에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

요약

여기에서 우리는 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열을 통해 부모와 체외에서 저항 모델의 transcriptomic 프로필을 분석 후보 유전자를 확인하기 위해 QRT-PCR 기반의 방법을 설립했다.

초록

약물 내성은 혈액 학적 악성 종양 및 고형 종양 모두 암의 치료에서 주요 문제로 남아있다. 극한 후천적 내성이 증가 된 약제를 포함 제거 메커니즘들에 의해 야기 될 수 있고, 약물 흡수, 불 활성화 약물 및 약물 표적의 변경을 감소시켰다. 최근 데이터는 다른 이상이 잘 알려진 유전자 (돌연변이, 증폭) 및 후생 유전 학적 (DNA 메틸화, 히스톤 번역 후 변형) 개조로, 약제 내성 메커니즘도 스 플라이 싱 수차에 의해 조절 될 수 있음을 보여 주었다. 이것은 더 효과적인 치료 방법을 계획하기 위해 미래의 관심을받을 자격이 조사 빠르게 성장하는 분야입니다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사 대상으로합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열 및 설정을 통해 체외 모델에서 여러 가지의 transcriptomic 프로필을 분석에드 QRT-PCR 기반의 방법은 후보 유전자의 유효성을 검사합니다. 특히, 우리는 DDX5와 PKM 성적 증명서의 차동 스 플라이 싱을 평가 하였다. 계산 도구 매트에 의해 검출 된 비정상적인 스 플라이 싱은 다른 DDX5 스플 라이스 변종은 부모의 대 내성 세포에서 발현되는 것을 보여주는, 백혈병 세포에서 확인되었다. 이러한 세포에서는,도 타빈 노광에 의한 약제 내성의 다른 메커니즘을 제안 부모 Panc-1 세포에 비해 Panc-1 타빈 강한 상대 검출되지 않았다 높은 PKM2 / PKM1 비를 관찰 하였다.

서문

암 치료, 화학 요법에 대한 종양 세포의 내성 중 진성 또는 장기간 약물 노출시 획득 상당한 발전에도 불구하고, 백혈병 및 고형 종양 ¹ 광범위한 치료 실패의 주요 원인이다.

시험관 세포주 모델 약물 내성의 기초가되는 메커니즘을 묘사하기 위해 화학 요법 제에 내성 암세포의 선택에 의해 단계적으로 개발된다. 이 절차는 임상에서 사용 된 체제를 모방하고, 따라서 적절한 저항 메커니즘 깊이 조사를 허용한다. 치료 후에도 내성 세포를 세포 생존력 / 세포 독성 분석 ^(2)를 사용하여 부모 감수성 세포와 구별된다. 일차 세포의 시험 관내 약물 내성 프로파일 화학 요법에 대한 임상 적 반응 ^(3)에 크게 관련이있는 것으로 밝혀졌다.

높은 처리량 cytotoxicity 분석법은 시험관 내에서 약물의 감도를 결정하는 편리한 방법을 구성한다. 여기서, 세포의 생존 능력에 의해 평가되어 예를 들면, 3- [4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일] -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 - 즉 특정 기판의 대사 전환 (에 기초 MTT 분석법 ^4, 따라서 세포의 미토콘드리아 활성을 반영 컬러 제품에 테트라 졸륨 염). 대안 적으로, 세포의 단백질 함량은에 sulforhodamine B (SRB) ^검정을 이용하여 ⁵ 정량화 할 수있다. 여기서, 생존 세포의 수의 필요없이, 분광 광도계에 적합한 파장에서 측정 된 광학 밀도 (OD)에 비례 광범위하고 시간이 걸리는 셀 카운팅 절차. 소정의 화학 요법 약물에 의해 유도되는 성장 억제는 세포가 시험 제제로 처리하고, 처리되지 않은 대조군 세포의 OD와 비교하고있는 웰의 OD에 기초하여 계산 될 수있다. 용량 - 반응 곡선이다 obta세포를 제어 할 상대 생존 세포의 비율에 비해 약물 농도를 플로팅 리트에 의해. 마지막으로, 약물 감수성은 미처리 세포 (IC _50)에 비하여 세포 성장의 50 % 저해를 초래 농도로서보고 될 수있다.

약제 내성의 기초가되는 메카니즘은 약물 활성 및 세포 대사의 결정 인자의 유전자 발현에 영향을 미치는 변경 등 여러 가지 이상을 포함한다. 돌연변이, 수차 전사에서와 전사 후 수준뿐만 아니라 방해 후생 유전 학적 조절을 포함하여이 분자 병변은 종종 약물 대사 또는 세포 사멸 ⁶ 중 관련된 유전자에 영향을 미칩니다.

