatayı gösteren hata barları ile ortalama göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1: Örnek kurulum hidrojeller yapmak için stok çözeltileri hacimleri hesaplamak için mavi vurgulanır tablo içinde Hücreleri kullanıcı tanımlı parametreleri belirtir;. diğer miktarlar bu ayarlara dayalı olarak hesaplanır. bir jel yapmak için her stok çözümü için nihai hacimleri turuncu vurgulanır. beyaz hücreler, kullanıcı tanımlı parametrelere dayalı nihai hacimlerini hesaplamak için kullanılan formüller içerir. 2.2 mM LAP bir konsantrasyon 0,067 ağırlıkça% eşdeğer olduğuna dikkat edin.

Tartışmalar

Burada sunulan prosedür tiyol-en tıklama kimyası oluşturduğu hidrojellerin içindeki hücreleri photoencapsulate için teknikler gösterilmiştir ve daha sonra biyokimyasal ipuçları ile jeller photopattern. Başlangıçta hidrojeller oluşturmak için ışık kullanımı polimerizasyonu öncesinde polimer çözeltisine içinde homojen karışmasını ve hücrelerin süspansiyon sağlar. Hızlı polimerizasyon 'kilitler' tanımlı kalıp şeklinde jel ve hidrojel ağ içindeki hücreler askıya kapsüller. Jeller, aynı zamanda, arzu edilen nihai uygulamaya bağlı olarak, çok sayıda farklı şekillerde (örneğin, cam slaytlar veya şırınga ucu) içine kalıplanabilir. ışık alma ince numune içinde sınırlıdır Örneğin, cam slaytlar bağlı hidrojeller 3D kültür kapsüllenmiş hücreler görüntüleme uygulamaları için özellikle yararlıdır. Şırınga kalıplar kısa bir süre içinde elde edilmesi numune daha büyük bir sayı sağlayan hücrelerin hızlı kapsüllenmesi için kullanılabilir (cam slayt ile karşılaştırıldığındaBu sitometrisi veya qPCR akış hücrelerin çok sayıda gerektiren deneyler için kullanılabilir s). Daha sonra, bu jeller daha sonra farklılaşma ya da işgali olarak istenen hücresel tepkiler biyokimyasal ipuçları ile desenli olabilir. ^30,31

canlılığı ve metabolik aktivite için Tahliller sunulan malzeme sistemi hücreleri ve desenlendirme koşulları hayatta göstermektedir. metabolik aktivite, hücre fonksiyonu üzerindeki polimerizasyon ve desen koşullarının, ilk etkilerini değerlendirmek üzere bozunmayan jellerinde 3 kadar (RGKGRK peptit çapraz bağ) gözlenmiş unutmayın. Buna ek olarak, bir parçalanabilir peptid ara bağlantı (GPQGIWGQ) ile formüle edilen jellerde sonrası kapsülleme hücreleri canlı ve kültürde 1 hafta yayılır kalmasını destekleyen 1 ve 6 gün sonra hMSCs bir membran bütünlüğü deneyi (ölü / canlı canlılığı / sitotoksiklik boyanma). Ek hücre çizgilerinin canlılığı kişilerce ³² içindeki photopatterning koşulları için bildirilmiştirBurada kullanılan ve ölü / canlı lekelemesi ve metabolik aktivite analizleri kullanılarak tarif hidrojel sistemi için değerlendirilebilir. Bu malzemeler sistemi ve ilgili prosedürler (4.2 ve 4.3) kullanılarak hücre canlılığı ile ilgili sorunlar görülmez iken, bazı hücre tipleri serbest radikal ve / veya ışığa maruz duyarlı olabilir. Bu durumda, kullanıcıların azid-alkin, ¹² FXIII, ³¹ veya Diels Alder tabanlı hidrojel oluşum kimyaları olmayan foto-tetiklenerek malzemeler sistemleri, kullanmayı düşünebilirsiniz. ³³

