İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Özet

Burada katı tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran amaçlayan bir protokol açıklar. Bu hedefe, biz RNA seq ile ebeveyn ve in vitro dirençli modellerin transkriptomik profillerini analiz ve aday genler doğrulamak için bir QRT-PCR tabanlı bir yöntem kurdu.

Özet

İlaç direnci hematolojik malignanlıklar ve katı tümörlerin her ikisi için, kanser tedavisinde önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Intrinsik ya da kazanılmış direnci artan ilaç eleme dahil mekanizmalar, bir dizi neden olabilir, ilaç alımını, ilaç inaktivasyonunu ilaç hedefleri değişiklikler azalmıştır. Son veriler, diğer daha iyi bilinen genetik (mutasyon, amplifikasyonu) ve epigenetik (DNA hipermetilasyonu histon post-translasyonel modifikasyon) modifikasyonlarla, ilaç direnci mekanizması, aynı zamanda birleştirme sapmaları ile düzenlenir olabileceğini göstermiştir. Bu daha etkili tedavi yaklaşımları planlamak için gelecekte dikkat edilmesi gereken soruşturma hızla büyüyen bir alandır. Bu yazıda anlatılan protokol solid tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran hedefleniyor. Bu hedefe, biz RNA seq ve kurmak yoluyla in vitro modellerinde bazılarının transkriptomik profillerini analized bir QRT-PCR tabanlı yöntem aday genleri doğrulamak için. Özellikle, DDX5 ve PKM'si kopyasının farklı kesilmesinden değerlendirildi. hesaplamalı araç PASPASLARI tarafından tespit edilen anormal yapıştırma farklı DDX5 ekleme varyantları ebeveyn vs dirençli hücrelerde ifade gösteren, lösemi hücrelerinde doğrulanmıştır. Bu hücrelerde, daha da gemsitabin maruz kalma ile tetiklenen ilaç direnci farklı mekanizmayı göstermektedir ebeveyn Panc-1 hücreleri ile karşılaştırıldığında Panc-1 gemsitabin dayanıklı muadili saptanmadı yüksek Pkm2 / PKM1 oranı, gözlendi.

Giriş

Kanser tedavisinde, kemoterapi malign hücrelerin direnci, ya içsel ya da uzun süreli ilaç maruziyeti üzerine edinilen önemli gelişmelere rağmen, lösemi ve solid tümörlerin ¹ geniş bir yelpazede tedavi başarısızlığı için en önemli nedenidir.

In vitro hücre hattı modellerinde ilaç direncini altında yatan mekanizmaları nitelendirmek için kemoterapötik maddelerin dirençli kanser hücrelerinin adım adım seçimi ile geliştirilir. Bu prosedür klinik ortamlarda kullanılan rejimleri taklit ve bu nedenle ilgili direnç mekanizmaları derinliği soruşturma sağlar. Tedavi hayatta dirençli hücreler daha sonra hücre canlılığı / sitotoksisite deneyleri ² kullanılarak ebeveyn duyarlı hücrelerden ayırt edilir. Birincil hücrelerin in vitro ilaç direnci profilleri kemoterapi ³ klinik yan önemli ilgili olduğu gösterilmiştir.

Yüksek verim cytotoxicity deneyler, in vitro ilaç duyarlılığını belirlemek için uygun bir yöntem teşkil etmektedir. Burada, hücre canlılığı ile değerlendirilir, örneğin 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolyum bromür - yani, belirli alt tabakalar metabolik dönüşüm (dayanır MTT deneyi ^4, böylece, hücrelerin mitokondrial faaliyeti yansıtan renkli ürünlere tetrazolyum tuzlarının kullanımı). Alternatif olarak, hücresel protein içeriğini sülforhodamin B (SRB) deneyi ⁵ kullanılarak belirlenebilir. Burada, yaşayabilir hücrelerin sayısı gerek olmadan, bir spektrofotometre, uygun bir dalga boyunda ölçülen optik yoğunluk (OD) ile orantılıdır yaygın ve zaman alıcı bir hücre sayımı işlemleri. Belirli bir kemoterapötik ilaç ile uyarılan büyüme inhibisyonu hücreleri test maddesi ile muamele edilmiş ve muamele edilmemiş kontrol hücrelerinin OD ile karşılaştırıldığı kuyu OD göre hesaplanabilir. Bir doz-tepki eğrisi obta olankontrol hücrelerine göre canlı hücre yüzdeleri karşılık ilaç konsantrasyonu işaretlenmesiyle çağırın. Son olarak, ilaç duyarlılığı tedavi edilmemiş hücrelere _(IC50) ile kıyaslandığında hücre büyüme inhibisyonu% 50 ile sonuçlanan konsantrasyon olarak kaydedilmiştir.

ilaç direncinin altında yatan mekanizmalar, ilaç etkinliği ve hücresel metabolizma belirleyicilerinin gen ifadesini etkileyen değişiklikler gibi pek çok farklı anormallikleri içerir. Mutasyonlar, aberasyonların bir transkripsiyonel olarak ve post-transkripsiyonel seviyede yanı sıra rahatsız epigenetik düzenlemeler de dahil olmak üzere, bu moleküler lezyonlar genellikle ilaç metabolizması ya da apoptoz ⁶ ya oynayan genleri etkiler.

