Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cancro

Resumo

Aqui nós descrevemos um protocolo teve como objetivo investigar o impacto do splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de modelos parentais e resistentes in vitro através de RNA-seq e estabeleceu um método baseado qRT-PCR para validar genes candidatos.

Resumo

A resistência aos medicamentos continua a ser um grande problema no tratamento de câncer, tanto para doenças malignas hematológicas e tumores sólidos. resistência intrínseca ou adquirida pode ser causada por uma variedade de mecanismos, incluindo aumento da eliminação da droga, diminuição da absorção da droga, a inactivação de drogas e alterações de alvos de drogas. Dados recentes mostraram que diferente de pelo conhecido genética (mutação, amplificação) e modificações epigenéticas (hipermetilação DNA, histonas pós-translacional modificação), mecanismos de resistência a drogas também pode ser regulada por aberrações splicing. Este é um campo de rápido crescimento de investigação que merece atenção futuro, a fim de planejar abordagens terapêuticas mais eficazes. O protocolo descrito no presente trabalho tem como objetivo investigar o impacto de splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de vários modelos in vitro através de RNA-seq e estabelecerEd um qRT-PCR baseado método para validar os genes candidatos. Em particular, foi avaliada a splicing diferencial da DDX5 e PKM transcrições. O splicing aberrante detectado pela ferramenta computacional PAD foi validado em células leucémicas, que mostra que diferentes variantes de splicing DDX5 são expressos nas células resistentes comparada parental. Nestas células, observaram-se também uma maior proporção PKM2 / PKM1, que não foi detectada na Panc-1 homólogo gemcitabina resistente em comparação com as células parentais Panc-1, sugerindo um mecanismo diferente de resistência à droga-induzida pela exposição a gemcitabina.

Introdução

Apesar dos avanços consideráveis no tratamento do cancro, a resistência de células malignas à quimioterapia, quer intrínseca ou adquirida após exposição prolongada da droga, é a principal razão para o insucesso do tratamento de uma vasta gama de leucemias e tumores sólidos ^1.

Para delinear os mecanismos subjacentes a resistência aos medicamentos, em modelos de linhas celulares in vitro são desenvolvidos por selecção gradual de células cancerosas resistentes a agentes quimioterapêuticos. Este procedimento imita os regimes utilizados nos ambientes clínicos e, portanto, permite a investigação aprofundada dos mecanismos de resistência relevantes. As células resistentes que sobrevivem ao tratamento, em seguida, são distinguidas das células parentais sensíveis usando ensaios de viabilidade celular / citotoxicidade ^2. Nos perfis de resistência a drogas in vitro de células primárias foram mostrados para ser significativamente relacionada com a resposta clínica à quimioterapia ^3.

cytoto de alto rendimentoensaios xicity constituem um método conveniente para determinar a sensibilidade de drogas in vitro. Nisto, a viabilidade das células é avaliada por, por exemplo, o ácido 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazólio - ensaio MTT ^4, o qual é baseado numa conversão metabólica de determinados substratos (isto é, sais de tetrazólio) em produtos coloridos, refletindo assim a atividade mitocondrial das células. Alternativamente, o teor de proteína celular pode ser quantificada utilizando o ensaio de sulforrodamina B (SRB) ^5. Aqui, o número de células viáveis ​​é proporcional à densidade óptica (DO) medida num comprimento de onda apropriado num espectrofotómetro, sem necessidade de extenso e procedimentos de contagem de células demorado. A inibição do crescimento induzida por um determinado fármaco quimioterapêutico pode ser calculado com base no diâmetro externo das cavidades em que as células foram tratadas com um agente de teste e comparado com o OD de células de controlo não tratadas. Uma curva de dose-resposta é obtainada representando graficamente as concentrações de fármaco, em função percentagens de células viáveis ​​em relação às células de controlo. Por fim, a sensibilidade ao fármaco pode ser avaliado como a concentração que resulta em 50% de inibição do crescimento de células, em comparação com células não tratadas _(IC50).

Os mecanismos subjacentes a resistência aos medicamentos incluem muitas anormalidades diferentes, tais como alterações que afectam a expressão do gene de determinantes de atividade de drogas e metabolismo celular. Estas lesões moleculares, incluindo mutações, aberrações em um nível transcricional e pós-transcricional, bem como regulação epigenética perturbado muitas vezes afetam genes envolvidos tanto no metabolismo de drogas ou apoptose ^6.

Alternative splicing de pré-mRNA e sua regulação intrincada recentemente recebeu atenção considerável como uma entidade romance que pode ditar a resistência aos medicamentos de células cancerosas ^7. Até 95% dos genes humanos estão alternativamente, dividida em células normais, por meio da presentebem regulado processo que produz muitas isoformas de proteínas diferentes do mesmo gene. O splicing alternativo é frequentemente desregulado no cancro e vários tumores são caracterizados por splicing alterada de um número cada vez maior de genes envolvidos no metabolismo do fármaco (isto é, desoxicitidina-quinase, folilpoliglutamato-sintetase, ou proteínas de resistência a múltiplas drogas) ^6,8. No entanto, uma análise abrangente de perfis de splicing de células resistentes aos medicamentos é dolorosamente falta. Portanto, é imperativo desenvolver métodos de alto rendimento para a análise de splicing alternativo. Isto poderia ajudar a desenvolver abordagens terapêuticas mais eficazes.

Durante a última década, o rápido desenvolvimento das tecnologias da próxima geração de sequenciamento (NGS) enriqueceu pesquisa biomédica com novos insights sobre os mecanismos moleculares que regulam a regulação da expressão do genoma e seu papel em vários processos biológicos ^9. ARN-sequenciação (ARN-SEQ), é um sub-potente aplicaçãoda NGS no campo da transcriptomics. Isso permite que um perfil de todo o genoma (tanto qualitativa como quantitativamente) dos padrões de milhares de genes simultaneamente expressão e é bem adequada para a caracterização de novos ARNm de codificação, bem como ARN de não codificação de comprimento, miARN, siRNA, e outra de ARN pequeno classes (eg, snRNA e Pirna) ^10,11.

RNA-Seq tem muitas vantagens em relação a tecnologias anteriores para a caracterização do transcriptoma (por exemplo, sequenciação de Sanger e microarranjos de expressão). Ele não se baseia no genoma anotação existente, que tem um nível de um único nucleótido de resolução e tem uma gama dinâmica mais ampla para a estimativa do nível de expressão. Resumidamente, o fluxo de trabalho experimental básico de experiências de ARN-SEQ consiste de transcrição selecção poliadenilado (ARNm) e fragmentação, seguido por conversão em ADNc, construção de biblioteca e sequenciação profunda finalmente, maciçamente paralelo ^12,13. Devido à rápida queda de sequencinCusta G ao longo dos últimos anos, o RNA-seq está gradualmente substituindo outras tecnologias e esforços significativos estão sendo feitos para melhorar os protocolos de preparação biblioteca. Por exemplo, é agora possível reter a informação de transcritos de ARNm de cadeia por marcação do segundo filamento de cDNA com o trifosfato de desoxiuridina (dUTP) e, antes da amplificação por PCR, digestão da cadeia marcada com uracilo-ADN-glycosilase (UDG). Este processo aumenta a precisão da estimativa de anotação do gene e dos níveis de expressão de ^14,15.

A análise e interpretação dos dados de RNA-seq exigem pacotes de software computacional complexas e poderosas e transformação no âmbito dos oleodutos de bioinformática ^16,17. Em primeiro lugar, a matéria-lê passam por um controle de qualidade através da remoção de artefatos técnicos e biológicos e descartando (corte) as sequências que não atingem os requisitos de qualidade rigorosos. Subsequentemente as leituras para cada amostra são mapeados para um genoma de referência e indexadosno gene de nível, de nível de exão, ou transcrição de nível, a fim de determinar a abundância de cada categoria. Dependendo da aplicação, os dados refinados são então calculado através de modelos estatísticos para a identificação de expressão alelo-específico, splicing alternativo, fusões de genes e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ^12. Finalmente, a análise diferencial no nível seleccionado (isto é, expressão do gene ou de splicing alternativo) pode ser utilizado para comparar as amostras obtidas em condições diferentes.

análise de splicing diferencial descreve as diferenças no uso local de união entre duas amostras. Um número crescente de pacotes de software dedicados a este fim estão disponíveis com base em diferentes modelos estatísticos, performances e interface de usuário ^18. Entre estes, PAD (análise multivariada de Transcrição emenda) surge como uma ferramenta computacional disponível gratuitamente e precisa com base em um quadro estatístico Bayesian e projetado para detectar difeeventos de splicing rential de ambos os dados de ARN-SEQ finais simples ou emparelhadas. A partir dos arquivos alinhados (.bam), tapetes podem detectar todos os principais tipos de eventos alternativos de splicing (salto de exon, alternativa "local de splicing alternativo, 5 '3 local de união, exons mutuamente exclusivas e retenção de intron - também ver Figura 1).

Em primeiro lugar, os identifica software lê que suportam um determinado evento emenda, para pular exemplo exão, e classifica-os em dois tipos. "Inclusão lê" (para o evento emenda canônica) mapear dentro do exão investigado e abrangem as junções entre que exão específico e os dois exons que ladeiam a montante ea jusante. "Skipping lê" (para o evento de união alternativa) abrangem a junção entre os dois exons flanqueando. Posteriormente, MATS retorna o nível de inclusão normalizado para ambos os eventos canônicas e alternativos e compara valores entre amostras ou condições. Em última análise, ele calcula P-valor umnd taxa de descoberta de falsas (FDR), assumindo que a diferença na proporção variante de um gene entre duas condições exceder um limite definido pelo usuário dada para cada evento splicing ^19,34.

Após a análise de splicing diferencial em conjunto com ARN-SEQ, uma extensa validação experimental é garantido de modo a identificar genes candidatos verdadeiro-positivo ^18. Quantitativa reversa-reacção em cadeia da polimerase transcrito (qRT-PCR) é o método mais vulgarmente usado e óptimo em validação de candidatos obtidos a partir de análise de RNA-Seq ^20. O objetivo deste trabalho é fornecer uma metodologia sólida para investigar os perfis de emenda relacionados com resistência a drogas em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. A nossa abordagem utiliza ARN-SEQ-base de perfis transcriptoma de modelos de linhas celulares seleccionadas de cancros resistentes a fármacos em combinação com um método de qRT-PCR estabelecido para a validação de genes candidatos envolvidos na resistência à droga.

Os modelos de linhas celulares de leucemia humana usadas neste estudo incluiu-células T pediátrica leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) linha celular CCRF-CEM (CEM-WT), a dois de glucocorticóides (GC) -resistente subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) e CEM-C7R5 (CEM-R5) ^21,22 e o metotrexato (MTX) sub-linha resistente à CEM / R30dm ^23. Embora as terapias actuais com base em GC e MTX estabelecer benefício clínico em cerca de 90% dos casos, o surgimento de GC-resistência ainda representa um problema não resolvido com um mecanismo molecular claro. Para isolar clones de sub-GC-resistentes, células CEM-wt foram cultivadas em 1 uM de dexametasona (Dex) durante 2 a 3 semanas. sublinha resistente-MTX CEM / R30dm foi desenvolvido por meio de curto prazo repetido (24 h) a exposição de células CEM-WT a 30 mM MTX como um imitador de protocolos clínicos. Curiosamente, esta linha celular também exibida resistência cruzada a Dex (resultados não publicados) para que o mecanismo não é completamente compreendido.

O tum sólidaou modelo investigado no presente estudo é o adenocarcinoma ductal pancreático, notório por sua extraordinária refractoriness à quimioterapia. Para este fim, foram selecionados linha Panc-1 de células e a sua sub-clone de gemcitabina-resistente Panc-1R obtido por incubação com 1 uM contínua do fármaco ^24. Aqui nós descrevemos uma abordagem para descobrir novos mecanismos subjacentes in-vitro resistência aos medicamentos através da combinação de três protocolos: ensaios de citotoxicidade colorimétricos para avaliar a sensibilidade de drogas em células leucêmicas e células cancerosas de tumores sólidos, gasoduto RNA-seq-base para identificar novas variantes de emenda relacionadas com sensibilidade ao fármaco / resistência e RT-PCR e análise de qRT-PCR para validar os potenciais candidatos.