Basit teknikler algılamak ve aynı zamanda (3.1 ve 3.2) sunulmuştur jeller içinde biyokimyasal ipuçları desenlendirme ölçmek için. Reaktifler ticari olarak temin edilebilmektedir ve ek bir sentetik işlem adımları ya da daha pahalı reaktifler (örneğin, floresan etiketli peptid) gerekli olduğundan Ellman tahlili özel bir ilgi çekmektedir. Ellman tahlil tam differe altında biyokimyasal ipuçları ile serbest tiyol modifikasyonu belirlemek için kullanılabilirnt koşulları photopatterning, hem de hızlı bir şekilde desenleri görselleştirmek için. peptid esas kantitatif ölçüsü olarak, peptid birleşme öncesi ve desenlendirme sonra tiyol fonksiyonel grup konsantrasyonunu ölçülmesi için, doğrudan Ellman tayini ile değerlendirilir. Miktar, bu tür floresan işaretli peptidlerin ile yapılabilir olmakla birlikte, ³⁴ görüntüleme tabanlı miktar daha fazla zaman alan işleme ve analiz adımları gerektirir (örneğin, bir kalibrasyon eğrisi, flüoresan-işaretli peptid ve üretim sentezi peptid konsantrasyonuna floresan ilişkilendirmek ) görüntü analizi kullanılarak. Görüntüleme peptid dahil edilmek için, Ellman reaktifı ile doğrudan numune tatbik hemen görülebilir. X ve desen görselleştirme için y düzlemleri ile sınırlı olmakla birlikte, bu teknik serbest tiyol grubu içeren matrisler desenli olup olmadığını tespit etmek için basit, rutin bir yöntem olarak kullanılabilir. Ellman tahlil c olmadığına dikkat etmek önemlidironsidered cytocompatible, photopatterns gözlemlemek ve ölçmek için kullanılabilir iken, bu hücrelerin varlığında yapılamaz. üç boyutlu ve hücrelerin varlığında model oluşturmanın görüntüleme için, hidrojel matrisinin içinde flüoresan peptidlerin konjugasyon güçlü ve yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olarak kalır. desen ebatları Y, x-değerlendirilmiştir edilebilir ve Z-düzlemler konfokal mikroskopi kullanılarak ve desenli bölgeler ya da olmayan desenli bölgelerde hücreleri tespit edilebilir, böylece bu yöntem cytocompatible olup. Birlikte ele alındığında, Ellman tahlil ve görüntüleme tabanlı teknikler araştırmacılar nicelik ve nitelik malzemeler sistem içinde biyokimyasal ipuçlarını photopatterning değerlendirmek için tamamlayıcı araçlardır.