대체 사전 mRNA의 접합과 복잡한 규제는 최근 암 세포 ^(7)의 약물 내성을 지시 할 수있는 새로운 개체로 주목을 받았다. 인간 유전자의 95 %까지 이러한 대안의 수단에 의해 정상 세포에 접합되고동일한 유전자에서 다양한 단백질 이소 형을 생성 단단히 조절 방법. 대체 접합은 종종 암에 규제가 완화되고, 여러 종양은 약물 대사 (즉, 데 옥시 시티 딘 키나제, folylpolyglutamate 합성, 또는 다제 내성 단백질) ^6,8에 관여하는 유전자의 증가의 변형 접합을 특징으로한다. 그러나, 약제 내성 세포의 접합 프로파일의 포괄적 인 분석을 고통스럽게 부족하다. 따라서, 대안적인 스 플라이 싱 분석을위한 높은 처리량의 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 이것은 더 효과적인 치료 방법을 개발하는 데 도움이 될.

지난 10 년간 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술의 급속한 발전은 유전자 발현의 조절 및 다양한 생물학적 과정 ^(9)에서 자신의 역할을 지배하는 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력과 생물 의학 연구를 강화하고있다. RNA 시퀀싱 (RNA-SEQ)는 강력한 서브 프로그램이고transcriptomics의 분야에서 NGS의. 그것은의 miRNA, siRNA를, 및 기타 소형 RNA를 (정량적)을 동시에 수천 개의 유전자의 발현 패턴의 게놈 전체의 프로파일 링을 허용하고도 새로운 코딩의 mRNA의 특성에 적합 아니라 긴 비 코딩 RNA이다 클래스 (예를 들어, snRNA와 피르) ^{10, 11.}

RNA-SEQ 사체는 특성 (예를 들면, 생거 시퀀싱 및 발현 마이크로 어레이)에 대한 이전의 기술에 비해 많은 장점을 갖는다. 그것은 기존의 게놈 주석에 기초하지 않고, 그 해상도의 단일 뉴클레오티드 레벨을 가지며 그 발현 량 추정을위한 넓은 동적 범위를 갖는다. 간단히, RNA-SEQ 실험의 기본 실험 워크 플로우의 cDNA 라이브러리 건설 그리고 마지막으로, 대규모 병렬 깊은 시퀀싱 ^{(12, 13)로} 변환 한 다음 폴리아 데 닐화 성적 증명서 (mRNA를) 선택과 분열로 구성되어 있습니다. 때문에 sequencin의 급격한 하락지난 몇 년 동안, RNA-SEQ 위에 g 비용이 점차 다른 기술을 대체하고, 상당한 노력은 라이브러리 제조 프로토콜을 향상시키기 위해 이루어지고있다. 예를 들어, 옥시 우리 딘 트리 포스페이트 (dUTP를)하고, 이전의 PCR로 증폭, 우라실-DNA-glycosilase (UDG)로 표시 가닥을 소화와 두 번째 가닥 cDNA를 표시하여 mRNA의 성적 증명서의 가닥 정보를 유지하는 것이 가능하다. 이 프로세스는 발현 ^14,15 유전자 주석 및 추정의 정확도를 향상시킨다.

분석 및 RNA-서열 데이터의 해석은 생물 정보학 파이프 라인 ^{16, 17} 내에서 복잡하고 강력한 계산 소프트웨어 패키지 및 처리가 필요합니다. 우선, 원료는 엄격한 품질 기준에 도달하지 않는 서열을 기술 및 생물 인공물을 제거하고 폐기 (트리밍)에서 품질 관리를 거쳐 판독한다. 이어서,이 기준 게놈 맵핑 및 각 인덱싱 된 샘플 읽기유전자 수준, 엑손 수준, 또는 성적 증명서 수준에 순서대로 각 카테고리의 풍요 로움을 확인합니다. 애플리케이션에 따라, 정제 된 데이터는 대립 유전자 - 특이 적 발현, 대체 접합 유전자 융합체 및 단일 염기 다형성 (SNP가) ^(12)의 식별을위한 통계 모델을 통해 계산된다. 마지막으로, 선택된 레벨 (즉, 유전자 발현 또는 대체 스 플라이 싱) 차등 분석은 다양한 조건 하에서 얻어진 샘플과 비교하기 위해 사용될 수있다.

차동 접합 분석은 두 샘플 사이의 스플 라이스 사이트 사용의 차이를 설명합니다. 이 목적에 전념 소프트웨어 패키지의 증가는 다른 통계 모델, 성능 및 사용자 인터페이스 ^(18)에 따라 사용할 수 있습니다. 이 중, 매트 (성적 증명서 접합의 다변량 분석) 베이지안 통계 프레임 워크를 기반으로 자유롭게 사용할 수 있으며 정확한 계산 도구로 나온다과 diffe를 감지하도록 설계단일 또는 쌍으로 최종 RNA-서열 데이터 중 하나에서 rential 접합 이벤트. 정렬 (.bam) 파일에서 시작, 매트 대체 접합 이벤트의 모든 주요 유형을 검색 할 수 있습니다 (엑손 스키핑, 대안 3 '스플 라이스 사이트, 다른 5'스플 라이스 사이트, 상호 배타적 인 엑손과 인트론 보존 - 또한 그림 1 참조).

첫째, 소프트웨어 식별 인스턴스 엑손 스킵, 특정 스플 라이스 이벤트를 지원하는 판독하고, 두 종류로 분류한다. 조사 된 엑손 내에서지도 및 특정 엑손 두 업스트림 및 다운 스트림 측면 엑손 사이의 접합에 걸쳐 (정식 스플 라이스 이벤트) "에 포함될 읽습니다". 두 측면 엑손 간의 접합부에 걸쳐 (대체 접합 이벤트) "스킵 읽기". 그 후, 매트는 모두 정규 및 대체 이벤트에 대한 정규화 된 포함 수준을 반환하고 샘플 또는 조건 사이의 값을 비교합니다. 궁극적으로는 P-값 a를 계산ND 잘못된 탐색 비율 (FDR)은 두 상태 사이의 유전자 변형 비의 차이는 각각의 스 플라이 싱 ^19,34 이벤트에 대해 주어진 사용자 정의 임계 값을 초과한다고 가정.

RNA-SEQ와 함께 차동 플라이 싱 분석에 따라, 광범위한 실험적인 검증이 참 양성 유전자 후보 ^(18)를 식별하기 위해 보장된다. 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)은 RNA 서열 ^{분석-20에서} 얻은 후보 확인에 가장 일반적으로 사용되는 최적의 방법이다. 본 연구의 목적은 고형 종양과 혈액 악성 종양의 약물 내성 관련 접합 프로파일을 조사 할 수있는 강력한 방법을 제공하는 것이다. 우리의 방법은 약제 내성에 관여 후보 유전자의 확인을 위해 설립 QRT-PCR 방법과 조합하여 약제 내성 암 선택된 세포주 모델 RNA-SEQ 기반 사체 프로파일을 이용한다.

이 연구에 사용 된 인간 백혈병 세포주 모델 소아 T- 세포 급성 림프 모구 백혈병을 포함 (T-ALL) 세포주 CCRF-CEM (CEM-WT), 두개의 글루코 코르티코이드 (GC) 모성 서브 클론 CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) 및 CEM-C7R5 (CEM-R5) ^{(21, 22)와} 메토트렉세이트 (MTX) 모성 서브 라인 CEM / R30dm ^23. GC를하고 MTX에 기초하여 현재 요법의 경우 약 90 %가 임상적인 이점을 수립했지만, GC 저항의 출현은 아직 불분명 분자 메커니즘 미해결 문제를 나타낸다. GC 강한 서브 클론을 분리, CEM-WT 세포는 2 ~ 3 주 동안 1 μM의 덱사메타손 (덱스)에서 배양 하였다. MTX 내성 서브 라인 CEM / R30dm 반복 단기 (24 시간) 임상 프로토콜의 모방으로 30 μM MTX에 CEM-WT 세포의 노출을 통해 개발되었다. 흥미롭게도,이 세포주는 또한기구가 완전히 이해되지 않은 덱스에 교차 내성 (미공개 결과)을 표시.

고체 다치또는 본 연구에서 조사 모델은 화학 요법과의 특별한 불응 악명 췌장 도관 선암이다. 이를 위해 Panc-1 세포주 및 약물 ^(24)의 1 μM 연속 배양에 의해 얻어진 그 타빈 내성 서브 클론 Panc-1R를 선택했다. 여기에서는 세 개의 프로토콜을 결합하여 체외 약물 내성 근본적인 새로운 메커니즘을 발견하는 방법을 설명합니다 비색 독성 분석법에 관련된 신규 스플 라이스 변이체를 식별 백혈병 세포 및 고형 종양, RNA-SEQ 기반 파이프 라인에서 암 세포에 약물 감수성을 평가 약물 감도 / 저항과 RT-PCR 및 QRT-PCR 분석은 잠재적 인 후보의 유효성을 검사합니다.

프로토콜

세포 독성 시험 법을 통해 약물 저항 프로필 1. 특성

1. 백혈병 세포주 배양
   1. 부모의 T 세포를 포함하는 10 ml의 RPMI-1640 배지에서 25cm ² ALL 세포주 CCRF-CEM (CEM-WT)과 CEM / R30dm, CEM-R5와 CEM-C3를 포함한 약제 내성 서브 라인을 유지 2.3 μM 엽산 10 % 소 태아 혈청, 100 유닛 / ㎖ 페니실린 G, 100 μg의 / ml의 스트렙토 마이신이 보충.
   2. 배양을 5 % _CO2 인큐베이터에서 37 ℃로 가습 된 분위기에서 셀.
   3. 3 × 10 ⁶ 세포 / ㎖ - 2 사이의 농도로 세포 성장을 할 수 있습니다.
   4. 0.3 × ¹⁰⁶ 세포 / mL의 초기 농도로 일주일에 두 번 세포를 분할 (예를 들면, 세포 농도는 3 × ¹⁰⁶ 세포 / ㎖, 9 ㎖의에게 새로운 배지를 함유하는 새 플라스크에 전사 1 ml의 세포 현탁액을 경우). 20 연속 구절 후 문화를 폐기하십시오.
2. 췌장 암 세포 라인 문화
   참고 : 10 % 소 태아 혈청, 100 유닛 / ㎖ 페니실린 G, 100 μg의 / ml의 스트렙토 마이신이 보충 된 고 글루코스 및 L- 글루타민 10 mL의 DMEM 배지에서 ^75cm이 배양 플라스크에서 인간 췌장암 세포주 Panc-1을 유지 . 약물 내성 변종 Panc-1R은 멸균 수에 용해하고 1 μM 타빈을 함유하는 동일한 배지에서 배양한다. 더 자세한 사항은 ^(24)에 제공된다.
   1. 배양을 5 % _CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포.
   2. 세포가 약 90 % 합류점에 도달 할 때 5 : 1의 비율로 3 일 - 각 2 셀을 분할.
   3. 세포 분열, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 ^세척이 75cm 배양 플라스크 당 트립신 / EDTA 1 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
   4. 9 ml의 매체를 추가하고 15 ML 튜브에서 분리 된 세포를 수확. 새로운 플라스크의 접점에서 씨앗이 ML의 세포 현탁액ining 8 ml의 매체. 20 연속 구절 후 문화를 폐기하십시오.
3. 백혈병 세포에 대한 MTT 분석
   1. 사전에 MTT 솔루션을 준비 : 약 1 시간 동안 자석 교반기 500 10 ml의 PBS에서 MTT의 포르 마잔 mg의과 (빛으로부터 보호) 저어 녹인다. 0.22 μm의 필터 솔루션을 소독. 주 : 상기 용액을 -20 ℃에서 10 ml의 분취 량으로 저장 될 수있다. 해동 후 직접 빛으로부터 보호합니다.
   2. 사전에 산성화 이소프로판올을 준비 : 이소프로판올 2.5 L 2 M 염산 50 ㎖를 추가합니다. 주 : 사용 전 실온에서 1 개월 이상에 대한 해결책을 보관. 이소프로판올 올바르게 산성화되지 않는 경우, 상기 매체와 석출물을 형성하고, 분광 광도계 판독을 손상 것이다.
   3. 셀 라인 당 3 ~ 6 우물을 바치고 성장의 30 μl를 추가 별도의 96 웰 평평한 바닥 준비 "날 0"(제어) 판은 성장 억제의보다 정확한 추정을 보장하기 위해중간 공백 (NO 세포)에 해당하는 우물에 성장 매체의 각 웰에 150 μL 당 세포 현탁액 (8,000 세포)의 120 μL. 광학 밀도 (OD)를 측정하기 위해이 섹션의 1.3.13 단계로 단계 1.3.9에서 진행합니다. 참고 : 더 자세한 사항은 ⁴ 제공됩니다.
   4. (약물 농도 30 웰 (10 농도, 세중의 각), 세포를 제어하는 ​​10 우물과 세포 (공백)없이 매체를 제어하는 ​​10 우물을 할애하고 덱사메타손의 약물 희석 범위를 제조 : 96 웰 평평한 바닥 실험 판을 준비 용매로서 디메틸 설폭 사이드를 이용하여 덱스).
      주 : CEM-WT 전지용 덱스 희석 범위는 2 μM 및 0.97 nM의 사이이다. CEM / R30dm, CEM-R5와 CEM-C3 세포의 경우 덱스 희석 범위는 640 μM 및 0.33 nm의 사이에있다.
   5. 96 웰 플레이트의 적절한 우물에 각 덱스 희석 30 μl를 추가합니다. 세중의 각 농도를 포함해야합니다.
   6. 성장 매체의 30 μL에 추가 잘세포들과 공백에 대응하는 웰 배양 배지 150 μl를 제어하기 위해 대응.
   7. 수확은 기하 급수적으로 최적의 시딩 농도에서 세포에 resuspend 성장.
      주 : 최적 출발 세포 농도를 결정하기 위하여, 여러 농도의 세포를 파종 및 적어도 4 일 동안 매일 측정하여 96- 웰 플레이트에서 각각의 세포주 세포주의 성장 프로파일을 평가하는 것을 권장한다. 이것은 OD 값을 포화하여 실험 영향 바와 같이, 72 시간 후에 세포의 과증식을 방지 시드 농도를 선택. CEM / R30dm 것이 / 웰의 세포를 5000 동안 CEM-WT, CEM-C5 및 CEM-R5에 대한 최적의 시딩 농도를 8,000 세포 / 웰이다.
   8. 각 웰을 함유하는 약액 있거나, 성장 배지에 세포 현탁액 120 μl를 추가 (웰 세포 제어에 상당). 접시에 좋은 습도를 보장하고 일을 배양 150 μl의 PBS와 함께 접시의 빈 외부 우물을 채우기세포 배양 인큐베이터에서 5 % CO _2와 37 ° C에서 72 시간 동안 전자 판.
   9. 각 웰에 MTT 용액 15 μl를 추가 / 분 900 쉐이크의 최대 판 흔드는 최대 5 분 동안 접시를 흔들.
   10. 세포 배양 인큐베이터에 다시 5 % CO _2와 37 ° C에서 접시를 놓고 다른 4 부화 - 6 시간.
   11. 물론 각각에 산성화 이소프로판올 150 μl를 추가하고 철저하게 모든 포르 마잔 결정을 재현 탁하는 멀티 채널 피펫과 잘 섞는다. 빈 우물 시작하고 잘 접시의 다른 행에 진행하기 전에 팁을 씻어해야합니다.
   12. 10 분 동안 실온 (RT)에서 플레이트를 인큐베이션.
   13. 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 배경 OD를 보정하여 정확한 측정을 보장하기 위해 540 및 720 nm에서의 OD를 결정한다. 그런 다음 스프레드 시트 파일에 데이터를 저장하고 ^4를 분석 할 수 있습니다.
4. SRB 분석 췌장 암 세포에 대한
   1. 0.4 %의 최종 농도 1 % 아세트산에 SRB 시약을 용해 (W / V).
   2. 50 %의 최종 농도로 초순수에 트리클로로 아세트산 (TCA)을 용해시키고 (W / V).
   3. 10 mm의 최종 농도로 초순수에 트리스 (히드 록시 메틸) -aminomethane을 녹인다.
   4. 적절한 시드 농도로 100 ㎕의 매체에 지수 상에 성장하는 세포와 씨앗 (6) 우물 만 우물에 해당하는 100 ㎕의 매체를 추가 성장 억제의보다 정확한 추정을 보장하기 위해 별도의 96 웰 평평한 바닥 "0 일"제어 판을 준비 공백. 플레이트에 세포의 적절한 접착을 보장하기 위해, 5 % CO _2, 37 ℃에서 밤새 인큐베이션. 모든 웰에 100 ㎕의 매체를 추가하고 단계 1.4.8로 진행 -이 절의 1.4.16.
   5. 96 웰 평평한 바닥 실험 판을 준비 : 종자 세포 나 100 ㎕에서 적절한 밀도로 96 웰 중으로 지수 단계에서 평평한 바닥 판을 성장멀티 채널 피펫을 사용하여 dium.
      주 : 최적 출발 세포 농도를 결정하기 위하여, 여러 농도의 세포를 파종 및 적어도 4 일 동안 매일 측정하여 96- 웰 플레이트에서 각각의 세포주 세포주의 성장 프로파일을 평가하는 것을 권장한다. 이것은 OD 값을 포화하여 실험 영향 바와 같이, 72 시간 후에 세포의 과증식을 방지 시드 농도를 선택. Panc-1 및 Panc-1R 세포 최적 시드 농도 / 웰 8000 세포이다.
   6. 중간 단 웰에 100 ㎕의 배지를 첨가하고, 플레이트에 대한 세포의 적절한 접착을 보장하기 위해, 5 % CO _2, 37 ℃에서 밤새 배양한다.
   7. Panc-1 및 1 ㎜ 및 Panc-1R 세포 100 nm의 1 μm의 10 nm의 사이에 젬시 타빈의 약물 희석 범위를 준비합니다. 멀티 채널 피펫을 이용하여 96- 웰 플레이트의 적당한 웰에 희석 각 100 μL를 추가한다. 세중의 각 농도가 있는지 확인하십시오. 게다가,중간 단 우물 대조군 세포에 100 ㎕의 배지를 추가한다. 72 시간 동안 5 % CO _2, 37 ℃에서 인큐베이션.
   8. 석출 웰의 바닥에 단백질을 고정하기 위해서 4 ℃에서 적어도 60 분 동안 플레이트를 멀티 채널 피펫을 사용하여 웰에 25 ㎕의 냉 TCA 용액을 첨가하고 배양한다.
   9. 티슈의 중간 건조 간단히 제거함으로써 접시 비우기.
   10. 수돗물로 5 회 반복 후 접시를 비우고 실온에서 건조 할 수 있습니다.
   11. 실온에서 15 분 동안 반복 - 피펫 및 염색을 사용하여 웰 당 50 μL의 SRB 용액을 추가한다.
   12. SRB 얼룩을 제거하여 판을 비 웁니다.
   13. 1 % 아세트산 4 회 반복 후 접시를 비우고 실온에서이 건조 할 수 있습니다.
   14. 멀티 채널 피펫을 사용하여 웰 당 150 ㎕의 트리스 용액을 추가 / 분 900 쉐이크 최대 판 진탕까지 3 분 동안 혼합한다.
   15. 540 나노 미터 (또는 492 nm의 경우에서 광학 밀도를 읽어 t그는) 값이 너무 높은 OD.
   16. 데이터를 분석 할 수 있습니다.
5. MTT 및 SRB 분석 실험을위한 데이터 분석
   1. 다음 식에 사용 "0 일"에서 세포의 OD 값을 계산 : OD _{주 0} = OD _{제어 셀} - 평균 OD _{빈 우물}
   2. 하기 식에 따라 각 약물 농도에 대한 생존 세포의 비율을 계산한다 : % 처리 한 세포 = 평균 [OD _{처리 된 세포} - 평균 OD _{블랭크 웰} - OD _{주 0]} / [OD _{제어 셀} - 평균 OD _{블랭크 웰} - OD _Day0 * (100)
   3. 투여 량 - 반응 곡선 (%의 성장 억제 대 약물 농도)를 그린다.
   4. 용량 반응 곡선을 사용하여 50 %의 증식 억제 약물 (IC _50)의 농도를 계산한다.