Alternatif pre-mRNA ekleme ve karmaşık düzenleme son zamanlarda kanser hücrelerinin ⁷ ilaç direnci dikte edebilir bir roman varlık olarak önem aldık. İnsan genlerinin% 95 a kadar, alternatif olarak, bu aracılığıyla normal hücrelerde birleştirilirAynı genin birçok farklı protein izoformları üreten sıkıca düzenlenmiş süreç. Alternatif yapıştırma genellikle kanser deregüle ve birkaç tümör ilaç metabolizmasında (örn, deoksisitidin kinaz, folylpolyglutamate sintetaz, veya çoklu ilaç direnci proteini) ^6,8 katılan genlerin artan sayıda değişik ekleme mekanizması ile karakterize edilir. Bununla birlikte, ilaç dirençli hücrelerin yapıştırma profillerinin kapsamlı bir analiz acı eksiktir. Nedenle, bir alternatif birleştirme analizi için yüksek verimli yöntemlerin geliştirilmesi zorunludur. Bu daha etkili tedavi yaklaşımları geliştirmeye yardımcı olabilir.

Son on yılda, yeni nesil dizileme (NGS) teknolojilerinin hızla gelişmesi genom ifade düzenlenmesini ve çeşitli biyolojik süreçler ⁹ rollerini yöneten moleküler mekanizmaları içine yeni anlayışlar ile biyomedikal araştırmalar zenginleştirdi. RNA dizi (RNA DİZ) güçlü bir alt uygulamadırtranskriptomik alanında NGS arasında. Bu, miRNA, siRNA ve diğer küçük RNA (nitelik ve nicelik) aynı anda binlerce gen ifadesi desen bir genom profil izin verir ve iyi roman kodlama mRNA karakterizasyonu için uygun hem de uzun olmayan kodlama RNA sınıflar (örneğin, snRNA ve piRNA) ^10,11.

RNA Seq transcriptome karakterizasyonu (örneğin, Sanger dizileme ve anlatım mikroarray'ler) önceki teknolojilere göre birçok avantajı vardır. Bu mevcut genom açıklama dayalı değildir, bu kararın bir tek nükleotid düzeyi vardır ve ekspresyon seviyesi tahmini için daha geniş bir dinamik aralığı vardır. Kısaca, RNA DİZ deneyler temel deneysel akışı cDNA kütüphane yapımı ve son olarak, yoğun paralel derin sıralama ^12,13 dönüşüm ve ardından poliadenile transkript (mRNA) seçimi ve parçalanma meydana gelir. Nedeniyle sequencin hızlı düşüşSon birkaç yıldır, RNA-seq üzerinde g maliyetleri yavaş yavaş diğer teknolojiler yerini almaktadır ve önemli çabalar kütüphane hazırlık protokolleri geliştirmek için yapılıyor. Örneğin, deoksiüridin trifosfat (dUTP) ve önceki PCR amplifikasyonu, urasil-DNA glycosilase (Yeraltı) ile işaretli olan iplikçik sindirilmesi ile ikinci dizi cDNA, işaretleyerek mRNA transkriptlerinin şerit bilgilerini korumak için mümkündür. Bu süreç ekspresyon düzeyleri ^14,15 gen açıklama ve tahmin doğruluğunu artırır.

Analiz ve RNA-seq verilerin yorumlanması biyoinformatik boru hatları ^16,17 içinde karmaşık ve güçlü hesaplama yazılım paketleri ve işlem gerektiren. İlk olarak, ham sıkı kalite gereksinimlerini ulaşamayan dizileri, teknik ve biyolojik eserlerin çıkarılması ve atılması (kesim) tarafından kalite kontrol sürecinden okur. Daha sonra bir referans genom eşleştirilir ve endekslidir her bir örnek için okurGen düzeyinde, ekson düzey ya da transkript düzeyinde içine sırayla her kategorinin bolluğu belirlemek için. Uygulamaya bağlı olarak, rafine edilmiş veriler daha sonra alel-spesifik ekspresyonu, alternatif uç uca eklenmesi gen füzyonu ve tek nükleotid polimorfizmlerin ^{(SNP), 12} tanımlanması için istatistiksel model hesaplanmıştır. Son olarak, seçilen seviyeye (yani, gen ekspresyonu veya alternatif ayırma) ile diferansiyel analizi, farklı koşullar altında elde edilen örnekleri karşılaştırma için kullanılabilir.

Diferansiyel yapıştırma analizi iki örnek arasındaki ekleme sitesi kullanımında farklar açıklanır. Bu amaçla ayrılmış yazılım paketleri giderek artan sayıda, farklı istatistiksel modeller, performans ve kullanıcı arayüzü ¹⁸ dayalı bulunmaktadır. Bunlar arasında, PASPASLAR (Transkript yapıştırma değişkenli Analizi) Bayes istatistiksel çerçeveye dayalı bir serbestçe kullanılabilir ve kesin hesaplama aracı olarak ortaya çıkmaktadır ve farklılık sorumluluk yönün tespit etmek için tasarlanmıştek veya eşli uç RNA-seq veri birinden rential yapıştırma olayları. Hizalanmış (.bam) dosyaları başlayarak, MATS alternatif birleştirme olayları tüm önemli türleri algılayabilir (ekson atlama, alternatif 3 'splice site alternatif 5' splice site birbirini dışlayan ekson ve intron tutma - Ayrıca bakınız Şekil 1).

İlk olarak, yazılım tanımlar örneğin ekson atlama için, belirli bir ekleme olayı destekleyen okur ve iki tip bunları sınıflandırır. incelenen ekson içinde harita ve belirli ekson ve iki memba ve mansap yan ekzon arasındaki kavşaklar yayılan (kanonik ekleme olayı için) "İçerme okur". İki yan ekzon arasındaki kavşak yayılan (alternatif bağlantı olayı için) "atlanıyor okur". Daha sonra, MATS hem kurallı ve alternatif etkinlikler için normalize içerme seviyesini döndürür ve numune veya koşulları arasındaki değerleri karşılaştırır. Sonuçta, bu P-değeri a hesaplarnd yanlış keşif oranı (FDR) iki durum arasında bir genin varyantı oranında fark her ekleme olayı ^19,34 için belirli bir kullanıcı tanımlı eşiği aşan varsayarak.

RNA seq ile birlikte diferansiyel yapıştırma analizi takiben, geniş bir deneysel doğrulama gerçek pozitif gen adayları ¹⁸ belirlemek için garanti edilir. Kantitatif ters transkribe-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) RNA Sekans analizi ²⁰ elde edilen aday doğrulama en yaygın olarak kullanılan ve en iyi yöntemdir. Bu yazının amacı solid tümörlerin ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci ile ilişkili birleştirme profilleri araştırmak için sağlam bir metodoloji sağlamaktır. Yaklaşımımız ilaç direnci belirtilen genler onaylanması için kurulmuş bir QRT-PCR yöntemi ile kombinasyon halinde ilaç dirençli kanser seçilen hücre hattı model RNA seq göre transcriptome profil kullanmaktadır.

Bu çalışmada kullanılan insan lösemi hücre hattı modelleri çocuk T hücre akut lenfoblastik lösemi dahildir (T-ALL) hücre çizgisi CCRF-CEM (CEM-WT), iki glukokortikoid (GC) dayanıklı alt klonlar CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) olup, CEM-C7R5 (CEM-R5) ^21,22 ve metotreksat (MTX) -dirençli subline CEM / R30dm ^23. GCS, MTX göre mevcut tedaviler vakaların yaklaşık% 90, klinik fayda oluşturulması da, GC-direnç ortaya hala açık molekül mekanizma ile çözülmemiş bir sorun teşkil etmektedir. GC dayanıklı alt klonları izole etmek için, CEM-WT, hücreler, 2 ila 3 hafta içinde 1 uM deksametazon (Dex) 'de kültürlenmiştir. MTX dirençli subline CEM / R30dm tekrarlanan kısa dönem (24 saat) klinik protokollere bir taklit olarak 30 uM MTX CEM-WT hücrelerinin maruz kalma yoluyla geliştirilmiştir. İlginç bir şekilde, Bu hücre hattı ayrıca mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir olan Dex çapraz direnç (yayınlanmamış sonuçlar) görülür.

katı tumya da bu çalışmada incelenen modelin kemoterapiye olağanüstü refrakterliği için ünlü pankreatik duktal adenokarsinom vardır. Bu amaçla, Panc-1 hücre çizgisi ve ilaç ²⁴ 1 uM sürekli inkübe etmek suretiyle elde edilen kendi gemsitabin dayanıklı alt klon Panc-1 R seçilir. Burada üç protokolleri birleştirerek in vitro ilaç direnci yatan yeni mekanizmalarını keşfetmek için bir yaklaşım açıklanmaktadır: kolorimetrik sitotoksisite deneyleri ile ilgili yeni uç uca eklenen varyantları belirlemek için lösemik hücreler ve katı tümörler, RNA seq göre boru kanser hücrelerindeki ilacın duyarlılığını değerlendirmek için ilaç duyarlılık / direnç ve RT-PCR ve QRT-PCR analizi potansiyel adayları doğrulamak için.