PhotoClick, ya da daha geniş foto-tetiklenerek hücrelerin varlığında hidrojellerin oluşumu ve modifikasyonu için kimyaları çoktur. Burada sunulan döküm, kapsülleme ve desenlendirme teknikleri lim değildirtarif edilen malzemenin sistemine SINIRLI ve tiol-alkin, ³⁵ azid alkin, ⁴ ve tiol-en kimyaları (örneğin, tiol-norbornen), ^10,13 yanı sıra ile gibi alternatif ışık tabanlı kimyaları, tatbik edilebilir bu Irgacure 2959, Eozin Y ve Camphorquinone farklı foto-başlatıcılar,. Kullanıcılar yordam parametreleri ayarlamak gerekebilir Not (örneğin, inkübasyon süreleri, polimerizasyon süreleri, hücre yoğunluğu) koşullar, bu diğer sistemler için cytocompatible kalmasını sağlamak için. Model verme işlemi hidrojel (2.2.3-2.2.5) içine Alloc-modifiye edilmiş peptid (ler) in difüzyon gerektirdiğinden, bu işlem integrin bağlanma kısımları (örneğin, peptid ya da hücre dışı matris proteini eklenmesi için en yararlı olduğu kanıtlanabilir ağa ligandın bağlanma hücresi tam integrin aktivasyonu ile çekiş güçleri üretimi için gerekli olan hidrojel, fragmanlar). Not ^36, biyomoleküllerin söz konusu olabilirçözelti içinde, immobilizasyon (örneğin, büyüme faktörleri veya sitokinler) üzerine benzer şekilde aktif, hidrojel içine kısmı difüzyon (~ 1 saat) inkübasyon adımı desen sonuçları dürülmüş sinyal olaylarını neden olabilir. Diğer yöntemler kendi desen için büyüme faktörü immobilizasyon veya yerel haciz için kurulmuştur. ^37-39 Ayrıca, desen çözünürlük ışığa maruz üzerinde kontrol tarafından belirlenir. Burada, PHOTOMASKS jel derinliği boyunca ve x ve y düzlemlerde desen yaratılmasına izin; Bununla birlikte, jellerin içindeki biyokimyasal işaretlerin desen üzerinde daha fazla aralıklı kontrol da x-desenleri, Y ve Z düzlemleri üretmek için bir iki-fotonlu konfokal mikroskop kullanımı ışınlama alternatif yöntemler ile elde edilebilir. ^34,40 Son olarak, yordam içinde kullanılan malzeme sistemi sadece başlangıçta biyokimyasal ipuçları ile modifiye edilirken, dik PhotoClick kimyaları alte sağlamak için kullanılan olabilir dikkat etmek önemlidirBurada sunulan zamanla matris özellikleri rasyon. ¹² prosedür ve teknikleri iyi tanımlanmış ve spatiotemporally kontrollü özelliklere sahip sentetik matris oluşturmak için mevcut yaklaşımlara çeşitlilik ekleyin. Özel olarak, bu prosedür içinde kullanılan tepkime maddeleri ve malzemelerinin piyasada bulunabilir olmasına kontrollü hücre kültüründe uygulama için hidrojel bazlı biyo materyallerin kullanımı ile ilgilenen araştırmacılar geniş bir faydalı olacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Custom Peptides	Various Vendors	----	Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.
4-arm PEG Thiol, MW 20k	JenKem USA	4ARM-SH	Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate	Colorado Photopolymer Solutions	Li-TPO
Dimethyl Phenylphosphonite	Sigma Aldrich	149470	Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
2,4,6-Trimethylbenzoyl Chloride	Sigma Aldrich	682519	Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Lithium Bromide	Sigma Aldrich	213225
2-Butanone	Sigma Aldrich	360473
Flask, Round Bottom, 100 ml	Chemglass	CG-1506-05
80 ml Filter Funnel, Buchner, Medium Frit	Chemglass	CG-1402-L-02	Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.
Magnetic Stir Bars	Various Vendors	----
Magnetic Stirring and Hot Plate	Various Vendors	----
Vacuum Dessicator	Various Vendors	----
Deuterium Oxide	Acros Organics	16630
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190-250
Penicillin Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15070-063
Fungizone	ThermoFisher Scientific	15290-018
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	ThermoFisher Scientific	15400-054	Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.
Microcentrifuge tubes	Various Vendors	----	1.5 or 2 ml sizes, sterile.
BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle)	Fisher Scientific	14-823-16H	Product number listed here is for a 1 ml syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).
Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket)	McMaster Carr	87315K62
Ethanol, 200 Proof	Decon Labs	2701
RainX, Original	Amazon	800002243	May be purchased from other vendors.
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2
Photomasks	Advance Reproductions Corporation	----	Photomask Division, different designs may be printed as desired.
DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)	ThermoFisher Scientific	PI-22582
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	S5136
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma Aldrich	E6758
Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS	Fisher Scientific	S318
Orthophosphoric Acid	Alfa Aesar	33266
Cysteine Hydrochloride Monohydrate	Sigma Aldrich	C7880
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	ThermoFisher Scientific	L-3224
CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay	Promega	G3582
Centrifuge	Various Vendors	----	Capable of speeds at 90-110 x g.
Multiwell Plate Reader	Various Vendors	----	Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.
Epifluorescent or Confocal Microscope	Various Vendors	----	To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.
Omnicure Exfo Series 2000	Excelitas Technologies	----	Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.
Zeiss Zen Lite Software	Zeiss	----	Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes
ImageJ	NIH	----	Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis