En utilisant l&#39;ARN-séquençage pour détecter de nouveaux variants d&#39;épissage associés à la résistance aux médicaments dans<em&gt; In vitro</em&gt; Modèles de cancer

Résumé

Nous décrivons ici un protocole visant à étudier l'impact de l'épissage aberrant sur la résistance aux médicaments dans les tumeurs solides et des cancers hématologiques. Pour cet objectif, nous avons analysé les profils transcriptomiques des modèles parentaux et résistants in vitro par l' ARN-seq et établi une méthode basée qRT-PCR pour valider les gènes candidats.

Résumé

La résistance aux médicaments reste un problème majeur dans le traitement du cancer chez les hémopathies malignes et des tumeurs solides. La résistance intrinsèque ou acquise peut être causée par une série de mécanismes, y compris augmentation de l'élimination de la drogue, une diminution de l'absorption de drogue, inactivation et altérations des cibles médicamenteuses. Des données récentes ont montré que d'autres que par génétique (mutation, amplification) et des modifications épigénétiques bien connu (ADN hypermethylation, modification post-traductionnelle des histones), les mécanismes de résistance aux médicaments peut également être régulée par des aberrations d'épissage. Ceci est un domaine en croissance rapide de l'enquête qui mérite une attention future afin de planifier des approches thérapeutiques plus efficaces. Le protocole décrit dans le présent document vise à étudier l'impact de l'épissage aberrant sur la résistance aux médicaments dans les tumeurs solides et des cancers hématologiques. Pour cet objectif, nous avons analysé les profils transcriptomiques de plusieurs modèles in vitro par l' ARN-seq et d' établired un qRT-PCR méthode basée pour valider les gènes candidats. En particulier, nous avons évalué l'épissage différentiel de DDX5 et PKM transcriptions. L'épissage aberrant détecté par l'outil de calcul MATS a été validée dans des cellules leucémiques, montrant différentes variantes d'épissage DDX5 sont exprimés dans les cellules résistantes au contre parental. Dans ces cellules, nous avons également observé un PKM2 supérieur rapport signal / bruit PKM1 qui n'a pas été détecté dans le Panc-1 homologue gemcitabine résistant par rapport aux cellules parentales Panc-1, ce qui suggère un mécanisme différent de résistance à un médicament induit par l'exposition de la gemcitabine.

Introduction

En dépit des progrès considérables dans le traitement du cancer, de la résistance des cellules cancéreuses à la chimiothérapie, soit intrinsèque ou acquise lors de l' exposition prolongée du médicament, est la principale raison de l' échec du traitement dans un large éventail de leucémies et des tumeurs solides ^1.

Afin de délimiter les mécanismes sous - tendant la résistance aux médicaments, dans les modèles de lignées cellulaires in vitro sont développés par sélection progressive de cellules cancéreuses résistantes aux agents chimiothérapeutiques. Cette procédure imite les régimes utilisés dans les paramètres cliniques et permet donc une enquête approfondie des mécanismes de résistance pertinents. Cellules résistantes qui survivent au traitement sont ensuite distingués des cellules sensibles parentales en utilisant des essais viabilité des cellules / cytotoxicité ^2. Ont été présentés dans les profils de résistance aux médicaments in vitro de cellules primaires significativement lié à la réponse clinique à la chimiothérapie ^3.

Haut-débit cytotodes essais de xicité constituent un procédé commode pour déterminer la sensibilité aux médicaments in vitro. Ici, la viabilité des cellules est évaluée par , par exemple , l'acide 3- [4,5-diméthylthiazol-2-yl] -2,5-diphényl tétrazolium - test MTT ^4, qui est basée sur la conversion métabolique de certains substrats ( à savoir, les sels de tétrazolium) en produits colorés, reflétant ainsi l'activité mitochondriale des cellules. En variante, la teneur en protéine cellulaire peut être quantifiée en utilisant la sulforhodamine B (SRB) Essai ^5. Ici, le nombre de cellules viables est proportionnelle à la densité optique (DO) mesurée à une longueur d'onde appropriée dans un spectrophotomètre, sans avoir besoin de extensif et chronophage les méthodes de comptage des cellules. L'inhibition de la croissance induite par un certain médicament chimiothérapeutique peut être calculé en fonction de la DO des puits dans lesquels les cellules ont été traitées avec un agent de test et comparé avec la DO des cellules témoins non traitées. Une courbe dose-réponse est bénéficier du droitiné en traçant les concentrations de médicament par rapport aux pourcentages de cellules viables par rapport aux cellules témoins. Enfin, la sensibilité aux médicaments peut être rapportée comme étant la concentration qui entraîne 50% d'inhibition de la croissance cellulaire par rapport aux cellules non traitées (CI _50).

Les mécanismes sous-tendant la résistance aux médicaments comprennent de nombreuses anomalies différentes, telles que des modifications qui affectent l'expression des gènes des déterminants de l'activité du médicament et du métabolisme cellulaire. Ces lésions moléculaires, y compris des mutations, des aberrations à une transcription et niveau post-transcriptionnel, ainsi que la régulation épigénétique perturbé affectent souvent les gènes impliqués soit dans le métabolisme des médicaments ou de l' apoptose ^6.

Épissage alternatif pré-ARNm et sa régulation complexe ont récemment reçu une attention considérable en tant qu'entité nouvelle qui peut dicter la résistance aux médicaments des cellules cancéreuses ^7. Jusqu'à 95% des gènes humains sont alternativement épissé dans les cellules normales au moyen de ceprocessus strictement réglementé qui produit beaucoup de différentes isoformes de protéines du même gène. L' épissage alternatif est souvent dérégulée dans le cancer et plusieurs tumeurs sont caractérisées par un épissage modifié d'un nombre croissant de gènes impliqués dans le métabolisme des médicaments (c. -à- désoxycytidine kinase, synthétase folylpolyglutamate, ou des protéines de multirésistance) ^6,8. Cependant, une analyse complète des profils d'épissage de cellules résistantes aux médicaments est cruellement défaut. Par conséquent, il est impératif de développer des méthodes à haut débit pour l'analyse de l'épissage alternatif. Cela pourrait aider à développer des approches thérapeutiques plus efficaces.

Au cours de la dernière décennie, le développement rapide de séquençage de prochaine génération (NGS) technologies a enrichi la recherche biomédicale avec de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires qui régissent la régulation de l' expression du génome et leur rôle dans divers processus biologiques ^9. ARN-séquençage (ARN-seq) est une sous-application puissantede NGS dans le domaine de la transcriptomique. Il permet un profilage du génome entier (qualitativement et quantitativement) des profils d'expression de milliers de gènes simultanément et est bien adapté pour la caractérisation de nouveaux ARNm codant ainsi que de longue ARN non codant, miRNA, siRNA, et d'autres petits ARN classes (par exemple, snARN et Pirna) ^10,11.

ARN-Seq présente de nombreux avantages par rapport aux technologies précédentes pour la caractérisation du transcriptome (par exemple, le séquençage Sanger et microarrays d'expression). Il ne repose pas sur l'annotation du génome existant, il a un niveau de résolution de nucléotide unique et dispose d'une plage dynamique plus large pour l'estimation du niveau d'expression. En bref, le flux de travail expérimental de base des expériences d'ARN-seq se compose de transcription polyadénylé (ARNm) la sélection et la fragmentation, suivie par la conversion en ADNc, la construction de la bibliothèque et le séquençage profond enfin, massivement parallèle ^12,13. En raison de la chute rapide de sequencinles coûts de g au cours des dernières quelques années, l'ARN-seq remplace progressivement d'autres technologies et des efforts importants sont faits pour améliorer les protocoles de préparation de la bibliothèque. Par exemple, il est maintenant possible de conserver les informations de brin de transcrits d'ARNm en marquant le deuxième brin d'ADNc avec désoxyuridine triphosphate (dUTP) et, avant l'amplification par PCR, digérer le brin marqué avec l'uracile-ADN-glycosilase (UDG). Ce processus améliore la précision de l' annotation des gènes et de l' estimation des niveaux d'expression ^14,15.

L'analyse et l' interprétation des données d'ARN-seq nécessitent des paquets et le traitement logiciel de calcul complexes et puissants dans les pipelines bioinformatiques ^16,17. D'abord, la première lit subissent un contrôle de qualité en supprimant les artefacts techniques et biologiques et le rejet (rognage) les séquences qui ne parviennent pas à des exigences de qualité strictes. Par la suite les lectures pour chaque échantillon sont mappés à un génome de référence et indexéesdans le niveau des gènes, niveau exon, ou niveau de transcription, afin de déterminer l'abondance de chaque catégorie. Selon l'application, les données raffinées sont ensuite calculées au moyen de modèles statistiques pour l'identification de l' expression spécifique d'allèle, l' épissage alternatif, des fusions de gènes et des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) ^12. Enfin, l' analyse différentielle au niveau choisi ( par exemple, l' expression du gène ou de l' épissage alternatif) peut être utilisé pour comparer les échantillons obtenus dans différentes conditions.

analyse de l'épissage différentiel décrit les différences dans l'utilisation du site d'épissage entre deux échantillons. Un nombre croissant de logiciels consacrés à cette fin sont disponibles en fonction des différents modèles statistiques, les performances et l' interface utilisateur ^18. Parmi ceux-ci, MATS (multivariée Analyse de la transcription Splicing) apparaît comme un outil de calcul disponible gratuitement et précise basée sur un cadre statistique bayésienne et conçus pour détecter les difféévénements d'épissage rentielles provenant soit des données d'ARN-seq uniques ou jumelés finaux. A partir des (.bam) fichiers alignés, MATS peut détecter tous les principaux types d'événements alternatifs d'épissage (exon de saut, variante 3 'site d'épissage alternatives 5' site d'épissage, exons mutuellement exclusifs et la rétention d'intron - voir aussi la figure 1).

Tout d'abord, le logiciel identifie lit qui supporte un certain événement d'épissage, par exemple le saut d'exon, et les classe en deux types. «L'inclusion lit" (pour l'événement d'épissage canonique) carte dans le exon étudié et couvrent les jonctions entre cette exon spécifique et les deux exons flanquant en amont et en aval. "Skipping lit" (pour l'événement d'épissage alternatif) couvrent la jonction entre les deux exons adjacents. Par la suite, MATS retourne le niveau d'inclusion normalisée pour les deux événements canoniques et alternatives et compare les valeurs entre les échantillons ou les conditions. En fin de compte, il calcule la valeur P ae taux de fausses découvertes (FDR) , en supposant que la différence dans le rapport de la variante d'un gène entre deux conditions dépasse un seuil défini par l' utilisateur donné pour chaque événement d'épissage ^19,34.

Suite à l' analyse de l' épissage différentiel en liaison avec l' ARN-seq, une validation expérimentale approfondie est justifiée afin d'identifier les gènes candidats vrais positifs ^18. Inverse quantitative réaction en chaîne transcrite-polymérase (qRT-PCR) est la méthode la plus couramment utilisée et optimale dans la validation des candidats obtenus à partir de l' ARN-Seq analyse ^20. Le but de ce document est de fournir une méthodologie solide pour étudier les profils d'épissage liés résistance aux médicaments dans les tumeurs solides et des cancers hématologiques. Notre approche utilise à base d'ARN-seq-transcriptome profilage des modèles de lignées cellulaires sélectionnées de cancers résistants aux médicaments en combinaison avec une méthode qRT-PCR établie pour la validation de gènes candidats impliqués dans la résistance aux médicaments.

Les modèles de lignées cellulaires de la leucémie humaine utilisés dans cette étude comprenaient des cellules T pédiatrique leucémie aiguë lymphoblastique (T-ALL) lignée cellulaire CCRF-CEM (CEM-WT), ses deux glucocorticoïdes (GC) -Résistant subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) et CEM-C7R5 (CEM-R5) ^21,22 et le méthotrexate (MTX) -Résistant CEM - lignée / R30dm ^23. Bien que les traitements actuels à base de glucocorticoïdes et MTX établissent un bénéfice clinique dans environ 90% des cas, l'émergence de GC-résistance représente encore un problème non résolu avec un mécanisme moléculaire claire. Pour isoler les sous-clones résistants GC, les cellules CEM-WT ont été cultivées dans 1 uM de dexaméthasone (Dex) pendant 2 à 3 semaines. MTX-lignée résistante CEM / R30dm a été développé grâce à court terme répétées (24 h) de l'exposition des cellules CEM-WT à 30 uM MTX comme un synoptique des protocoles cliniques. Fait intéressant, cette lignée cellulaire a également affiché une résistance croisée à Dex (résultats non publiés) pour laquelle le mécanisme ne soit pas complètement compris.

Le tum solideou le modèle étudié dans la présente étude est l'adénocarcinome canalaire pancréatique, notoire pour son réfractarité extraordinaire à la chimiothérapie. À cette fin, nous avons choisi la ligne Panc-1 cellule et son sous-clone de gemcitabine résistant Panc-1R obtenu par incubation continue avec 1 uM du médicament ^24. Ici , nous décrivons une méthode pour découvrir de nouveaux mécanismes sous - jacents in vitro la résistance aux médicaments en combinant trois protocoles suivants: essais de cytotoxicité colorimétrique pour évaluer la sensibilité aux médicaments dans des cellules leucémiques et des cellules cancéreuses provenant de tumeurs solides, d'un pipeline d'ARN-seq basée pour identifier de nouveaux variants d'épissage liés à drogue sensibilité / résistance et RT-PCR et l'analyse qRT-PCR pour valider les candidats potentiels.

Protocole

1. Caractérisation des drogues Profils de résistance par cytotoxicité

1. Leucémique Culture cellulaire Ligne
   1. Maintenir le T-cellule parentale ALL lignée cellulaire CCRF-CEM (CEM-WT), ainsi que ses lignées résistantes aux médicaments, y compris CEM / R30dm, CEM-R5 et CEM-C3, dans 25 cm ² dans un milieu de 10 ml de RPMI-1640 contenant 2,3 pM d'acide folique supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal et 100 unités / ml de pénicilline G et 100 ug / ml de streptomycine.
   2. La culture des cellules dans une atmosphère humidifiée à 37 ° C dans un incubateur à _CO2 à 5%.
   3. Permettre la croissance des cellules à des concentrations comprises entre 2 - 3 x 10 ⁶ cellules / ml.
   4. Fractionner les cellules deux fois par semaine à une concentration initiale de 0,3 x 10 ⁶ cellules / ml (par exemple, si la concentration cellulaire est de 3 x 10 ⁶ cellules / ml, le transfert de 1 ml de suspension cellulaire dans un nouveau flacon contenant 9 ml de milieu frais). Jeter la culture après 20 passages consécutifs.
2. Ligne du pancréas Carcinome Culture cellulaire
   NOTE: maintenir la lignée de cellules de carcinome pancréatique humain Panc-1 dans 75 cm ² flacons de culture dans 10 ml de milieu DMEM avec teneur élevée en glucose et de L-glutamine supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin et de 100 unités / ml de pénicilline G et 100 ug / ml de streptomycine . La variante résistante aux médicaments, Panc-1R, est cultivée dans le même milieu de culture contenant 1 uM de gemcitabine dissous dans de l'eau stérile. De plus amples détails sont fournis dans ^24.
   1. La culture des cellules à 37 ° C dans un incubateur à _CO2 à 5%.
   2. Fractionner les cellules tous les 2 - 3 jours à un rapport de 1: 5 lorsque les cellules atteignent la confluence d'environ 90%.
   3. Pour diviser les cellules, laver deux fois avec le tampon phosphate salin (PBS), ajouter 1 ml de trypsine / EDTA par 75 cm ² flacon de culture et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
   4. Ajouter 9 ml de milieu et de récolter les cellules isolées dans un tube de 15 ml. Seed 2 ml de suspension cellulaire dans un nouveau flacon containing 8 ml de milieu. Jeter la culture après 20 passages consécutifs.
3. Test MTT pour les cellules leucémiques
   1. Préparez à l'avance la solution de MTT: dissoudre 500 mg de MTT formazan dans 10 ml de PBS et mélanger (protégé de la lumière) avec un agitateur magnétique pendant environ 1 h. Stériliser la solution avec un filtre de 0,22 um. REMARQUE: La solution peut être stockée dans 10 ml d'aliquots à -20 ° C. Protéger de la lumière directe après décongélation.
   2. Préparer à l'avance l'isopropanol acidifié: ajouter 50 ml de HCl 2 et 2,5 litres d'isopropanol. NOTE: Conserver la solution pendant au moins un mois à température ambiante avant utilisation. Si l'isopropanol est pas acidifié correctement, il peut former des précipités avec le milieu et compromettre la lecture spectrophotométrique.
   3. Préparer un 96 puits à fond plat séparé "jour 0" (contrôle) plaque pour assurer une estimation plus précise de l'inhibition de la croissance: consacrer 3 à 6 puits par lignée cellulaire, ajouter 30 pl de croissancemoyen et 120 pl de suspension cellulaire (8.000 cellules) pour chaque puits et 150 pi de milieu de croissance aux puits correspondant aux découpes (pas de cellules). Passez à l'étape 1.3.9 à l'étape 1.3.13 de cette section pour mesurer la densité optique (DO). NOTE: De plus amples détails sont fournis dans ^4.
   4. Préparer une plaque expérimentale de 96 puits à fond plat: consacrer 30 puits à des concentrations de médicament (10 concentrations, chacune en triple), 10 puits pour contrôler les cellules et les 10 puits pour contrôler le milieu sans cellules (blancs) et de préparer une gamme médicament de dilution de la dexaméthasone ( dex) en utilisant diméthylsulfoxyde comme solvant.
      NOTE: Pour les cellules CEM-WT la gamme de dilution Dex est comprise entre 2 uM et 0,97 nM. Pour les cellules CEM / R30dm, CEM-R5 et CEM-C3 la gamme de dilution Dex est comprise entre 640 uM et 0,33 nM.
   5. Ajouter 30 ul de chaque dilution Dex dans un puits approprié de la plaque de 96 puits. Assurez-vous d'inclure chaque concentration dans un triple.
   6. Ajouter 30 ul de milieu de croissance pour le biens correspondant à des cellules témoins et de 150 ul de milieu de croissance aux puits correspondant aux blancs.
   7. Récolte en croissance exponentielle des cellules et resuspendre à la concentration de semis optimale.
      Remarque: Afin de déterminer les concentrations optimales de cellules de départ, il est recommandé d'évaluer le profil de chaque lignée de cellules de la lignée cellulaire dans une plaque à 96 puits croissance par ensemencement des cellules à plusieurs concentrations et en mesurant chaque jour pendant au moins 4 jours. Choisissez une concentration d'ensemencement qui empêche la prolifération de cellules après 72 heures, car cela aura une influence sur l'expérience en saturant les valeurs de DO. Pour CEM-WT, CEM-C5 et CEM-R5 la concentration de semis optimale est de 8.000 cellules / puits, tandis que pour les CEM / R30dm il est de 5000 cellules / puits.
   8. Ajouter 120 pi de suspension cellulaire à chaque puits contenant soit la solution de médicament ou le milieu de croissance (puits correspondant à des cellules témoins). Remplir les puits extérieurs vides de la plaque avec 150 ul de PBS pour assurer un bon taux d'humidité dans la plaque et on incube eplaques e pendant 72 heures à 37 ° C avec 5% de _CO2 dans un incubateur de culture cellulaire.
   9. Ajouter 15 ul de la solution de MTT à chaque puits et agiter la plaque pendant 5 min avec une plaque-agitateur jusqu'à un maximum de 900 secousses / min.
   10. Placer les plaques arrière à 37 ° C avec 5% de _CO2 dans un incubateur de culture de cellules et incuber pendant une autre 4 - 6 heures.
   11. Ajouter 150 pi de l'isopropanol acidifié à chaque puits et bien mélanger avec une pipette multicanaux pour remettre en suspension à fond tous les cristaux de formazan. Commencez par les puits à blanc et assurez-vous de rincer les conseils bien avant de passer à une autre rangée de la plaque.
   12. Incuber la plaque à température ambiante (TA) pendant 10 min.
   13. En utilisant un lecteur de microplaques, déterminer la densité optique à 540 nm et 720 afin d'assurer une mesure précise en corrigeant fond DO. Ensuite , enregistrez les données dans un fichier tableur et analyser ^4.
4. SRB Assay pour les cellules du pancréas Carcinome
   1. Dissoudre le réactif de SRB dans de l'acide acétique à 1% à une concentration finale de 0,4% (p / v).
   2. Dissoudre l'acide trichloroacétique (TCA) dans de l'eau ultra-pure à une concentration finale de 50% (p / v).
   3. Dissoudre du Tris (hydroxyméthyl) -aminométhane dans l'eau ultra-pure à une concentration finale de 10 mM.
   4. Préparer un plat à 96 puits plaque de fond de commande "Jour 0" distinct pour assurer une estimation plus précise de l'inhibition de la croissance: les semences 6 puits avec des cellules en croissance en phase exponentielle dans 100 ul de milieu à une concentration d'ensemencement appropriée et ajouter 100 ul de milieu seul aux puits correspondant à flans. Incuber une nuit à 37 ° C avec 5% de CO ₂ afin d' assurer une bonne adhérence des cellules sur la plaque. Puis ajouter 100 ul de milieu à tous les puits et procéder aux étapes 1.4.8 - 1.4.16 du présent article.
   5. Préparer une plaque expérimentale de 96 puits à fond plat: cellules de semence en phase exponentielle en triple dans 96 puits plaques à fond plat à la densité appropriée dans 100 pi de moidium à l'aide d'une pipette multicanaux.
      Remarque: Afin de déterminer les concentrations optimales de cellules de départ, il est recommandé d'évaluer le profil de chaque lignée de cellules de la lignée cellulaire dans une plaque à 96 puits croissance par ensemencement des cellules à plusieurs concentrations et en mesurant chaque jour pendant au moins 4 jours. Choisissez une concentration d'ensemencement qui empêche la prolifération de cellules après 72 heures, car cela aura une influence sur l'expérience en saturant les valeurs de DO. Pour les cellules PANC-1 et Panc-1R, la concentration optimale d'ensemencement est de 8000 cellules / puits.
   6. Ajouter 100 ul de milieu à moyen-seulement des puits et incuber une nuit à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pour assurer une bonne adhérence des cellules à la plaque.
   7. Préparer une gamme de dilution de médicament gemcitabine entre 1 pM et 10 nM pour Panc-1 et 1 mM, et 100 nM pour les cellules Panc-1R. Ajouter 100 ul de chaque dilution dans un puits approprié de la plaque à 96 puits en utilisant une pipette à canaux multiples. Assurez-vous d'avoir chaque concentration en triple. En outre,ajouter 100 ul de milieu aux moyennes seulement les puits et les cellules témoins. Incuber à 37 ° C avec 5% de _CO2 pendant 72 heures.
   8. Ajouter 25 ul de solution de TCA froid dans les puits en utilisant une pipette multicanaux et on incube les plaques pendant au moins 60 min à 4 ° C afin de précipiter et de fixer les protéines au fond des puits.
   9. Vider la plaque en enlevant brièvement moyen et sec sur un tissu.
   10. Laver 5 fois avec de l'eau du robinet, puis vider la plaque et laisser sécher à la température ambiante.
   11. Ajouter une solution de SRB 50 pi par puits en utilisant une répétition-Pipet et tache pendant 15 min à température ambiante.
   12. Vider la plaque en enlevant la tache de SRB.
   13. Laver 4 fois avec de l'acide acétique à 1%, puis vider la plaque et laisser sécher à la température ambiante.
   14. Ajouter 150 ul solution Tris par puits en utilisant une pipette multicanaux et mélanger pendant 3 min sur une plaque-agitateur jusqu'à un maximum de 900 secousses / min.
   15. Lire la densité optique à 540 nm (ou 492 nm si til OD valeurs sont trop élevées).
   16. Analyser les données.
5. Analyse des données pour les MTT et SRB Assays
   1. Calculer les valeurs de DO des cellules à "jour 0" en utilisant la formule suivante: OD _{Jour 0} = _{cellules de contrôle} de OD - _{puits blancs} DO moyenne
   2. Calculer le pourcentage de cellules survivantes pour chaque concentration de médicament selon la formule suivante:% de cellules traitées = Moyenne [DO _{cellules traitées} - Moyenne des _{puits vides} OD - _Day OD _0] / _{[cellules de contrôle} OD - Moyenne des _{puits vides} DO - DO _Day0] * 100
   3. Tracer la courbe dose-réponse (concentration du médicament par rapport à une inhibition de croissance en%).
   4. Calculer la concentration du médicament qui inhibe la croissance des cellules de 50% _(CI50) en utilisant la courbe dose-réponse.

2. Isolement de l'ARN et préparation de l'ARN bibliothèque de séquençage

1. Coll Sampleection et de l'ARN Isolation
   1. Pour les cellules CEM: récolter 10 ⁶ cellules directement à partir du milieu de culture.
   2. Pour Panc-1 et Panc-1R: éliminer le milieu, laver les cellules deux fois avec du PBS et détachez en ajoutant la trypsine-EDTA et incubation à 37 ° C pendant 3 min. Ajouter milieu de culture et récolte 10 ⁶ cellules.
   3. Isoler des échantillons à 300 xg pendant 3 min, retirer le surnageant et extraire l'ARNm total à l'aide disponibles dans le commerce des colonnes de centrifugation de membrane de silice, en suivant le protocole manufacturer`s.
   4. Déterminer la concentration et la pureté de l'ARN total en utilisant un spectrophotomètre UV-Vis.
      REMARQUE: L'ARN est considéré de pureté élevée si le rapport d'absorbance 260 nm / 280 nm est supérieur à 1,8. Les échantillons peuvent être conservés à - 80 ° C.
   5. Évaluer l'intégrité totale de l'ARN par électrophorèse de 200 ng de l'échantillon sur un gel d'agarose à 1% coloré avec du bromure d'éthidium.
      NOTE: La détection de deux bandes intactes correspondant aux mammifères 28S et 18S ARNr à environ2 kb et 1 kb de taille est indicative d'une bonne intégrité de l'ARN total.
2. Séquençage Bibliothèque Préparation
   1. Utilisez 2 pg d'ARNm total pour chaque échantillon. Suivre le protocole de préparation de l'ARNm de bibliothèque conformément aux instructions du fabricant.
   2. Déterminer la qualité et la concentration de chaque bibliothèque en utilisant un système de bioanalyser. Réunir les bibliothèques dans un seul échantillon jusqu'à une concentration finale de 10 nmol / L et de mesurer avec le Bioanalyseur.
   3. Utiliser un système de séquençage à haut débit avec un seul mode Lecture 100 pb.
      NOTE: Lire longueur> 80 pb est nécessaire pour identifier les isoformes de transcription.

3. Détection de différentiel Splicing de séquençage Lit

1. Alignement des lectures de référence du génome et de Contrôle de la qualité
   1. Compiler une annotation des gènes (fichier .gtf) à partir de la table NCBI refGene utilisant UCSC navigateur table (25,963 gènes).
   2. Effectuerl'alignement des annotations échancré au courant de séquençage indique au génome de référence (GRCh37) en utilisant STAR.
   3. Trier et indexer les fichiers d'alignement résultant des outils PICARD.
   4. Effectuer un contrôle de la qualité post-mapping en utilisant RSeQC et samtools.
2. Épissage différentiel de détection entre les groupes d' exemples
   1. Installez Python et les versions correspondantes de NumPy et SciPy. Téléchargez et installez samtools. Téléchargez et installez bowtie et tophat,
   2. Ajouter les répertoires Python, bowtie, tophat et samtools à la variable d'environnement $ PATH. Télécharger pré-construit des indices de bowtie (de hg19). Télécharger rMATS Version 3.0.9.
      NOTE: D' autres détails sur rMATS sont fournis dans ¹⁹ et ^34.
   3. Détecter des événements d'épissage alternatif , en comparant chaque lignée cellulaire résistante à la Dex-CEM-WT et Panc-1 Panc-1R dans MATS séparé fonctionne selon la figure 5A.
   4. Pour détecter des événements d'épissage différentiels de previoisa nt séquençage aligné lit (fichiers .bam), MATS exécuter en utilisant les commandes de la figure 5B pour CEM-WT vs. CEM- C3, CEM-WT vs. CEM-R5, CEM-WT vs. CEM / R30dm et Panc1 à Panc- comparaisons 1R.
      NOTE: MATS va créer un dossier de sortie avec deux fichiers .txt avec des résultats par type d'événement d'épissage analysé (SE - saut d'exon, A5SS - variante 5 'site d'épissage, A3SS - variante 3' site d'épissage, MEX - exons mutuellement exclusifs et RI - la rétention d'intron): les résultats d'un fichier contenant basé sur des comptages de jonction seulement et un second fichier avec des résultats basés sur les chiffres de jonction et lit sur la cible. En outre, un fichier .txt supplémentaire avec une vue d'ensemble des résultats est généré dans le même dossier.
   5. Pour SE, A5SS, A3SS et RI importation tableurs les fichiers .txt basés sur les comptages de jonction et lit sur la cible. Pour MEX importer les fichiers .txt basés sur les comptages de jonction seulement.
      REMARQUE: le fichier de sortie MATS est triée par ordre croissant P-valeurs et contient plusieurs paramètres: ID du gène, symbole de gène, Le chromosome et la position du brin, coordonnées génomiques des fragments épissage alternatif, compte comme ainsi que la longueur de l'inclusion et de sauter des formulaires pour les deux échantillons analysés, la longueur de l'inclusion et de la forme utilisée pour la normalisation, p-valeur, le taux de fausses découvertes à sauter (FDR ), le niveau d'inclusion pour chaque échantillon sur la base de comptages normalisés et le score d'inclusion différentielle (moyenne (IncLevel1) - moyenne (IncLevel2)).
   6. Sélectionnez les gènes candidats statistiquement significatifs avec un FDR <10% pour une validation supplémentaire (par exemple, DDX5 et PKM2).
   7. Visualisez les événements d'épissage alternatif avec Integrative Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), comme indiqué dans la figure 5.

4. Validation des résultats par RT-PCR et QRT-PCR Assays

1. Conception Primer
   NOTE: Afin de fournir une validation fiable des résultats obtenus en utilisant le pipeline bioinformatique, la trans ARNmcripts résultant d'événements d'épissage alternatif sont amplifiés en utilisant une RT-PCR d'agarose et visualisés par électrophorèse sur gel des produits de PCR. Cyanine colorant vert tels que SYBR test vert qRT-PCR est utilisé pour quantifier épissage spécifique des variants par rapport à un gène de ménage. La figure 7 représente la stratégie appliquée pour visualiser l'exon 12 événement sautant du gène DDX5 et de quantifier l'mutuellement exclusifs exon 9 et l' exon 10 du gène de la PKM.
   1. Pour le dosage par RT-PCR, les paires d'amorces de conception qui hybrident aux exons constitutifs (exon 10 et l' exon 13) situés en amont et en aval des sites d'épissage alternatif (Figure 7A).
      NOTE: La taille de l'amplicon devrait couvrir entre 100 et 800 pb, afin d'assurer une séparation claire des produits de PCR prévus sur gel d'agarose. La température de l'hybridation des amorces doit être comprise entre 55 et 65 ° C et la teneur en GC ne doit pas dépasser 60%.
   2. Cyanine dosage vert (figure 7B).
      1. Vérifier l'homologie de séquence des deux exons mutuellement exclusifs et la conception de deux paires d'amorces dont chacun détecte spécifiquement et exclusivement un seul des deux variants d'épissage.
         NOTE: Pour PKM, l'amorce inverse apparie à l'exon 11 commun aux deux variantes, tandis que les amorces sens sont spécifiques à la variante et recuire à l'exon 9 (PKM1) ou de l'exon 10 (PKM2).
      2. Afin de détecter DDX5 gène pleine longueur, recuire l'amorce inverse au sein de l'exon sautée (exon 12).
         NOTE: Pour la détection spécifique de la variante DDX5 ΔEx12, l'amorce inverse enjambe la frontière exon11 / exon13. Utilisez la même amorce sens qui apparie à exon constitutive 10 pour les deux réactions.
         NOTE: La taille de l'amplicon doit être comprise entre 80 et 200 pb.
2. Premier volet de synthèse d' ADNc
   1. Mettre en place la transcription inverse de 1 pg de l'ARN isolé à l'ADNc en utilisant 200 U / ul de leucémie murine Moloney Virus (M-MLV) revertranscriptase soi dans son tampon de réaction dilué à 1: 5 avec de l'eau stérile. Ajouter du DTT 1 uM, 0,05 pg d'hexamères aléatoires, désoxynucléotides mélange (dNTP), 1 mM et 40 U / ul d'inhibiteur de ribonucléase.
   2. Vortex brièvement et incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 2 heures.
   3. Incuber le mélange réactionnel à 70 ° C pendant 5 min pour inactiver la transcriptase inverse, transférer le mélange sur la glace et tourner vers le bas en utilisant une microcentrifugeuse. Les échantillons peuvent être utilisées immédiatement ou stockées à - 20 ° C.
3. La réaction de RT-PCR et le gel d' agarose
   1. Mettre en place la réaction PCR dans un tube PCR pour chaque échantillon en mélangeant 12,5 ul de 2x concentré mastermix PCR, 1,25 ul de 10 pM amorce sens et le même montant pour l'amorce inverse jusqu'à un volume final de 25 pi avec de l'eau stérile.
   2. Ajouter 1 pi d'ADNc au mélange et placer les tubes dans le thermocycleur. Exécutez le programme comme suit: dénaturation initiale: 95 ° C pendant 2 min.Réitérer les étapes suivantes pendant 35 cycles: dénaturation à 95 ° C pendant 25 sec; recuit à 52 ° C pendant 35 sec; extension à 72 ° C pendant 1 min. Mettre en extension finale à 72 ° C pendant 5 min.
   3. Préparer un gel d'agarose à 1% en dissolvant 1 g d'agarose dans 100 ml de tampon 1X TBE. Ajouter 2,5 ul de bromure d'éthidium à la solution. ATTENTION: Le bromure d'éthidium est cancérigène, manipuler avec précaution en utilisant une hotte chimique.
   4. Charger les échantillons et exécuter le gel dans un tampon TBE 1x à 100 V pendant environ 30 min dans un système d'électrophorèse.
   5. Révéler le gel avec une caméra UV numérique et enregistrer l'image.
4. qRT-PCR et analyse des données
   1. Mettre en place la réaction PCR verte Cyanine par chaque échantillon en mélangeant 12,5 pi de Mastermix vert 2x PCR, 2 pi de 5 pM amorce sens et le même montant pour l'amorce inverse jusqu'à un volume final de 15 pi avec de l'eau stérile dans un tube PCR . Préparer un mélange pour chaque épissure spécifiquevariante à détecter (PKM1, PKM2, DDX5 pleine longueur, DDX5 ΔEx12) et pour le gène de ménage (GUS).
   2. Chargez le mastermix sur une plaque blanche à 96 puits et de préparer des doublons par chaque échantillon.
   3. Diluer l'ADNc 10x dans l'eau, ajouter 5 ul de chaque mélange et placer la plaque dans le thermocycleur. Exécutez le programme comme suit: dénaturation initiale: 95 ° C pendant 5 min. Réitérer les étapes suivantes pendant 45 cycles: dénaturation à 95 ° C pendant 10 secondes; recuit à 58 ° C (pour DDX5 et DDX5 ΔEx12 mélanges) ou 60 ° C (pour PKM1 et PKM2 mélanges) pendant 20 sec. Mettre en extension finale à 72 ° C pendant 20 secondes. Définir la fusion courbe en appliquant un gradient de 65-97 ° C.
   4. Afin d'évaluer la spécificité des jeux d'amorces à leur cible, vérifier les courbes de fusion et vérifiez qu'un seul pic est formé pour chaque jeu d'amorces.
   5. Calculer les deuxièmes valeurs dérivées des courbes d'amplification et d'exporter les valeurs de seuil de cycle (Ct).
   6. Calculate les niveaux d'expression relatifs (REL) de l'épissage d'ARNm variants par rapport à l'entretien ménager GUS (référence) du gène dans chaque échantillon en utilisant le «delta Ct (ACt)" méthode. La formule est: REL = 2 ^{- ACt,} où ACt = Ct _{variant d'épissage cible} - _{gène de référence} Ct
   7. Afin de quantifier l'abondance relative des variants d'épissage, calculer le rapport REL en utilisant la formule: Ratio REL = rapport REL _{variant d'épissage 1} / REL _variant d' _{épissage 2.}

Résultats

Les essais de cytotoxicité décrites dans le protocole fournissent un procédé fiable et robuste pour évaluer la résistance des cellules cancéreuses à des agents chimiothérapeutiques in vitro. Au moyen du test MTT, la sensibilité à la Dex a été déterminée en quatre lignes LAL-T cellulaires, y compris les cellules parentales Dex sensibles CEM-WT, et trois sous-lignées Dex-résistants: CEM / R30dm, CEM-R5 et CEM-C3. Deux gammes de concentrations différentes ont dû ...

Discussion

Nous décrivons ici une nouvelle approche qui combine les techniques de dépistage cytotoxicité bien établis et puissants transcriptomique à base NGS analyses pour identifier les événements d'épissage différentiels par rapport à la résistance aux médicaments. Dosages spectrophotométriques sont des méthodes à haut débit commodes et robustes pour évaluer la sensibilité aux médicaments dans des modèles in vitro du cancer et représentent le premier choix pour de nombreux laboratoires qui effe...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sulforhodamine B	Sigma-Aldrich	230162
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CRL-1469
DMEM high glucose	Lonza, Basel, Switzerland	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA	11875093
Fetal bovine and calf serum	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	758093
penicillin G streptomycin sulphate	Gibco, Carlsbad, CA, USA	15140122
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Sigma Aldrich	252859
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Netherlands		UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Greiner/Sigma	M0812-100EA
Trypsin/EDTA Solution 100 ml	Lonza, Basel, Switzerland	CC-5012
CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82051-074
CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82050-856
Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)	B.Braun Melsungen AG, Germany	362 3140