Protokol

Sitotoksisite Tahliller aracılığıyla İlaç Direnci Profilleri 1. Karakterizasyonu

1. Lösemi Hücre Hattı Kültürü
   1. Ebeveyn T-hücresi ihtiva eden 10 ml RPMI-1640 ortamı içinde 25 cm ^2'deki tüm hücre çizgisi CCRF-CEM (CEM-WT) ve CEM / R30dm, CEM-R5 ve CEM-C3 de dahil olmak üzere ilaca dirençli alt hatları, bakımı 2.3 uM folik asit,% 10 fetal dana serumu ve 100 birim / ml penisilin G ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiştir.
   2. Kültür, bir% 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de nemli bir atmosferde hücreleri.
   3. 3 x 10 ⁶ hücre / ml - 2 arasındaki konsantrasyonlarda hücre büyümesini bekleyin.
   4. 0.3 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir başlangıç konsantrasyonunda, haftada iki kez hücreleri bölme (örneğin, hücre yoğunluğu, 3 x 10 ⁶ hücre / mL, 9 mL taze ortam içeren yeni bir şişeye transfer 1 ml hücre süspansiyonu ise). 20 ardışık pasajlar sonra kültür atın.
2. Pankreas karsinoma hücre hattı Kültür
   Not:% 10 fetal bovin serumu ve 100 birim / ml penisilin G ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş, yüksek glikoz ve L-glutamin ile 10 mi DMEM ortamı içinde 75 ^cm2'lik kültür şişelerinde insan pankreas kanseri hücre çizgisi Panc-1 Bakım . ilaca dirençli varyantı, Panc-1 R, steril su içinde çözülmüş 1 uM gemsitabin içeren aynı kültür ortamı içinde kültürlenir. Daha fazla detay ²⁴ temin edilmiştir.
   1. Kültür, bir% 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de hücreler.
   2. Hücreler, yaklaşık% 90 birleştiği ulaştığında 5: 1 bir oranda - 3 gün, her 2 hücreleri Böl.
   3. Hücreleri ayırmak için, fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkama 75 cm ² kültür şişesi başına tripsin / EDTA 1 ml ilave edilir ve 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   4. 9 mi ortamı ilave edin ve 15 ml'lik bir tüp içinde müstakil hücreler hasat edilir. Yeni bir şişe conta Tohum 2 ml hücre süspansiyonuining 8 mi ortamı. 20 ardışık pasajlar sonra kültür atın.
3. Lösemi hücrelerinin MTT testi
   1. Önceden MTT çözeltisi hazırlayın: yaklaşık olarak 1 saat boyunca manyetik bir karıştırıcı ile 500 10 ml PBS içinde MTT formazana mg ve (ışıktan korunmuş olarak) karıştırın çözülür. 0.22 um filtre ile çözelti sterilize edin. NOT: Çözelti -20 ° C'de 10 mi alikotlar içinde muhafaza edilebilir. çözdürme sonrası direkt ışıktan koruyunuz.
   2. Önceden asitleştirilmiş izopropanol hazırlayın: izopropanol 2.5 L 2 M HCI 50 ml ekleyin. NOT: Kullanmadan önce oda sıcaklığında en az bir ay için çözüm saklayın. izopropanol doğru asitleştirildi değilse, bu ortam ile çökelti oluşturulması ve spektrofotometrik okuma tehlikeye atabilir.
   3. Hücre hattı başına 3 ila 6 kuyu ayırmak büyüme 30 ul: Ayrı bir 96-gözlü düz dipli Hazırlama "Gün 0" (kontrol) plaka büyüme inhibisyonu daha doğru bir tahmin sağlamak üzereorta ve boşlukları (hücre yok) 'e uygun oyuklara büyüme ortamının her bir 150 ul başına hücre süspansiyonu (8.000 hücre) 120 ul. Optik yoğunluk (OD) ölçmek için, bu bölümün 1.3.13 adım adım 1.3.9 devam edin. NOT: Diğer ayrıntılar ^4'te verilmiştir.
   4. (Ilaç konsantrasyonlarına 30 kuyu (10 konsantrasyonları, üç kopya halinde her biri), kontrol hücrelerine 10 kuyu ve hücreler (boşlukları) olmadan kontrol ortamı 10 kuyu ayırmak ve deksametazon ilaç seyreltme aralığı hazırlanması: 96-gözlü düz dipli deney plakası hazırlayın bir çözücü olarak, dimetil sülfoksit kullanılarak Dex).
      Not: CEM-WT hücreleri için Dex seyreltme aralığı 2 uM ve 0.97 nM arasındadır. CEM / R30dm, CEM-R5 ve CEM-C3 hücreleri için Dex seyreltme aralığı 640 uM ve 0.33 nM arasındadır.
   5. 96 gözlü plakanın uygun bir kuyuya her Dex seyreltme 30 ul ekle. Bir üçlü olarak her konsantrasyonu içerdiğinden emin olun.
   6. büyüme ortamı 30 ul ekle dehücrelerini ve boşlukları karşılık gelen oyuklara büyüme ortamı 150 ul kontrol karşılık gelir.
   7. Hasat katlanarak optimal tohumlama konsantrasyonda hücreleri ve tekrar süspansiyon büyüyor.
      Not: iyi başlangıç ​​hücresi konsantrasyonlarını belirlemek için, birden konsantrasyonlarda hücrelerin ekim ve en az 4 gün boyunca günlük olarak ölçülmesi ile, 96 oyuklu bir plaka içerisinde her bir hücre hattı hücre kuşağının büyümesinin profilini değerlendirmek için tavsiye edilir. Bu OD değerleri doyurarak deneyi etkileyecektir olarak, 72 saat sonra hücrelerin üremesine engelleyen bir tohumlama konsantrasyonunu seçin. CEM / R30dm için / kuyu 5.000 hücreleri ise CEM-WT, CEM-C5 ve CEM-R5 için optimum ekim konsantrasyonu, 8.000 hücre / kuyu olduğunu.
   8. ilaç içeren her kaba çözelti ya da büyüme ortamına hücre süspansiyonu 120 ul ekle (kuyu kontrol hücrelerine karşılık gelir). plaka iyi nem sağlamak ve inci inkübe 150 ul PBS ile plaka boş dış kuyu doldurunbir hücre kültür inkübatörü içinde,% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de 72 saat e plakalar.