Protocolo

1. Caracterização de Perfis de resistência a medicamentos através de Citotoxicidade

1. Cultura Linha de células leucémicas
   1. Manter a célula T parental toda a linha celular CCRF-CEM (CEM-WT), bem como as suas sublinhas resistentes a drogas, incluindo a CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3, em 25 ^cm2 em meio de 10 ml de RPMI-1640 contendo 2,3 uM de ácido fólico suplementado com 10% de soro fetal de vitelo e 100 unidades / ml de penicilina G e 100 ug / ml de estreptomicina.
   2. Cultura das células numa atmosfera humidificada a 37 ° C em uma incubadora de CO ₂ a 5%.
   3. Permitir o crescimento de células para concentrações entre 2-3 x 10 ⁶ células / ml.
   4. Dividir as células duas vezes por semana a uma concentração inicial de 0,3 x 10 ⁶ culas / ml (por exemplo, se a concentração de células é de 3 X 10 ⁶ células / ml, transferir a suspensão de células de 1 ml de um novo frasco contendo 9 ml de meio fresco). Descartar a cultura depois de 20 passagens consecutivas.
2. Cultura Linha pâncreas Carcinoma
   NOTA: Manter a linha de células de carcinoma pancreático humano Panc-1 em 75 cm ² frascos de cultura em 10 ml de meio DMEM com elevado teor de glucose e de L-glutamina, suplementado com 10% de soro bovino fetal e 100 unidades / ml de penicilina G e 100 ug / ml de estreptomicina . A variante resistente a fármacos, Panc-1R, é cultivada no mesmo meio de cultura contendo 1 uM de gemcitabina dissolvidos em água estéril. Mais detalhes são fornecidos em ^24.
   1. Cultura das células a 37 ° C em uma incubadora de CO ₂ a 5%.
   2. Dividir as células a cada 2 - 3 dias a uma razão de 1: 5, quando as células atingem a confluência de cerca de 90%.
   3. Para dividir as células, lava-se a duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), adicionar 1 ml de tripsina / EDTA por 75 centímetros ² balão de cultura e incuba-se a 37 ° C durante 3 min.
   4. Adicionar 9 ml de meio e colheita das células destacadas em um tubo de 15 ml. Semente de suspensão de células de 2 ml em um balão de novo Containing 8 ml de meio. Descartar a cultura depois de 20 passagens consecutivas.
3. Ensaio MTT para células leucémicas
   1. Prepara-se previamente a solução de MTT: dissolver 500 mg de MTT em formazano de 10 ml de PBS e de agitação (protegido da luz), com um agitador magnético durante cerca de 1 h. Esterilizar a solução com um filtro de 0,22 um. NOTA: A solução pode ser armazenada em alíquotas de 10 ml a -20 ° C. Proteger da luz direta após o descongelamento.
   2. Prepara-se previamente o isopropanol acidificada: adicionar 50 ml de HCl 2 M a 2,5 L de isopropanol. NOTA: Guarde a solução para pelo menos um mês à temperatura ambiente antes do uso. Se o isopropanol não é acidificada corretamente, ele pode formar precipitados com o meio e comprometer a leitura espectrofotométrica.
   3. Prepara-se uma 96 poços de fundo plano separado "Dia 0" (controlo) placa para assegurar estimativa mais precisa da inibição do crescimento: 3 a dedicar 6 poços por linha de células, adicionar 30 ul de crescimentomeio e 120 uL de suspensão de células (8000 células) por cada poço e 150 ul de meio de crescimento aos poços correspondentes aos espaços em branco (sem células). Continuar a partir do passo 1.3.9 a 1.3.13 passo desta secção para medir a densidade óptica (OD). NOTA: Mais detalhes são fornecidos em ^4.
   4. Prepare uma placa experimental de 96 poços de fundo plano: dedicar 30 poços para concentrações da droga (10 concentrações, cada uma em triplicado), 10 poços para controlar células e 10 poços para controlar meio sem células (espaços em branco) e preparar uma série de diluições de drogas de dexametasona ( Dex) utilizando dimetilsulfóxido como solvente.
      NOTA: Para as células CEM-WT a gama de diluição Dex é entre 2 mM e 0,97 nM. Para CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3 células a gama de diluição Dex é entre 640 uM e 0,33 nM.
   5. Adicionar 30 ul de cada diluição de Dex num poço apropriado da placa de 96 poços. Certifique-se de incluir cada concentração em triplicado.
   6. Adicionar 30 mL de meio de crescimento para o bems correspondente às células de controlo e de 150 ul de meio de crescimento aos poços correspondentes aos espaços em branco.
   7. Colheita exponencialmente o crescimento de células e ressuspender a sua concentração óptima de semeadura.
      NOTA: De modo a determinar as concentrações de células de partida ideais, recomenda-se para avaliar o perfil de crescimento de cada linha de células de linha celular numa placa de 96 poços por células de sementeira em várias concentrações e medi-la por dia durante pelo menos 4 dias. Escolha uma concentração de semeadura que impede a proliferação de células após 72 horas, pois isso irá influenciar o experimento saturando os valores de DO. Para CEM-WT, CEM-C5 e R5 CEM-sementeira a concentração óptima é de 8.000 células / poço, enquanto que para CEM / R30dm é 5.000 células / poço.
   8. Adicionar 120 ul de suspensão celular a cada uma ou a solução de um fármaco bem contendo ou o meio de crescimento (cavidades que corresponde às células de controlo). Encha as cavidades exteriores vazios, da placa com 150 ul de PBS para garantir uma boa humidade na placa e incubar the as placas durante 72 h a 37 ° C com 5% de CO ₂ num incubador de cultura de células.
   9. Adicionar 15 ul de solução de MTT a cada poço e agitar a placa durante 5 minutos com um agitador de placa, com um máximo de 900 agitações / min.
   10. Colocar as placas de novo a 37 ° C com 5% de CO ₂ num incubador de cultura de células e incuba-se durante mais 4-6 horas.
   11. Adicionar 150 uL de isopropanol acidificado a cada poço e misturar bem com uma pipeta de canais múltiplos para ressuspender completamente todos os cristais de formazano. Comece com os poços em branco e certifique-se de lavar as pontas bem antes de prosseguir para outra linha da placa.
   12. Incubar a placa à temperatura ambiente (TA) durante 10 min.
   13. Utilizando um leitor de microplacas, determinar a densidade óptica a 540 e 720 nm, para garantir uma medição precisa, corrigindo para a OD de fundo. Em seguida, salvar os dados em um arquivo de planilha e analisá-lo ^4.
4. SRB Ensaio para células pancreáticas Carcinoma
   1. Dissolve-se o reagente de SRB em ácido acético a 1% na concentração final de 0,4% (w / v).
   2. Dissolve-se ácido tricloroacético (TCA) em água ultrapura com uma concentração final de 50% (w / v).
   3. Dissolver -aminometano Tris (hidroximetil) em água ultrapura com uma concentração final de 10 mM.
   4. Prepara-se uma placa de 96 poços de fundo controlo "Dia 0" plana separada para assegurar a estimativa mais precisa da inibição do crescimento: as sementes 6 poços com células em crescimento em fase exponencial em 100 meio de ul a uma concentração de sementeira adequado e adicionar 100 forma ul apenas para os poços correspondendo a espaços em branco. Incubar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO ₂ para garantir adesão adequada das células à placa. Em seguida, adicione 100 � de meio a todos os poços e continuar com as etapas 1.4.8 - 1.4.16 desta seção.
   5. Prepara-se uma placa experimental de 96 cavidades de fundo plano: células de sementes de crescimento em fase exponencial em triplicado em placas de 96 poços de fundo plano a uma densidade apropriada em 100 ul de medium usando uma pipeta multicanal.
      NOTA: De modo a determinar as concentrações de células de partida ideais, recomenda-se para avaliar o perfil de crescimento de cada linha de células de linha celular numa placa de 96 poços por células de sementeira em várias concentrações e medi-la por dia durante pelo menos 4 dias. Escolha uma concentração de semeadura que impede a proliferação de células após 72 horas, pois isso irá influenciar o experimento saturando os valores de DO. Para as células Panc-1 e Panc-1R, a concentração óptima é de semeadura 8000 células / poço.
   6. Adicionar 100 ul de meio para médio-só poços e incubar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO ₂ para garantir adesão adequada das células à placa.
   7. Prepara-se uma série de diluições de droga de gemcitabina entre 1 pM e 10 nM para Panc-1 e 1 mM e 100 nM para células Panc-1R. Adiciona-se 100 ul de cada diluição em um poço apropriado da placa de 96 poços utilizando uma pipeta multicanal. Certifique-se de ter cada concentração em triplicado. Além,adiciona-se 100 ul de meio para os médio apenas poços e as células de controlo. Incubar a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 72 h.
   8. Adicionar 25 ul de solução de TCA frio aos poços utilizando uma pipeta multicanal e incubar as placas durante pelo menos 60 min a 4 ° C, a fim de precipitar as proteínas e fixar no fundo dos poços.
   9. Esvaziar a placa removendo o meio brevemente e seco sobre um tecido.
   10. Lavar 5 vezes com água da torneira, em seguida, esvazie o prato e deixe secar à temperatura ambiente.
   11. Adicionar 50 ul de solução de SRB por poço usando uma pipeta de repetição-mancha e durante 15 min à temperatura ambiente.
   12. Esvaziar a placa removendo a mancha SRB.
   13. Lave 4 vezes com ácido acético a 1%, em seguida, esvazie o prato e deixe secar à temperatura ambiente.
   14. Adicionar 150 ul de solução de Tris por poço utilizando uma pipeta multicanal e misturar durante três minutos em um agitador de placa, com um máximo de 900 agitações / min.
   15. Leia a densidade óptica a 540 nm (ou 492 nm no caso de Tele OD valores são muito altos).
   16. Analisar os dados.
5. Análise de dados para ensaios de MTT e SRB
   1. Calcular os valores de DO de células no "Dia 0" usando a seguinte fórmula: OD _{Dia 0 células} = _controlo OD - _{poços branco} DO média
   2. Calcula-se a percentagem de células sobreviventes para cada concentração de fármaco de acordo com a seguinte fórmula:% de células tratadas = Média [OD _{de células tratadas} - _{poços em branco} DO média - _Day OD _0] / _{[células de controlo} OD - _{poços em branco} DO média - OD _Day0] * 100
   3. Traça-se a curva de dose-resposta (concentração de fármaco versus a inibição do crescimento em%).
   4. Calcular a concentração da droga que inibe o crescimento das células em 50% _(IC50) utilizando a curva de dose-resposta.