RNA 시퀀싱 2. RNA 분리 및 라이브러리 준비

1. 샘플 콜ection 및 RNA 분리
   1. CEM 세포 : 배양 배지로부터 ¹⁰⁶ 개 세포를 수확.
   2. Panc-1 및 Panc-1R를 들어, 매체를 제거 PBS로 두 번 세포를 씻어 내고 트립신 EDTA를 첨가하고 3 분 동안 37 ℃에서 배양하여 분리. 문화 매체를 추가하고 10 ⁶ 세포를 수확.
   3. 3 분 동안 300 XG에 샘플을 스핀 다운 뜨는을 제거하고 제조자의 프로토콜에 따라, 시판되는 실리카 막 스핀 열을 사용하여 총 mRNA의 압축을 풉니 다.
   4. 자외선 마주 분광 광도계를 사용하여 총 RNA의 농도와 순도를 결정합니다.
      주 : 260 ㎚ / 280 nm의 흡광도 비가 1.8 이상인 경우에는 RNA가 고순도 여겨진다. 80 ° C - 샘플이 저장 될 수있다.
   5. 에티 디움 브로마이드로 염색하여 1 % 아가 로스 겔상에서 샘플을 200 ng의 전기 영동에 의해 총 RNA의 무결성을 평가.
      참고 : 약 포유 동물의 28S와 18S rRNAs에 대응하는 2 개의 그대로 밴드의 검출2킬로바이트 좋은 총 RNA의 무결성을 나타내는 크기 1킬로바이트
2. 시퀀싱 라이브러리 준비
   1. 각 샘플 당 총 mRNA의 2 μg의를 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라 mRNA의 라이브러리 준비 프로토콜을 따르십시오.
   2. bioanalyzer 시스템을 사용하여 각 라이브러리의 품질 및 농도를 결정한다. 10을 nmol / L의 최종 농도로 하나의 샘플까지의 라이브러리를 풀과 bioanalyzer로 측정한다.
   3. 단일 읽기 100 bp의 모드와 높은 처리량 시퀀싱 시스템을 사용합니다.
      참고 :> 80 BP의 읽기 길이가 전사 이성체를 식별하는 것이 필요하다.

차동 접합 3. 감지 시퀀싱 읽고에서

1. 의 정렬 게놈 및 품질 확인을 참조하는 읽기
   1. UCSC 테이블 브라우저 (25963 유전자)를 사용하여 NCBI refGene 테이블에서 유전자 주석 (.gtf 파일)을 컴파일합니다.
   2. 행하다순서의 주석 인식 갭 정렬 STAR를 사용하여 참조 게놈 (GRCh37)을 읽습니다.
   3. 정렬 인덱스 피카 도구 결과 정렬 파일.
   4. RSeQC 및 samtools를 사용하여 포스트 매핑 품질 제어를 수행한다.
2. 샘플 그룹 간의 차동 접합 검출
   1. 파이썬과 NumPy와 및 SciPy의 해당 버전을 설치합니다. 다운로드 samtools를 설치합니다. 다운로드 나비 넥타이와 tophat를 설치,
   2. 는 $ PATH 환경 변수에 파이썬, 나비 넥타이, tophat 및 samtools 디렉토리를 추가합니다. 다운로드 사전 구축 된 나비 넥타이 인덱스 (hg19). rMATS 버전 3.0.9을 다운로드합니다.
      참고 : rMATS에 대한 더 자세한 사항은 ⁽¹⁹⁾ 및 ^(34)에 제공됩니다.
   3. 도 5a에 따라 실행됩니다 별도의 매트에 Panc-1R에 CEM-WT 및 Panc-1에 대한 각 덱스 내성 세포주를 비교하여 대안 접합 이벤트를 감지합니다.
   4. previo에서 차동 접합 이벤트를 검색하려면usly 정렬 순서는 (.bam 파일), Panc-하는 CEM-WT 대 CEM- C3, CEM-WT 대 CEM-R5, CEM-WT 대 CEM / R30dm 및 Panc1 그림 5B에서 명령을 사용하여 실행 매트를 읽고 1R 비교.
      참고 : 매트 분석 접합 이벤트의 유형에 따라 결과이 .txt 인 파일을 출력 폴더를 생성합니다 (SE - 엑손 스키핑, A5SS - 대체 5 '스플 라이스 사이트, A3SS - 대안 3'스플 라이스 사이트, MEX - 상호 배타적 인 엑손 및 RI - 인트론 유지) : 하나의 파일이 포함 접합 카운트 만 접합 카운트에 따라 결과가 두 번째 파일을 기반으로 결과와 목표에 읽습니다. 또한, 결과의 개요를 추가가 .txt 파일이 동일 폴더에 생성된다.
   5. SE, A5SS, A3SS 및 RI 가져 오기 접합 카운트에 따라이 .txt 파일을 스프레드 시트와 목표에 읽하기 위해. MEX를 들어 접합 카운트 만에 기초하여이 .txt 파일을 가져옵니다.
      참고 : 유전자 ID, 유전자 기호 : 매트 출력 파일이 P-값을 오름차순으로 정렬됩니다 몇 가지 매개 변수를 포함염색체와 가닥 위치는 선택적으로 접합 조각의 게놈 좌표는, 포함의 길이뿐만 아니라 계산과 (모두 분석 시료의 형태, 포함의 길이를 건너 뛰는 및 표준화, p 값이 거짓 검색 속도에 사용되는 양식을 건너 뛰는 FDR ), 정규화 수와 차동 포함 점수 (평균 (IncLevel1)에 따라 각 샘플의 포함 수준 - 평균 (IncLevel2)).
   6. FDR <더 검증 (예를 들어, DDX5 및 PKM2) 10 %로 통계적으로 유의 한 후보 유전자를 선택합니다.
   7. 통합적인 유전체학 뷰어 대체 접합 이벤트를 시각화 (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), 그림 5에보고.

