Aracı Olarak Etilen serbest Bileşik, 2-chloroethylphosphonic acid, kullanan Bakterilerin Etilen Yanıtı Eğitim için

Özet

The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.

Özet

Ethylene (C₂H₄) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.

Giriş

Olefin _(C2 lH ₄₎ havagazı lambaları kullanılan bir laboratuarda yetiştirilir bezelye fide, (hipokotiller) daha kısa olduğu gövde olan bir anormal morfoloji sergilemiş olduğu gözlemlenmiştir, birinci 1901, bir bitki hormonu olarak tespit edilmiştir, daha kalın ve normal bezelye fide ile karşılaştırıldığında yan bükülmüş; Bir fenotip sonra üçlü cevap ^1,2 olarak nitelendirdi. Daha sonraki çalışmalar, etilen gibi büyüme, stres yanıtı, meyve olgunlaşma ve yaşlanma ^3. Arabidopsis thaliana, bitki biyolojisi araştırma için bir model organizma olarak çok sayıda gelişimsel süreçleri düzenleyen önemli bir fitohormondur, iyi etilen verdiği yanıtta açısından incelenmiştir olduğunu göstermiştir. Çeşitli etilen tepki mutantlar koyu yetişkin A'da görülen üçlü cevap fenotip istismar ederek izole edilmiştir etilen ^1,4,5 mevcudiyetinde thaliana fideleri. bitkilerdeki etilen üretimi için biyosentetik ön-madde 1-a,minocyclopropane karboksilik asit (ACC) ⁶ ve yaygın olarak üç karşılık fenotipi ^1,4,5 neden endojen, etilen üretimini geliştirmek için üçlü cevap deneyi sırasında kullanılır.

Etilen yanıtı yaygın bitkilerde çalışılan olmasına rağmen, bakteriler üzerinde eksojen etilen etkisi büyük ölçüde bitkiler ile bakterilerin yakın ilişki rağmen understudied edilir. Bir çalışmada, belirli Pseudomonas suşları karbon ve enerji ^7'nin tek kaynağı olarak etilen kullanarak hayatta olduğunu bildirdi. Ancak, yalnızca iki çalışma bakteri etilen yanıt göstermiştir. İlk çalışma göstermiştir ki Pseudomonas aeruginosa, P. suşları fluorescens, P. putida ve P. syringae eriyik agaroz, saf etilen gazı ⁸ ile dengelenmiş bir kemotaksis tampon maddesi ile karıştırıldı olan bir agaroz tıkayıcı deneyi kullanılarak, etilen bakımından kemotaktik edildi. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, hiçbir Furth olmuşturSaf etilen gazı kullanılarak er raporları nedeniyle özel ekipman olmadan laboratuvarda gazların sevkinde güçlüğüne muhtemel bakteriyel etilen tepkisini, karakterize etmek. Bakteriyel etilen tepkisinin ikinci rapor etilen ⁹ xylinus meyve ilişkili bakteri Komagataeibacter (eski Gluconacetobacter) bakteriyel selüloz üretimi ve etkisinde gen ifadesini arttığını gösterdi. Bu durumda, etilen-salan bileşik, 2-chloroethylphosphonic asit (İEKB) saf etilen gazı ve özel ekipman ihtiyaç kalmaz, bakteriyel büyüme ortamında in situ etilen meydana getirmek üzere kullanıldı.

^{- 14,} bir baz katalizörlü, birinci dereceden reaksiyon ¹² boyunca pH 3.5 ^10,11 Yukarıdaki: 1 molar oranında İEHB 1 etilen üretir. CEPA bozunması pozitif Etil pH ve sıcaklık ^13,14 ve sonuçlar ile ilişkilidiren, klorür ve fosfat. CEPA gaz etilen için uygun bir alternatif etilen bakteriyel yanıtları okuyan ilgilenen araştırmacılar sağlar.