2. Isolamento de ARN e Biblioteca de Preparação para o ARN-sequenciação

1. amostra CollIsolamento de ARN e exão
   1. Para células CEM: colher 10 ⁶ células directamente a partir do meio de cultura.
   2. Para Panc-1 e Panc-1R: remover o meio, lavar as células duas vezes com PBS e destacam pela adição de tripsina-EDTA e incubado a 37 ° C durante 3 min. Adicionar meio de cultura e colheita 10 ⁶ células.
   3. Centrifugue as amostras a 300 xg durante 3 minutos, remover o sobrenadante e extrai-se mRNA total utilizando colunas de rotação com membrana de sílica disponíveis comercialmente, seguindo o protocolo manufacturer`s.
   4. Determinar a concentração e pureza do ARN total utilizando um espectrofotómetro de UV-Vis.
      NOTA: O ARN é considerada de alta pureza, se a razão de absorvâncias 260 nm / 280 nm é superior a 1,8. As amostras podem ser armazenadas a - 80 ° C.
   5. Avaliar a integridade de ARN total por electroforese de 200 ng de amostra em gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio.
      NOTA: A detecção de duas bandas correspondendo ao mamífero intactas 28S e 18S ARNr a aproximadamente2 kb e 1 kb em tamanho é indicativo de uma boa integridade do ARN total.
2. Sequenciamento Biblioteca Preparação
   1. Use 2 ug de ARNm total por cada amostra. Siga ARNm protocolo biblioteca de preparação de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Determinar a qualidade e a concentração de cada biblioteca por meio de um sistema de Bioanalyzer. Reunir as bibliotecas de uma única amostra até uma concentração final de 10 nmol / L e medi-lo com o Bioanalyzer.
   3. Utilize o sistema de sequenciamento de alto rendimento com Single Leia modo de 100 pb.
      NOTA: Leia comprimento> 80 pb é necessário para a identificação de isoformas de transcrição.

3. Detecção de processamento diferencial de Sequenciamento Lê

1. Alinhamento de Lê para Referência Genoma e de Verificação da Qualidade
   1. Compilar uma anotação gene (arquivo .gtf) da tabela NCBI refGene usando UCSC navegador mesa (25,963 genes).
   2. realizaralinhamento gapped anotação-aware do sequenciamento lê o genoma de referência (GRCh37) usando STAR.
   3. Classificar e indexar os arquivos de alinhamento resultantes com ferramentas de Picard.
   4. Realizar o controle de qualidade de pós-mapeamento usando RSeQC e samtools.
2. Diferencial de Detecção de emenda entre grupos amostrais
   1. Instalar Python e as correspondentes versões do NumPy e SciPy. Baixe e instale samtools. Baixe e instale bowtie e tophat,
   2. Adicione os diretórios Python, gravata borboleta, tophat e samtools à variável de ambiente $ PATH. Download de pré-construídos índices gravata borboleta (hg19). Baixar rMATS versão 3.0.9.
      NOTA: Mais detalhes sobre rMATS são fornecidos em ¹⁹ e ^34.
   3. Detectar eventos de splicing alternativo, comparando cada linha de células resistentes-Dex a CEM-WT e Panc-1 para Panc-1R em MATS separado é executado de acordo com a Figura 5A.
   4. Para detectar eventos de splicing diferenciais de previously sequenciamento alinhados lê (arquivos .bam), Mats executados usando os comandos a partir da Figura 5B para CEM-WT vs. CEM- C3, CEM-WT vs. CEM-R5, CEM-WT vs. CEM / R30dm e Panc1 para Panc- comparações 1R.
      Nota: Tapetes irá criar uma pasta de saída com dois arquivos .txt com resultados por tipo de evento splicing analisados ​​(SE - salto de exon, A5SS - alternativa 5 'local de união, A3SS - alternativa 3' local de união, MEX - exons mutuamente exclusivas e RI - retenção de intron): um arquivo contendo os resultados com base apenas as contagens de junção e um segundo arquivo com resultados baseados em contagens de junção e lê no alvo. Além disso, um ficheiro txt adicional com uma visão geral resultado é gerado na mesma pasta.
   5. Para SE, A5SS, A3SS e importação RI para planilhas os arquivos .txt baseado na contagem de junção e lê no alvo. Para MEX importar os arquivos .txt com base em apenas contagens de junção.
      NOTA: arquivo de saída MATS é classificada por ascendente P-valores e contém vários parâmetros: ID gene, símbolo do gene, Cromossomo ea posição vertente, coordenadas genômicos dos fragmentos de splicing alternativo, conta, bem como o comprimento de inclusão e pular formas para ambas as amostras analisadas, a duração da inclusão e pular formulário utilizado para normalização, p-valor, a taxa de descoberta de falsas (FDR ), nível de inclusão para cada amostra com base nas contagens normalizadas ea pontuação inclusão diferencial (média (IncLevel1) - média (IncLevel2)).
   6. Selecione genes candidatos estatisticamente significativas com um FDR <10% para posterior validação (por exemplo, DDX5 e PKM2).
   7. Visualizar eventos de splicing alternativo com Integrative Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), conforme relatado na Figura 5.