   9. Her kuyucuğa MTT çözeltisi 15 ul ekleyin ve / dakika, 900 sallar en fazla plaka karıştırıcısı kadar 5 dakika boyunca plaka çalkalayın.
   10. Bir hücre kültür inkübatörü Lütfen% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de tabak yerleştirin ve diğer 4 inkübe edin - 6 saat.
   11. her kuyuya asitleştirilmiş izopropanol 150 ul ekleyin ve iyice tüm formazan kristalleri tekrar süspansiyon çok kanallı pipet ile iyice karıştırın. boş kuyular ile başlayın ve plaka başka bir satıra geçmeden önce ipuçlarını durulama emin olun.
   12. 10 dakika süre ile oda sıcaklığında (RT) plaka inkübe edin.
   13. Bir mikrolevha okuyucu kullanılarak, arka plan OD düzelterek doğru bir ölçüm sağlamak için, 540 ve 720 nm 'de OD belirler. Sonra tablo dosyasındaki verileri kaydetmek ve ⁴ analiz edin.
4. SRB testi pankreas karsinomu hücreleri için
   1. % 0.4 son konsantrasyonda% 1 asetik asit içinde SRB reaktifi çözülür (a / h).
   2. % 50 son konsantrasyonda, aşırı saf su içinde trikloroasetik asit (TCA) çözündürün (a / h).
   3. 10 mM son konsantrasyonda, aşırı saf su içinde tris (hidroksimetil) -aminometan çözülür.
   4. Uygun tohum konsantrasyonda 100 ul ortam içerisinde üstel fazında büyüyen hücreler tohum 6 kuyu sadece kuyu tekabül eden 100 ul ortam ekleyin: Büyüme inhibisyonu daha doğru bir tahmin sağlamak üzere, ayrı bir 96-gözlü düz tabanlı "Gün 0" kontrol plakası hazırlayın boşlukları. Plakasına hücrelerin düzgün yapışmasını sağlamak için% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de bir gece boyunca inkübe edilir. Daha sonra tüm oyuklara 100 ul ortamı ilave edin ve adım 1.4.8 devam - bu bölümün 1.4.16.
   5. 96-gözlü düz dipli deney plakası hazırlayın: Tohum hücreleri benim 100 ul uygun bir yoğunlukta 96 kuyucuklu üç kopya üstel fazda düz tabanlı plakaları artanÇok kanallı bir pipet kullanılarak dium.
      Not: iyi başlangıç ​​hücresi konsantrasyonlarını belirlemek için, birden konsantrasyonlarda hücrelerin ekim ve en az 4 gün boyunca günlük olarak ölçülmesi ile, 96 oyuklu bir plaka içerisinde her bir hücre hattı hücre kuşağının büyümesinin profilini değerlendirmek için tavsiye edilir. Bu OD değerleri doyurarak deneyi etkileyecektir olarak, 72 saat sonra hücrelerin üremesine engelleyen bir tohumlama konsantrasyonunu seçin. Panc-1 ve Panc-1 R hücreleri için uygun tohumlama konsantrasyonu / oyuk 8000 hücredir.
   6. Orta yalnızca gözlere 100 ul ortamı ilave edin ve plakaya hücrelerin düzgün yapışmasını sağlamak için% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de bir gece boyunca inkübe edilir.
   7. Panc-1 ve 1 mM ve Panc-1 R hücreleri için 100 nM 1 um ve 10 nM arasında gemsitabin ilaç seyreltme aralığı hazırlayın. Çok kanallı bir pipet kullanılarak 96 oyuklu plakanın uygun bir kuyuya her çözücüden 100 ul ekle. üç nüsha halinde her konsantrasyona sahip olduğundan emin olun. Ek olarak,orta yalnızca kuyu ve kontrol hücrelerine, 100 ul ortam ilave edin. 72 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir.
   8. çökeltilmesi ve kuyu altındaki proteinleri düzeltmek için, 4 ° C'de en az 60 dakika boyunca plakalar bir çok kanallı pipet ile gözlere 25 ul soğuk TCA solüsyonu eklenir ve inkübe edilir.
   9. Bir doku üzerinde orta ve kuru kısaca kaldırarak plakayı boşaltın.
   10. musluk suyu ile 5 kez yıkayın, daha sonra plaka boşaltın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
   11. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca tekrar-pipeti ve leke kullanarak oyuk başına 50 ul SRB çözeltisi ekleyin.
   12. SRB leke kaldırarak plakayı boşaltın.
   13. % 1 asetik asit ile 4 kez yıkayın, daha sonra plaka boşaltın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
   14. Çok kanallı bir pipet kullanılarak göz başına 150 | il Tris çözeltisi ekleyin ve / dakika, 900 sallar en fazla plaka karıştırıcısı yukarı 3 dakika boyunca karıştırın.
   15. 540 nm (ya da 492 nm eğer optik yoğunluk Oku to) değerleri çok yüksek OD.
   16. verileri analiz edin.
5. MTT ve SRB Tahliller için Veri Analizi
   1. Aşağıdaki formülü kullanarak "Gün 0" hücrelerin OD değerlerini hesaplayın: OD _{Gün 0} = OD _{kontrol hücreleri} - Ortalama OD _{boş kuyular}
   2. Aşağıdaki formüle göre, her bir ilaç konsantrasyonu için hayatta kalan hücrelerin yüzdesini hesaplayın:% muamele edilmiş hücreler = Ortalama [OD _{işlenmiş hücreler} - Ortalama OD _{Boş kaplar} - OD _{Gün 0]} / [OD _{kontrol hücreleri} - ortalama OD _{Boş kaplar} - OD _{0 Gün]} * 100
   3. Doz-yanıt eğrisi (% olarak büyüme inhibisyonu genel ilaç konsantrasyonu) çizilir.
   4. Doz-yanıt eğrisi kullanılarak% 50 hücre büyümesini inhibe eden bir ilaç _(IC50) konsantrasyon hesaplanır.