Aşağıdaki protokoller genel amacı bakteriyel etilen tepkisini incelemek için basit ve etkili bir yöntem sağlamaktır ve bakteriyel büyüme ortamında CEPA'nın ayrışma etilen üretiminin fizyolojik olarak uygun seviyelerinin doğrulaması içerir, kültür pH analizi CEPA ayrışma sırasında zarar görmemesini sağlamak için bakteri üremesi ve bakteriyel morfoloji ve fenotip üzerindeki etilen etkisi değerlendirilmesi. Biz K. kullanarak bu protokolleri göstermek xylinus, bununla birlikte, bu protokoller uygun büyüme ortamı kullanılarak ve fenotip analizi diğer bakterilerde etilen tepkisini incelemek için adapte edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Kimyasallar

1. 500 mM NaH ₂ PO ₄ · asitleştirildi içinde _H2O (137,99 g / Mol) (pH 500 mM CEPA (144.49 gr / mol) ihtiva eden bir çözelti, ve her ikisi de, 500 mM NaCI (58.44 g / mol) 'den oluşan bir çözelti hazırlamak 2.5) ultra saf su ve 0.1 N HCI. çözümler açıktır kadar vorteks ile karıştırın.
2. Seri olarak 5 mM ve 50 mM stok elde etmek için aynı çözücü (10 x) 500 mM seyreltik çözeltiler.
3. Ultra saf su içinde 1-aminosiklopropan karboksilik asit (101.1 g / mol ACC) içindeki bir 10 mM çözelti hazırlayın.
4. -Filtre sterilize -20 ° C'de stok çözümleri ve mağaza alikotları.
5. Filtre sterilize selülaz. 4 ° C'de saklayın alikotları.

2-chloroethylphosphonic acid Ayrışma 2. doğrulanıyor Etilen Üretimi: Üçlü Tepki Testi

1. Buhar fazlı Yöntemiyle Ekotip Columbia tohumları thaliana Arabidopsis Yüzey sterilize:
   DİKKAT: Aşağıdaki adımı t üretiroksik klor gazı. Davlumbaz tohum sterilizasyon kuralları.
   1. Tohum sterilizasyon için 250 ml cam beher karşılamak ve davlumbaz yerleştirmek yeterince derin bir yapışmalı kabı alın.
   2. A. ekle thaliana bir mikrosantrifüj tüp tohum ve rafa tüp yerleştirin. yapışmalı kabın içine açık tüp içeren raf yerleştirin.
      Not: klor gazı daha düşük tohum nüfuz sağlamak için yarısı dolu üzerinde bireysel tüpleri doldurmak etmeyin.
   3. sızdırmaz kapta ticari ağartıcı, 100 ml içeren 250 ml'lik bir beher yerleştirin. Dikkatle ağartıcıya konsantre HCI 3 ml ilave edilir ve derhal kapaklı konteyner mühür.
      DİKKAT: Ağartıcı ve HCl tohumları, yüzey sterilize edilmesi işlevini görürler toksik klorin gazı üretmek için reaksiyona girer.
   4. fumehood 4 saat boyunca klor gazı varlığında tohumları inkübe edin.
      Not: Daha uzun sterilizasyon süreleri çimlenme etkinliğini azaltacaktır.
   5. Sterilizasyon sonrasında, c izinhlorine gaz daha sonra en az 1 saat süre ile duman davlumbazında havalandırma mikrosantrifüj tüpü mühür. atılmadan önce en az 24 saat boyunca fumehood çamaşır suyu ve HCl karışımı bırakın.
      Not: Sterilize edilmiş tohumlara, acil kullanım için oda sıcaklığında saklanabilir.
   6. Uzun süreli depolama boyunca 4 ° C 'de tohum tutun. yoğunlaşmayı önlemek için ependorf tüp açmadan önce oda sıcaklığına kadar tohum getirin. karanlıkta saklayın tohumları.
2. 4-sektör Petri Yemekleri (90 x 15 mm) Agar Plakaları hazırlayın:
   1. A. büyüme ortamı 110 ml hazırlanması thaliana fidanları: 1 x Murashige ve% 1 ihtiva eden Skoog (MS) bazal ortam ¹⁵ (4.33 gr / lt) (ağ / hac) sakroz ve% 0.8 (ağ / hac) ağar. NaOH ile pH 6'ya MS ortamı ayarlayın.
   2. CEPA'nın ayrışma bakteriyel büyüme ortamı 100 ml hazırlayın: Schramm ve Hestrin ^16% 1.5 ihtiva eden (SH) ortamı (ağırlık / hacim) ağar. NaOH ile pH 7'ye SH ortamı ayarlayın.
   3. otoklav ve tempe tarafından medya sterilize55 ° C su banyosu içinde R.
   4. MS agar katkılı sonra, steril bir şişeye 40 mi ekleyin. A. pozitif kontrol büyüme ortamı hazırlamak için thaliana fideler, 10 uM ACC bir son konsantrasyon elde etmek üzere, 10 mM ACC 40 ul MS agar 40 ml kısım tamamlar.
   5. Sektörlü Petri kapları (Şekil 1), uygun kadran ortamın 5 ml ilave edilir ve Ağarı katılaştırmak için bir olanak sağlar. üç nüsha olarak tüm tabak hazırlayın.
      Not: CEPA sonra protokolde kadar büyüme ortamına ilave edilmez.