RT-PCR 및 QRT-PCR 분석 실험에 의한 결과 4. 검증

1. 프라이머 디자인
   주 : 생물 정보학 파이프, mRNA의 트랜스를 사용하여 얻어진 결과의 신뢰성있는 검증을 제공하기 위해서대안적인 스 플라이 싱 이벤트로 인한 cripts는 RT-PCR을 이용하여 증폭 된 PCR 산물의 아가로 스겔 전기 영동에 의해 가시화된다. 녹색 QRT-PCR 분석은 특정 스플 라이스를 정량화하는 데 사용되는 등 SYBR로 시아닌 녹색 염료는 하우스 키핑 유전자에 대해 변형. 도 7은 DDX5 유전자의 엑손 12 스킵 이벤트 시각화 및 PKM 유전자의 상호 배타적 인 엑손 9 엑손 10 정량화인가 전략을 도시한다.
   1. RT-PCR 분석을 위해, 상류에있는 구성 적 엑손 (엑손 (10)과 엑손 13)와 하류 대체 접합 부위 (그림 7A)에있는 어닐링 디자인 프라이머 쌍.
      주 : 앰플 리콘 크기가 아가 로스 겔에 예측 된 PCR 산물의 명확한 분리를 보장하기 위해 100 내지 800 염기쌍을 포함한다. 60 %를 초과하지 않아야 C와 GC 함량이 55 ° 내지 65의 프라이머 어닐링 온도가되어야한다.
   2. 시아닌 그린 분석 (그림 7B).
      1. 두 개의 상호 배타적 인 엑손과 각각 특별히 디자인 두 프라이머 쌍의 서열 상 동성을 확인만으로 만이 스플 라이스 변이체들 중 하나를 검출한다.
         참고 : 앞으로 프라이머 변형 별 및 어닐링 9 (PKM1를) 엑손하거나 엑손 10 (PKM2) 동안 PKM를 들어, 역방향 프라이머는 두 변종에 공통 11 엑손에 어닐링.
      2. DDX5 전장 유전자를 검출하기 위해 상기 스킵 된 엑손 (엑손 12) 내의 역방향 프라이머 어닐링.
         참고 : DDX5 ΔEx12 변형의 구체적인 검출을 위해, 역방향 프라이머는 exon11 / exon13 경계에 걸쳐있다. 모두 반응에 구성 적 엑손 (10)에 어닐링 같은 정방향 프라이머를 사용합니다.
         주 : 앰플 리콘 크기는 80, 200 bp의 사이에 있어야한다.
2. 첫 번째 가닥 cDNA를 합성
   1. 200 U 몰 로니 쥐 백혈병 바이러스 / μL (M-MLV) 되돌리기를 사용하여 cDNA를에 고립 된 RNA 1 μg의의 역전사을 설정멸균 수로 5의 반응 완충액에서 셀레늄 효소 1 희석. DTT 1 μM, 랜덤 헥사 0.05 μg의, 데 옥시 뉴클레오티드 믹스 (의 dNTP) 1 ㎜, 및 리보 뉴 클레아 제 억제제의 40 U / μl를 추가합니다.
   2. 소용돌이 간략하고 2 시간 동안 37 ℃에서 반응 혼합물을 배양한다.
   3. 5 분, 역전사 효소를 불 활성화 얼음 믹스를 전송하고 미세 원심 분리를 이용하여 회전 속도가 70 ℃에서 반응 혼합물을 인큐베이션. 샘플은 즉시 사용하거나 저장할 수 있습니다 - 20 ° C.
3. RT-PCR 반응 및 아가 로스 젤
   1. 배 12.5 μL를 혼합함으로써, 각 시료 당 PCR 튜브에 PCR 반응을 집합 PCR의 mastermix 10 μM 정방향 프라이머 및 멸균 수 25 ㎕의 최종 부피까지 역방향 프라이머에 대한 동일한 양의 1.25 μl를 농축시켰다.
   2. 믹스의 cDNA 1 μl를 추가하고 열 순환기에 튜브를 배치합니다. 다음과 같이 프로그램을 실행 : 초기 변성 : 2 분 95 ° C를.35 사이클에 대해 다음 단계를 반복 : 변성을 25 초 동안 95 ° C에서; 35 초 동안 52 ° C에서 어닐링; 1 분 72 ° C에서 확장. 5 분 동안 72 ° C에서 최종 확장을 설정합니다.
   3. TBE 버퍼 1X 100ml에 아가 1g을 용해시켜 1 % 아가 로스 겔을 제조. 이 용액에 에티 디움 브로마이드의 2.5 μl를 추가합니다. 주의 : 에티 디움 브로마이드가 암을 유발하는 화학 물질 흄 후드를 사용하여 취급에주의.
   4. 샘플을로드하고 전기 영동 시스템에서 약 30 분 동안 100 V에서 1X TBE 버퍼에서 젤을 실행합니다.
   5. 디지털 UV 카메라로 젤을 공개하고 이미지를 저장합니다.
4. QRT-PCR 및 데이터 분석
   1. 최대 PCR 튜브에 멸균 수 15 μL의 최종 볼륨 배 녹색 PCR Mastermix의 12.5 μL, 5 μM 정방향 프라이머의 2 μL 및 역방향 프라이머 같은 양을 혼합하여 각 샘플 당 시아닌 녹색 PCR 반응을 설정 . 각각의 특정 스플 라이스의 믹스를 준비변형 (PKM1, PKM2, DDX5 전체 길이, DDX5 ΔEx12)과 하우스 키핑 유전자 (GUS)를 검출한다.
   2. 흰색 96 웰 플레이트에 mastermix을로드하고 각 샘플 당 중복을 준비합니다.
   3. 물에서 cDNA를 10 배 희석 각 믹스 5 μl를 추가하고 열 순환기에 접시를 놓습니다. 다음과 같이 프로그램을 실행 : 초기 변성 : 5 분 95 ° C를. 45 사이클에 대해 다음 단계를 반복 : 변성을 10 초 동안 95 ° C에서; 58 ° (DDX5 및 DDX5 ΔEx12 혼합) C 또는 20 초 (PKM1와 PKM2에 대한 혼합) 60 ° C에서 어닐링. 20 초 동안 72 ° C에서 최종 확장을 설정합니다. 65에서 97 ° C에 그라데이션을 적용하여 곡선을 용융 설정합니다.
   4. 타겟으로 프라이머 세트의 특이성을 평가하기 위해, 용융 곡선을 확인하고 단일 피크 각 프라이머 세트에 따라 형성되어있는 것을 확인.
   5. 증폭 곡선 차 미분 값을 계산하고, 사이클 역치 (CT)을 내보낼.
   6. Calculat전자 mRNA의 스플 라이스의 상대적 발현 수준 (REL)는 "델타 코네티컷 (ΔCT)"방법을 사용하여 각 샘플의 GUS 하우스 키핑 (참조) 유전자에 비해 변형. 수식은 다음과 같습니다 REL = 2 ^{- ΔCT,} ΔCT = 코네티컷 _{대상 스플 라이스 변형} - 코네티컷 _{참조 유전자}
   7. 비율 REL 비 = REL _{스플 라이스 변이체 1} / REL _{스플 라이스 변이체 2,} 스플 라이스 변이체의 상대적인 풍부함을 정량 식을 이용하여 REL 비율을 계산하기 위해.