RNA sıralaması için 2. RNA İzolasyonu ve Kütüphane hazırlanması

1. örnek Collection ve RNA izolasyonu
   1. CEM hücreleri için: kültür ortamı doğrudan 10 ⁶ hücre hasat.
   2. Panc-1 ve Panc-1 R için: orta kaldırmak PBS ile iki kez yıkama hücreleri ve tripsin-EDTA ilave edilir ve 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek çıkarın. Kültür ortamı ekleyin ve 10 ⁶ hücre hasat.
   3. 3 dakika boyunca 300 xg'de örnekleri aşağı Spin süpernatant kaldırmak ve üreticinin protokolü takip ederek, piyasada mevcut silis membran dönüş sütunlarını kullanarak toplam mRNA ayıklayın.
   4. UV-Vis kullanılarak toplam RNA yoğunluğu ve saflığı, belirler.
      NOT: 260 nm / 280 nm absorbans oranı 1.8 üzerinde ise RNA yüksek saflıkta kabul edilir. - 80 ° C örnekler saklanabilir.
   5. etidyum bromür ile boyanmış% 1 agaroz jeli üzerinde numunenin 200 ng elektroforez ile total RNA bütünlüğü değerlendirin.
      NOT: yaklaşık memeli 28S ve 18S rRNA karşılık gelen iki sağlam bantların tespit2 kb ve iyi total RNA bütünlüğünün göstergesi olan boyutu 1 kb.
2. Ardışık Kütüphane hazırlanması
   1. Her bir numune başına toplam mRNA 2 mikrogram kullanın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, mRNA kütüphane preparasyonu protokolü takip edin.
   2. Bir Bioanalyzer sistemini kullanarak her kütüphane kalitesini ve konsantrasyonunu belirlemek. 10 nmol / L'lik bir son konsantrasyona kadar tek bir örnek kütüphaneler Havuz ve Bioanalyzer ile ölçülür.
   3. Tek Oku 100 bp modu ile yüksek verim sıralama sistemi kullanın.
      Not:> 80 bp Gör uzunluğu transkripsiyonel izoformları belirlenmesi için gereklidir.

Diferansiyel yapıştırma 3. Algılama Sıralama okur gelen

1. Hizalanması Genom ve Kalite Kontrolü Referans için okur
   1. UCSC tablo tarayıcı (25963 genler) kullanılarak NCBI refGene tablodan bir gen açıklama (.gtf dosyası) Derleme.
   2. yapmaksıralamanın açıklama farkında boşluklu hizalama YILDIZI kullanarak referans genom (GRCh37) için okur.
   3. Sıralama ve dizin picard araçları ile sonuçlanan hizalama dosyaları.
   4. RSeQC ve samtools kullanarak post-haritalama kalite kontrolü gerçekleştirin.
2. Örnek Gruplar arasındaki fark Ekleme Algılama
   1. Python ve numpy ve SciPy karşılık gelen sürümlerini yükleyin. Indirin ve samtools yükleyin. Indirin ve papyon ve Tophat yüklemek,
   2. $ PATH ortam değişkeni Python, papyon, tophat ve samtools dizinleri ekleyin. İndir önceden yapılmış papyon indeksleri (hg19). rMATS sürüm 3.0.9 indirin.
      Not: rMATS ile ilgili diğer ^{ayrıntılar, 19} ve ^34'de verilmiştir.
   3. Şekil 5A göre çalışır ayrı paspaslar Panc-1R için CEM-WT ve Panc-1 Her Dex dirençli hücre hattı karşılaştırarak alternatif ekleme olayları algılar.
   4. onceki ayırıcı bölme olaylarının tespit etmek içinusly hizalanmış sıralama (.bam dosyaları), Panc- CEM-WT vs CEM- C3, CEM-WT vs CEM-R5, CEM-WT vs CEM / R30dm ve Panc1 Şekil 5B gelen komutları kullanarak çalıştırmak Mats okur 1R karşılaştırmalar.
      NOT: MATS analiz yapıştırma olayın türüne göre sonuçları ile iki .txt dosyaları ile bir çıkış klasörü oluşturacaktır (SE - ekson atlama, A5SS - Alternatif 5 'splice sitesi, A3SS - Alternatif 3' splice sitesi, MEX - birbirini dışlayan ekzon ve RI - intron tutma): bir dosya içeren kavşak sayımları sadece ve kavşak sayımları dayalı sonuçlar ile ikinci dosyaya dayalı sonuçlar ve hedefe okur. Ayrıca, bir sonuç bakış ile ek bir txt dosyası aynı klasörde oluşturulur.
   5. SE, A5SS, A3SS ve UR ​​ithalat kavşak sayımları dayalı .txt dosyalarını e-tablolar ve hedefe okur için. MEX için bağlantı sayıları sadece dayalı .txt dosyalarını içe.
      NOT: Gen kimliği, gen sembolü: PASPASLARI çıktı dosya P-değerleri ve artan göre sıralanır birkaç parametre içerir, Kromozom ve iplik pozisyonu, alternatif olarak eklenmiş parçaları genomik koordinatları, dahil uzunluğu yanı sıra sayar ve (her ikisi de analiz numune için formlar, dahil uzunluğunu atlama ve normalleşme, p-değeri, yanlış keşif oranı için kullanılan formu atlama FDR ), normalize sayıları ve diferansiyel içerme skoru (ortalama (IncLevel1) dayalı her bir numune alınma düzeyi - ortalama (IncLevel2)).
   6. Bir FDR (örn DDX5 ve Pkm2) için% 10 ile istatistiksel olarak anlamlı aday genler seçin.
   7. Bütünleştirici Genomik Viewer ile alternatif birleştirme olayları gözünüzde canlandırın (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), Şekil 5'de bildirildi.