Şekil 1:. CEPA üçlü müdahale analizi için kullanılan agar plakaları Kur şematik (negatif kontrol (A), pozitif kontrol (B) belirli bir kadran ve deney plakaları görüntülemektedirC). Bu rakam Augimeri ve Askı ⁹ modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. Tabakalandırmak A. thaliana Tohumlar Senkron Çimlenme sağlamak için:
   1. Yaklaşık elli A. ekle MS veya MS + ACC agar içeren her kadranda üzerine thaliana tohumları. Emin olun tohumlar eşit fide çıkarılmasını ve analizi kolaylaştırmak için dağıtılır.
   2. Plakalar 4 ° C'de karanlıkta tohumlarının inkübe 3-4 gün ° C.
4. Üçlü Tepki Testi Bakteriyel Büyüme Medium üzerinde CEPA (SH) ayrıştırmak ve uygulayın:
   1. tabakalaşma sonra, 2 saat boyunca floresan ışık tohumları maruz.
   2. SH agar içeren deney levhaları çeyrek üzerine 500 mM İEKB stok çözeltisinin 10 ul yay (pH 7, Şekil 1) bir son konsantrasyon elde etmek için CEPA'nın1 mM.
   3. laboratuvar film ile plakaları mühür ve tohum için karanlık bir ortam yaratmak için folyo ile kaplayın.
   4. Aşağı agar yüzü 3 gün boyunca 23 ° C'de karanlıkta plakaları inkübe edilerek de tohumlar çimlenmeye.
      Not: Tabaklar yığılmış olabilir, ancak etilen havadan daha hafif olduğu için negatif kontroller altına konulmalıdır.
5. Üçlü Tepki Testi Verileri Analiz:
   1. Alev sterilize forseps ile, bir diseksiyon veya dijital USB mikroskop altında her tedavi ve görünümüne tekabül eden bir plakadan tek fidan kaldırın. fide alt hizalanmış ve fotoğrafı emin olun.
   2. Her kadranda 30 fideleri (biyolojik çoğaltmak başına 60 fide ve tedavi başına 180 fidan) çıkarın. bir cetvel ile siyah bir arka plan ve fotoğraf ile bir yüzey üzerinde aynı hizaya getirin.
   3. ImageJ yazılımı ¹⁷ kullanarak çoğaltmak fidelerin hipokotil uzunluğu (mm) ölçün. tıklayıp * düz sürükleyerek ölçeği ayarlama *aracı 10 mm uzunluğunda seçin. "Analiz" sekmesi altında "Set Ölçeği" i seçin ve * Parçalı aracını kullanarak 10'a bilinen mesafeyi ayarlamak, tıklayın ve sürükleyin mesafeyi ölçmek için hipokotil ve basın M uzunluğunu seçmek için kullanılır. Tukey çoklu karşılaştırma testi ile tek-yönlü ANOVA kullanılarak biyolojik çoğaltır araçlarını karşılaştır. Farklılıklar <0.05 anlamlı eğer p olarak kabul edilir.

Bakteriyel Büyüme boyunca pH 3. Analiz

1. Üç nüsha olarak xylinus Starter Kültürler büyümek ve Ölçmek Komagataeibacter:
   1. K. tek bir koloni İnokülasyon xylinus% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH ortamı, 5 ml (pH 5) içinde. 0.4, _{0.3, 600} ulaşıldığında bir OD (yaklaşık 72 saat) kadar 150 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de kültürler inkübe edin.
   2. santrifüj ile hasat başlatıcı kültürleri (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika). 5 ml steril% 0.85 ile NAC (w / v)l Çözelti hücreler iki kez yıkama ve hücre pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun.
   3. Bir Petroff-Hausser sayma odasını kullanarak hücrelerin ölçmek.
2. pH Analiz için Kültürleri aşılamak:
   1. folyo kapak ile on iki adet 500 ml'lik şişelere% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH suyu (pH 7), 150 ml ilave edilir. K. ile şişeler aşılamak 10 ⁵ hücre / ml'lik bir konsantrasyonda xylinus başlangıç kültürleri. Üç starter kültür kullanılarak, tedavi başına üç biyolojik çoğaltır hazırlamak.
   2. 5, 50 veya 500 mM İEKB stok çözeltileri 300 ul Ek kültürleri, sırasıyla, 1.0 mM, 0.01, 0.1 nihai CEPA konsantrasyonlar elde, ve. Cepa çözmek için kullanılan çözücü, 300 ul muamele edilmemiş kontrol kültürleri Supplement.
   3. sıkı şişelere folyo kapak bantlayarak şişeler kapatılır ve 150 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de 14 gün boyunca kültür inkübe edin.
3. Her gün, aseptically (10 dakika;, 4 ° C 2,000 x g) santrifüj ile, her şişe ve topak hücrelerinden 5 mi örnek alabilir. temiz bir tüpe süpernatantlar aktarın ve bir pH ölçer kullanılarak her bir biyolojik tekrarında pH'ı ölçülür.
4. biyolojik çoğaltır ortalama pH değeri grafik ile zaman ders verileri analiz edin.
   Not: kültür pH 3.5'in altında düşmemesine önemlidir; 5 bir kültür pH değerinin önemli ölçüde CEPA etilen salınımını azaltan ve 3.5'in altında bir pH değeri, tamamen etilen salınımını inhibe eder.
5. , Klorin ve fosfat seviyeleri kontrol, 0.01, 0.1 ile aynı deney sonuçlarını ve sırasıyla 5, 50 ve 500 mM stoklar kullanıldığında NaCl NaH ₂ PO ₄ çözeltinin 1.0 mm'dir.

4. Koloni Morfolojisi

1. K. büyümek üç kopya halinde xylinus Başlangıç Kültürleri:
   1. K. tek bir koloni İnokülasyon xylinus% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH ortamı, 5 ml (pH 5) içinde. doğmuş iyileşmesini0.4, 0.3 OD ₆₀₀ kadar, 150 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de te kültürleri (yaklaşık 72 saat) ulaşılır.
   2. santrifüj ile hasat başlatıcı kültürleri (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika). Steril tuzlu su, 5 ml hücre, yıkama ve daha sonra hücre pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun.
2. % 1.5 SH 25 ml içeren 24 agar plakaları (pH 7) orta hazırlayın (a / h) agar.
3. Agar katılaşmış sonra, sırasıyla 0.01, 0.1, ve 1.0 mM nihai CEPA konsantrasyonları elde edilmesi için 5, 50, 50 ul ve agar üzerinde, 500 mM CEPA stok solüsyonları yayıldı. herhangi bir değişiklik meydana ve çözücünün 50 ul yayılan ayarlama muamele edilmemiş ve çözücü kontrol plakaları, test bileşiklerini çözmek için kullanılan.
4. K. bir döngü dolu (~ 5 ul) ile izole edilmiş koloniler için şerit tabakalar xylinus starter kültür ve parafin film ile onları mühür. üç nüsha olarak tüm plakaları aşılamak. 30 ° C'de beş gün süreyle inkübe edin.
5. fotniteliksel bir dijital USB mikroskop kullanarak ve 20X büyütmede ograph koloniler katı ortam üzerinde koloni morfolojisi ve selüloz üretimi değerlendirmek.
   Not: Selüloz koloni kenarı boyunca puslu bir madde olarak görünür.
6. , Klorin ve fosfat seviyeleri kontrol, 0.01, 0.1 ile aynı deney sonuçlarını ve sırasıyla 5, 50 ve 500 mM stoklar kullanıldığında NaCl NaH ₂ PO ₄ çözeltinin 1.0 mm'dir.

5. zar Tahliller

1. Büyümek ve Ölçmek K. üç kopya halinde xylinus Başlangıç Kültürleri:
   1. Üç nüsha olarak, K. tek bir koloni aşılamak xylinus% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH ortamı, 5 ml (pH 5) içinde. 0.4, _{0.3, 600} ulaşıldığında bir OD (yaklaşık 72 saat) kadar 150 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de kültürler inkübe edin.
   2. santrifüj ile hasat başlatıcı kültürleri (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika). Steril tuzlu su, 5 ml, t yıkamao hücreler iki kez ve hücre pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun.
   3. Bir Petroff-Hausser sayma odasını kullanarak hücrelerin ölçmek.
2. 24 oyuklu plakaların aşılanması için ana karışımlarını hazırlamak:
   1. sırasıyla 0.01, 0.1, ve 1.0 mM nihai CEPA konsantrasyonları elde edilmesi için 5, 50, 120 ul ve 500 mM İEHB stokları SH ortamı 60 ml (pH 7) Supplement. Cepa çözmek için kullanılan çözücü, 120 ul SH ortamı (pH 7) arasında bir 60 ml Supplement. Vortex karıştırın.
   2. dört adet 14 ml'lik miktarlar halinde İEHB içeren bir maddenin her birinden 60 ml bölün. 10 ⁵ hücre / ml'lik bir konsantrasyonda başlatıcı kültür biyolojik çoğaltır 14 ml alikotlar üç inoküle. selüloz üretimi önlemek için buz üzerinde hücreleri ile tüpler tutun.
      Not: Geri kalan 14 ml bir örnek steril kontrol kuyuları için kullanılacaktır.
3. 24 oyuklu plakaların aşılanması:
   1. Üç biyolojik çoğaltır satır ve kendi plaka her tedaviyi testSteril kontrollerin bir satır (Şekil 2).

Şekil 2:. Zar tahlilinde ve analiz Hazır İEHB-desteklenmiş, pH 7 SH ortamı (60 mi) için kullanılan protokol gösteren bir akış şemasıdır, üç ayrı biyolojik suret aşılamalar ve steril bir kontrol (14 mL) ekstrakte edildi için örnek olarak alındı. Bu kültürler daha sonra bir 24 yuvalı plaka içine altı teknik çoğaltır (2 mi) içine bölüştürülmüştür ve parafın bir film ile kaplanmıştır. 30 ° C'de 7 gün beklettikten sonra, zarlarına hasat edilir ve FT-IR ile ıslak ağırlık, kalınlık, kuru ağırlığı, ve kristal belirlenmesi ile karakterize. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız

2. 14 ml ana karışımı kullanarak, EAC içine 2 ml ekleyinsteril 24 oyuklu plaka altı kuyu H. Üç biyolojik çoğaltır ve steril kontrol (Şekil 2) için tamamlayın. Her tedavi için tekrarlayın.
3. parafın film kapatma plakaları ve 30 ° C 'de 7 gün süre ile, statik inkübe edin.