결과

프로토콜에 기술 된 세포 독성 분석법은 시험관 내에서 화학 요법 제에 암세포의 내성을 평가하기위한 안정적이고 강력한 방법을 제공한다. CEM / R30dm, CEM-R5와 CEM-C3 다음 MTT 분석에 의해, 덱스에 감도는 덱스에 민감한 부모의 CEM-WT 세포를 포함하여 4 개의 T-ALL 세포주, 3 덱스 강한 서브 라인에서 산출 된 것입니다. 및 덱스 내성 세포주 (640 μM - 0.33 ㎚) - 두 개의 다른 ?...

토론

여기에서 우리는 약물 내성과 관련하여 차동 접합 이벤트를 식별하는 분석을 잘 확립 된 세포 독성 스크리닝 기술과 강력한 NGS 기반 transcriptomic을 결합하는 새로운 접근 방식을 설명합니다. 분광 분석은 시험 관내 암 모델에서 약물 민감도를 평가하기 편리하고 강력한 높은 처리량 방법이며, 세포 독성 검사를 수행하는 많은 실험실에 대한 첫 번째 선택을 나타냅니다. 이 방법에 대한 문제 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sulforhodamine B	Sigma-Aldrich	230162
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	251399
CCRF-CEM	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CCL-119
Panc-1	ATCC, Manassas, VA, USA	ATCC CRL-1469
DMEM high glucose	Lonza, Basel, Switzerland	12-604F
RPMI-1640	Gibco, Carlsbad, CA, USA	11875093
Fetal bovine and calf serum	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	758093
penicillin G streptomycin sulphate	Gibco, Carlsbad, CA, USA	15140122
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Sigma Aldrich	252859
MTT formazan	Sigma Aldrich	M2003
Anthos-Elisa-reader 2001	Labtec, Heerhugowaard, Netherlands		UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Greiner/Sigma	M0812-100EA
Trypsin/EDTA Solution 100 ml	Lonza, Basel, Switzerland	CC-5012
CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82051-074
CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	82050-856
Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%)	B.Braun Melsungen AG, Germany	362 3140