RT-PCR ve QRT-PCR Tahliller Sonuçlarının 4. Doğrulama

1. primer Tasarım
   NOT: biyoinformatik boru hattı mRNA trans kullanılarak elde edilen sonuçların, güvenilir bir doğrulama sağlamak içinAlternatif yapıştırma olayların bir sonucu yazması kitaplar, RT-PCR kullanılarak amplifiye PCR ürünleri agaroz jel elektroforezi ile görselleştirilmiştir. Yeşil QRT-PCR deneyi, özel bir ek yeri ölçmek için kullanılan örneğin SYBR olarak Siyanin yeşil boya bir ev bakıcısı geni göreli varyantları. Şekil 7 DDX5 geninin ekson 12 atlama olayı görselleştirmek için ve PKM geninin birbirini dışlayan ekson 9 ve ekson 10 ölçmek için uygulanan stratejiyi göstermektedir.
   1. RT-PCR deneyi için, geri yönünde yer alan yapısal ekzon (ekzon 10 ve ekzon 13) ve aşağı doğru bir alternatif birleştirme bölgelerinin (Şekil 7A) olduğu tavlama tasarım primer çiftleri.
      Not: amplikon boyutu agaroz jeli üzerinde öngörülen PCR ürünlerinin net bir ayrım sağlamak amacıyla, 100 ila 800 bp kapsamalıdır. % 60 geçmemelidir C GC içeriği 55 ° ila 65 primerlerin bağlanma sıcaklığı olmalıdır.
   2. Siyanin yeşil deneyi (Şekil 7B).
      1. İki birbirini dışlayan ekson ve her biri özel olarak tasarımı iki primer çiftleri dizisi homoloji kontrol edin ve münhasıran sadece iki ekleme varyantları biri algılar.
         NOT: ileri primerler varyant özgü ve tavlama 9 (PKM1) ekson veya ekson 10 (Pkm2) ise PKM için, ters primer, her iki varyant ortak 11'e ekson tavlarıdır.
      2. DDX5 tam uzunlukta geni tespit etmek için, atlanan ekson (ekson 12) içinde geriye doğru primer tavlama.
         NOT: DDX5 ΔEx12 varyantının spesifik tespiti için, ters primer exon11 / exon13 sınırını kapsamaktadır. Her iki reaksiyonlar için kurucu ekson 10 tavlarıdır aynı ileri primer kullanın.
         NOT: amplikon boyutu 80 ve 200 bp arasında olmalıdır.
2. İlk kol cDNA sentezi
   1. 200 U, Moloney kemirgen lösemi virüsünün / ml (M-MLV) Rever kullanılarak cDNA'ya izole RNA'nın 1 ug ters transkripsiyon ayarlamasteril su ile 5: olan reaksiyon tamponu içinde SE transkriptaz 1 seyreltilmiştir. DTT, 1 uM, rastgele heksamerlerin 0.05 ug, deoksinükleotid karışımı (dNTP) 1 mM, ve ribonükleaz inhibitörünün 40 U / ul ekle.
   2. Vortex kısa ve 2 saat boyunca 37 ° C'de, reaksiyon karışımı inkübe edin.
   3. 5 dakika, ters transkriptaz inaktive buz karışımı aktarın ve bir mikrosantrfuj kullanılarak döndürülür ve 70 ° C'de, reaksiyon karışımı inkübe edin. Örnekler hemen kullanılabilir ya da saklanabilir - 20 ° C.
3. RT-PCR reaksiyonu ve agaroz jel
   1. 2x 12.5 ul karıştırılarak, her numune başına bir PCR tüpü içinde, PCR reaksiyonu başlatacak PCR MasterMix, 10 uM ileri primer ve steril su ile 25 ul'lik nihai bir hacme kadar ters primer için aynı miktarda, 1.25 ul konsantre edildi.
   2. karışıma cDNA 1 ul ekleyin ve PCR tüpleri yerleştirin. aşağıdaki gibi programı çalıştırın: İlk denatürasyon: 2 dakika süreyle 95 ° C.35 döngü boyunca aşağıdaki adımları yineler: denatürasyon 25 saniye boyunca 95 ° C'de; 35 saniye için 52 ° C 'de tavlama; 1 dakika boyunca 72 ° C'de uzatma. 5 dakika boyunca 72 ° C'de son uzatma ayarlayın.
   3. TBE tampon 1x 100 ml agaroz 1 g çözülmesiyle,% 1 agaroz jel hazırlayın. çözeltiye etidiyum bromür 2.5 ul ekle. DİKKAT: etidyum bromür kanserojen bir kimyasal davlumbaz kullanarak dikkatli kullanın.
   4. Numune yükleme ve elektroforez sistemi yaklaşık 30 dakika boyunca 100 V'ta 1x TBE tamponu jel üzerinde çalıştırıldı.
   5. Dijital UV kamera ile jel açığa çıkarma ve görüntü kaydetmek.
4. Mah-PCR ve Veri Analizi
   1. kadar bir PCR tüpü içinde steril su ile 15 ul'lik nihai bir hacme kadar 2x yeşil PCR Mastermix 12.5 ul, 5 uM ileri primer 2 ul ve ters primer için aynı miktarda karıştırılarak, her numune başına Siyanin yeşil PCR reaksiyonu başlatacak . her bir spesifik ek yeri için bir karışım hazırlayınvaryantı (PKM1, Pkm2, DDX5 tam uzunlukta, DDX5 ΔEx12) ve temizlik geni için (GUS) tespit edilmesi.
   2. beyaz bir 96-kaynaklı tabaka üzerinde kaplanmıştır MasterMix yük ve her bir örnek başına çiftleri hazırlar.
   3. Suda cDNA 10x sulandırmak her karışıma 5 ul ekleyin ve PCR plaka yerleştirin. aşağıdaki gibi programı çalıştırın: İlk denatürasyon: 5 dakika süreyle 95 ° C. 45 döngü için aşağıdaki adımları yineler: denatürasyon 10 saniye boyunca 95 ° C'de; 58 ° (DDX5 ve DDX5 ΔEx12 karışımları) C ya da 20 saniye için (PKM1 ve Pkm2 karışımları), 60 ° C de tavlama. 20 saniye için 72 ° C 'de son uzatma ayarlayın. 65 97 ° C'ye kadar bir gradyan uygulayarak erime eğrisi ayarlayın.
   4. hedeflerine primer setleri özelliğinin değerlendirilmesi için, erime eğrilerinin kontrol etmek ve tek tepe noktasının, her bir primer set başına oluşturulan olduğundan emin olun.
   5. amplifikasyon eğrileri ikinci türev değerlerini hesaplamak ve çevrim eşik değerleri (Ct) ihracat.
   6. calculate mRNA birleşme göreli ekspresyon seviyeleri (İ) "ö Ct (ACt)" yöntemi kullanılarak her bir örnek GUS temizlik (referans) geni ile karşılaştırıldığında türevleri. Formülü şu şekildedir: REL = 2 ^{- ACt,} ACt = Ct _{hedef bağlantı varyantı} - Ct _{referans gen}
   7. Oran REL oranı = REL _{uç uca ekleme varyantı 1} / REL _{bağlantı varyantı 2:} ekleme varyantları göreceli bolluk ölçmek formülü kullanarak REL oranını hesaplamak için.