4. Hasat ve Tedbir pelikül Islak Ağırlığı, Kalınlığı, kuru Ağırlık (Selüloz Verim) ve kristal yapıdaki (Şekil 2):
   1. Rakip zar kenarı yükseltmek ve forseps ile bireysel zarlarına kaldırmak için ince tabakanın bir tarafını basınız. kavrama koruyarak, kendi ıslak ağırlıkları belirlemek için tartım önce aşırı orta kaldırmak için 3 sn taze kağıt havlu üzerine koyun.
   2. yüksek çözünürlüklü bir dijital kamerayı kullanarak taraftan bir cetvel ve fotoğraf bitişik zarlarına hizalayın.
   3. ImageJ yazılımı kullanma ^17, sol omuz, sağ omuz ve her ince tabakanın ortasına pelikül kalınlığını ölçmek. Her biyolojik RepliCat için tüm teknik çoğaltır ortalamae.
   4. Ayrı ayrı 6-çukurlu bir plaka gözlerine zarlarına transfer. 20 dakika hücreleri lize etmek için, 80 ° C de, 0.1 N NaOH 12 ml zarlarına tedavi edin.
   5. NaOH çıkarın ve ajitasyon ile 24 saat boyunca ultra saf su ile yıkanarak zarlarına nötralize eder. suya her 6 saat değiştirin.
      Not: ince zarlar yıkama aşamasının tamamlanması üzerine beyaz olmalıdır.
   6. Talep silikon tabakaları üzerindeki ince zarlar ve sabit bir ağırlığa kadar 48 saat boyunca 50 ° C'de kurutulur. Kuru kez, bakteriyel selüloz verimi belirlemek için analitik bir ölçekte pelikül ağırlıkları paspaslar kaldırmak ve ölçün.
   7. 4.000 650 cm aralığında kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) 32 taramaları kullanılarak ve 4 sm bir çözünürlük ^-1 Fourier dönüşümü kullanılarak ince tabaka kristal analiz ^-1. A ₁₄₃₇ / A ₈₉₅ kullanarak, kristallik endeksi, CI (IR) hesaplayın; "kristal bant" ve "amorf band" absorbansı oranı daha önce ¹⁸ nitelendirdi.
5. , Klorin ve fosfat seviyeleri kontrol, 0.01, 0.1 ile aynı deney sonuçlarını ve sırasıyla 5, 50 ve 500 mM stoklar kullanıldığında NaCl NaH ₂ PO ₄ çözeltinin 1.0 mm'dir.
6. Zar Verileri Analiz:
   1. zar ıslak ağırlığı ve kuru ağırlığı arasındaki farkı belirleyerek pelikül hidrasyon hesaplayın.
   2. İstatistiksel analiz için her bir biyolojik çoğaltmak için tek bir değer elde etmek için tüm teknik çoğaltır değerlerinin ortalamasını alın. Tukey çoklu karşılaştırma testi ile tek-yönlü ANOVA ile tedavi karşılaştır. Farklılıklar p eğer <0.05 anlamlı bulunmaktadır.
   3. Tedavi edilmeyen kontrollerin yüzdesi olarak veri normalleştirmek ve biyolojik çoğaltır araçları arsa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Üçlü cevap testi ile SH ortamında CEPA etilen kurtuluş (pH 7) doğrulanması için bir şematik plaka kurulum Şekil 1A gösterilmiştir - C. Zar protokolünü gösteren bir akış şeması Şekil 2'de Koyu-yetişkin A. gösterilir thaliana fideler ACC mevcudiyetinde ve SH ortamı Cepa ayrışma yoluyla üretilen etilen (pH 7) varlığında üçlü cevap fenotipi (abartılı apikal kancalı daha kısa ve daha k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada tarif edilen yöntemler modeli organizma, K. kullanılarak bakteriyel etilen tepkisinin incelenmesi için CEPA etilenin in situ üretimini anahat xylinus. Etilen bir pH'a CEPA saf etilen gazı veya özel laboratuar ekipmanı ihtiyacını ortadan sahip daha büyük 3.5 ^10,11 sahip herhangi bir sulu ortam ilave üretilebilir Bu yöntem çok yararlıdır. Bu yöntem, bakterilerin Cepa türetilmiş Etilenin etkilerini incelemek ile sınırlı değildir, aynı zamanda ökaryot...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC)	Sigma	A3903	Biosynthetic precursor of ethylene in plants
4-sector Petri dish	Phoenix Biomedical	CA73370-022	For testing triple response
Agar	BioShop	AGR001.1	To solidify medium
Canon Rebel T1i DLSR camera	Canon	3818B004	For pictures of pellicles
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921	Sigma	C2730	Aqueous solution
Citric acid	BioShop	CIT002.500	For SH medium
Commercial bleach	Life Brand	57800861874	Bleach for seed sterilization
Concentrated HCl	BioShop	HCL666.500	Hydrochloric acid for pH adjustment
Digital USB microscope	Plugable	N/A	For pictures of colonies
Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid)	Sigma	C0143	Ethylene-releasing compound
Glucose	BioBasic	GB0219	For SH medium
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582	ATCC	53582	Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium
Microcentrifuge tube	LifeGene	LMCT1.7B	1.7 ml microcentrifuge tube
Murashige and Skoog (MS) basal medium	Sigma	M5519	Arabidopsis thaliana growth medium
Na2HPO4·7H2O	BioShop	SPD579.500	Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium
NaCl	BioBasic	SOD001.1	Sodium chloride for saline and control solution
NaH2PO4·H2O	BioShop	SPM306.500	Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution
NaOH	BioShop	SHY700.500	Sodium hydroxide for pH adjustment
Paraffin film	Parafilm	PM996	For sealing plates and flasks
Peptone (bacteriological)	BioShop	PEP403.1	For SH medium
Petroff-Hausser counting chamber	Hausser scientific	3900	Bacterial cell counting chamber
Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm	VWR	28145-501	For sterilizing cellulase
Sucrose	BioShop	SUC600.1	Sucrose for MS medium
Yeast extract	BioBasic	G0961	For SH medium