4. validação dos resultados por RT-PCR e qRT-PCR Ensaios

1. projeto Primer
   NOTA: De modo a proporcionar uma validação fiável dos resultados obtidos usando o pipeline de bioinformática, o ARNm transcripts resultantes de eventos de splicing alternativo são amplificados por meio de RT-PCR e visualizados por electroforese em gel de agarose dos produtos de PCR. Cyanine corante verde, como SYBR ensaio qRT-PCR verde é utilizada para quantificar emenda específica variantes em relação a um gene de manutenção. A Figura 7 representa a estratégia utilizada para visualizar o salto caso de o gene DDX5 exão 12 e para quantificar o mutuamente exclusivos exão 9 e o exão 10 do gene de PKM.
   1. Para o ensaio de RT-PCR, os pares projeto iniciador que emparelham com exons constitutivos (exão 10 e exon 13) situados a montante ea jusante dos locais de splicing alternativo (Figura 7A).
      NOTA: O tamanho amplicão deve abranger entre 100 e 800 pb, a fim de assegurar uma separação clara dos produtos de PCR em gel de agarose preditos. A temperatura de emparelhamento dos iniciadores deve ser entre 55 e 65 ° C e o teor de GC não deve exceder 60%.
   2. Ensaio verde cianina (Figura 7B).
      1. Verifique a homologia da sequência dos dois exões que se excluem mutuamente e de criação de dois pares de iniciadores cada um dos quais especifica e exclusivamente detecta apenas uma das duas variantes de splicing.
         NOTA: Para PKM, o iniciador de sentido inverso hibrida com o exão 11 comum a ambas as variantes, enquanto que os iniciadores directos são específicos da variante e emparelham ao exão 9 (PKM1) ou exão 10 (PKM2).
      2. A fim de detectar gene de comprimento completo DDX5, recozer o iniciador inverso dentro do exão ignorados (exão 12).
         NOTA: Para a detecção específica da variante DDX5 ΔEx12, o iniciador inverso abrange o limite exon11 / exon13. Use o mesmo iniciador directo que hibrida com o exão constitutiva 10 para ambas as reações.
         NOTA: O tamanho do fragmento amplificado deve ser entre 80 e 200 pb.
2. A primeira cadeia de síntese de ADNc
   1. Defina-se a transcrição inversa de 1 pg de ARN isolado em ADNc usando 200 U / mL de vírus da Leucemia Murina de Moloney Rever (M-MLV)SE transcriptase no seu tampão de reacção diluiu-se 1: 5 com água estéril. Adicionar DTT a 1 uM, 0,05 ug de hexâmeros aleatórios, mistura de desoxinucleótido (dNTP) 1 mM, e 40 U / ul de inibidor de ribonuclease.
   2. Vortex brevemente e incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 2 h.
   3. Incubar a mistura de reacção a 70 ° C durante 5 min, para inactivar a transcriptase reversa, transferir a mistura em gelo e girar para baixo usando uma microcentrífuga. As amostras podem ser utilizadas imediatamente ou armazenadas a - 20 ° C.
3. A reacção de RT-PCR e do gel de agarose
   1. Defina-se a reacção de PCR num tubo de PCR de cada amostra por mistura de 12,5 ul de 2x concentrado mastermix de PCR, 1,25 ul de 10 mM de iniciadores para a frente e a mesma quantidade para o iniciador inverso até um volume final de 25 ul com água estéril.
   2. Adicionar 1 ml de ADNc, para a mistura e coloque os tubos no termociclador. Executar o programa como se segue: desnaturação inicial: 95 ° C durante 2 min.Reiterar os seguintes passos durante 35 ciclos de: desnaturação a 95 ° C durante 25 seg; hibridação a 52 ° C durante 35 seg; extensão a 72 ° C durante 1 min. Conjunto de extensão final a 72 ° C durante 5 min.
   3. Prepare gel de agarose a 1% por dissolução de 1 g de agarose em 100 ml de 1X tampão TBE. Adicionar 2,5 mL de brometo de etídio para a solução. CUIDADO: O brometo de etídio é cancerígeno, manusear com cuidado usando uma coifa química.
   4. Coloque as amostras e executar o gel em tampão TBE 1x a 100 V durante cerca de 30 minutos num sistema de electroforese.
   5. Revelar o gel com uma câmera UV digital e salvar a imagem.
4. qRT-PCR e análise de dados
   1. Defina-se a verde reacção de PCR Cianina por cada amostra por mistura de 12,5 ul de 2x verde PCR Mastermix, 2 ul de 5 uM de iniciadores para a frente e a mesma quantidade para o iniciador inverso até um volume final de 15 ul com água esterilizada num tubo de PCR . Prepare uma mistura para cada emenda específicavariante a ser detectado (PKM1, PKM2, DDX5 comprimento completo, DDX5 ΔEx12) e para o gene doméstico (GUS).
   2. Carregar o mastermix em uma placa de 96 poços branca e preparar duplicados de cada amostra.
   3. Diluir o cDNA 10x em água, adicionar 5 mL de cada mistura e coloque a placa no termociclador. Executar o programa como se segue: desnaturação inicial: 95 ° C durante 5 min. Reiterar os seguintes passos durante 45 ciclos de: desnaturação a 95 ° C durante 10 seg; hibridação a 58 ° C (para DDX5 e DDX5 ΔEx12 mistura) ou 60 ° C (para PKM1 e mistura PKM2) durante 20 seg. Conjunto de extensão final a 72 ° C durante 20 seg. Definir curva de fusão pela aplicação de um gradiente de 65-97 ° C.
   4. A fim de avaliar a especificidade dos conjuntos de iniciadores para o seu alvo, verificar as curvas de fusão e verificar se um único pico é formada por cada conjunto de iniciadores.
   5. Calcule o segundo valores derivados das curvas de amplificação e exportar os valores de limite de ciclo (CT).
   6. calculate os níveis de expressão relativa (REL) do splicing do mRNA variantes em comparação com a arrumação de GUS (referência) de genes em cada amostra, utilizando a "delta Ct (ΔCt)" método. A fórmula é: REL = 2 ^{- ΔCt,} onde ΔCt = Ct _{alvo variante de processamento} - _{gene de referência} Ct
   7. A fim de quantificar a abundância relativa de variantes de splicing, o cálculo da relação REL por meio da seguinte fórmula: Proporção REL proporção = REL _{variante de splicing 1} / REL _{variante de processamento 2.}