Sonuçlar

Protokolde tarif edilen sitotoksisite deneyleri, in vitro olarak kemoterapötik maddelerin kanser hücrelerinin direncini değerlendirmek için güvenilir ve sağlam bir yöntem sağlar. CEM / R30dm, CEM-R5 ve CEM-C3: MTT testi vasıtasıyla, Dex Duyarlılık Dex duyarlı ebeveyn CEM-WT hücreleri dahil olmak üzere dört T-ALL hücre çizgileri, ve üç Dex dayanıklı alt hatları belirlenmiştir. ve Dex dirençli hücre hatları (640 uM - 0.33 nM) - İki farklı konsantrasyon...

Tartışmalar

Burada ilaç direnci ile ilişkili olarak farklı birleştirme olayları tanımlamak için analizler köklü sitotoksisite tarama teknikleri ve güçlü NGS tabanlı transkriptomik birleştiren yeni bir yaklaşım açıklar. Spektrofotometrik analizler, in vitro kanser modellerinde ilaç duyarlılığını değerlendirmek için uygun ve sağlam yüksek verimlilik yöntemleri ve sitotoksisite gösterimleri yapan birçok laboratuvarlar için ilk tercih etmektedir. Bu yöntem için Giderme yanı sıra olası varya...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sulforhodamine B	Sigma-Aldrich	230162
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CRL-1469
DMEM high glucose	Lonza, Basel, Switzerland	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA	11875093
Fetal bovine and calf serum	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	758093
penicillin G streptomycin sulphate	Gibco, Carlsbad, CA, USA	15140122
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Sigma Aldrich	252859
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Netherlands		UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Greiner/Sigma	M0812-100EA
Trypsin/EDTA Solution 100 ml	Lonza, Basel, Switzerland	CC-5012
CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82051-074
CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82050-856
Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)	B.Braun Melsungen AG, Germany	362 3140