Resultados

Os ensaios de citotoxicidade descritos no protocolo de proporcionar um método fiável e robusto para avaliar a resistência das células cancerosas a agentes quimioterapêuticos in vitro. Por meio do ensaio de MTT, sensibilidade a Dex foi determinada em quatro linhas T-ALL de células, incluindo células CEM-WT parentais @ Dex-sensíveis, e três sub-linhas resistentes à Dex: CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3. Duas faixas de concentração diferentes tinham de ser usados, devido à...

Discussão

Aqui nós descrevemos uma nova abordagem que combina técnicas de rastreio de citotoxicidade bem estabelecidos e poderosos transcriptomic baseado em NGS análises para identificar eventos de splicing diferencial em relação à resistência aos medicamentos. Ensaios espectrofotométricos são métodos de alto rendimento convenientes e robustos para avaliar a sensibilidade de drogas em modelos in vitro de câncer e representam a primeira escolha para muitos laboratórios que realizam exames de citotoxicidade. So...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sulforhodamine B	Sigma-Aldrich	230162
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CRL-1469
DMEM high glucose	Lonza, Basel, Switzerland	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA	11875093
Fetal bovine and calf serum	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	758093
penicillin G streptomycin sulphate	Gibco, Carlsbad, CA, USA	15140122
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Sigma Aldrich	252859
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Netherlands		UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Greiner/Sigma	M0812-100EA
Trypsin/EDTA Solution 100 ml	Lonza, Basel, Switzerland	CC-5012
CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82051-074
CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82050-856
Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)	B.Braun Melsungen AG, Germany	362 3140